阮征李杰劉開武王蓮芳華娟胡小明劉杰，黃海軍，4

（1. 武漢市畜牧獸醫(yī)科學研究所，武漢 430208；2. 武漢市重大動物疫病防控中心，武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學 豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點實驗室&農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；4. 武漢市畜牧獸醫(yī)局，武漢 430023）

PRRS病毒主要受體蛋白CD151和CD163真核表達載體的構建

阮征1，2李杰1劉開武2王蓮芳1華娟1胡小明3劉杰1，3黃海軍1，4

（1. 武漢市畜牧獸醫(yī)科學研究所，武漢 430208；2. 武漢市重大動物疫病防控中心，武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學 豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點實驗室&農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；4. 武漢市畜牧獸醫(yī)局，武漢 430023）

為了進一步研究PRRSV 與細胞受體之間的相互作用機理，通過基因工程方法從PAM 細胞中克隆獲得了CD151和CD163 全長編碼片段，利用Sal I和Kpn I內(nèi)切酶對回收得到的CD151（762 bp）和CD163（3 333 bp）DNA片段進行酶切，構建了pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163真核表達載體。經(jīng)PCR 和酶切鑒定后，分別提取重組質粒進行細胞轉染。熒光顯微鏡下可見單獨轉染CD151和CD163基因或CD151/CD163共轉染的Marc 145細胞表達強烈的綠色熒光，Western blot分析結果進一步證實，CD151和CD163蛋白在轉染后的細胞中獲得超表達。豬CD151和CD163 真核表達載體的成功構建為進一步探索CD151和CD163在PRRSV 感染細胞過程中的協(xié)同作用提供了物質基礎，特別是對深入研究PRRS病毒的入侵及宿主識別具有重要意義。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 CD151分子 CD163分子 真核表達載體 細胞轉染

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬群中流行的重要傳染病之一，病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），

可引起母豬的繁殖障礙（包括流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等）、仔豬成活率急劇下降和育成豬呼吸道疾?。?-3］。PRRSV有嚴格的宿主和細胞嗜性，需要首先與細胞受體結合，通過內(nèi)吞作用進人細胞內(nèi)，在胞內(nèi)完成病毒的脫殼與基因組釋放［4-6］。

目前發(fā)現(xiàn)的PRRSV感染相關受體有唾液酸黏附素、硫酸乙酰肝素、CD163分子、CD151分子和波形蛋白［8-11］。有關研究結果表明PAM細胞表面存在唾液酸黏附素和硫酸乙酰肝素兩種PRRSV相關受體，在PRRSV感染巨噬細胞過程中主要起幫助黏附、內(nèi)化的作用［7］；而在Marc-145細胞中波形蛋白起到PRRSV受體作用；CD151能與PRRSV 3'端非轉錄區(qū)（3'URT）發(fā)生結合，進而導致PRRSV與細胞發(fā)生相互作用進入細胞內(nèi)產(chǎn)生感染。通過轉染使PRRSV非敏感細胞BHK-21表達CD151會使該細胞允許PRRSV的感染，增殖程度高達100倍［8］。CD163為一種SRCR超家族的Hapten Hemoglobin清道夫受體，是130 000的細胞表面糖蛋白，在PRRSV感染巨噬細胞過程中介導病毒在細胞質中的脫衣殼和病毒基因組的釋放［9-11］。

本研究通過構建豬CD151和CD163 真核表達載體，為進一步探索CD151和CD163在PRRSV 感染細胞過程中的協(xié)同作用提供了物質基礎，特別是對深入研究PRRS病毒的入侵及宿主識別具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α由華中農(nóng)業(yè)大學豬遺傳育種與繁殖農(nóng)業(yè)部重點實驗室提供。豬肺泡巨噬細胞（PAM）由華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院胡小明博士惠贈。

限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、DNA marker、DNA Gel Extraction Kit、Plasmid mini preps Kit均購自華美生物工程公司。脂質體2000購自Invitrogen公司。pMD18-T購自TaKaRa公司。載體pIRES2-EGFP購自BD Biosciences Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank報道的豬CD151（NM_001243865.1）和CD163（NM_213976.1）基因序列，以此為模板，利用primer premier 6及Oligo 6軟件進行引物設計（表1）。引物由上海生物工程公司合成。

表1 豬CD151和CD163基因cDNA擴增的引物序列

1.2.2 目的基因的PCR擴增 利用提取的豬PAM細胞總RNA反轉錄為cDNA為模板，表1中的CDS全長引物進行PCR擴增。采用KOD DNA聚合酶，PCR反應體系為50 μL體系，其中包括ddH2O 10 μL，dNTPs 8 μL（濃度為10 mmol/L），2×Buffer 25 μL，cDNA模板4 μL，上下游引物分別添加1 μL KOD DNA聚合酶1 μL。PCR反應程序：94℃預變性2 min；98℃變性10 s，退火30 s，68℃延伸 40 s，35個循環(huán)。PCR反應結束后，取10 μL PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳，利用G-BOX凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.2.3 目的片段的回收、酶切和純化 按照DNA膠回收試劑盒（Axygen，USA）說明書操作程序回收目的DNA。利用Sal I和Kpn I內(nèi)切酶對回收得到的CD151（762 bp） 和CD163（3 333 bp）DNA片段進行雙酶切（20 μL體系）：1.5T 3 μL，BSA 2 μL，DNA 14 μL，Sal I 0.5 μL，Kpn I 0.5 μL。在37℃恒溫箱中酶切5 h之后，再用DNA回收試劑盒進行純化，純化得到的產(chǎn)物可用于下一步的連接。

1.2.4 載體酶切、回收和連接 利用Sal I和Kpn I內(nèi)切酶對空載體pIRES2-EGFP進行雙酶切，酶切體系（20 μL）如下：體系：ddH2O 10 μL，1.5T 3 μL，BSA 2 μL，DNA 4 μL（2 μg），Sal I 0.5 μL，Kpn I 0.5 μL。酶切之后，利用膠回收試劑盒對目的片段進行回收。最后將得到的線性載體與目的基因DNA進行連接（20 μL）：ddH2O 9 μL，buffer 2 μL，DNA 6 μL（0.3 pmol），Vector 2 μL（0.03 pmol），T4 ligase 1 μL。在4℃連接反應過夜。

1.2.5 連接產(chǎn)物轉化DH5α 無菌條件下，在100 μL的感受態(tài)細胞中加入10 μL連接產(chǎn)物，混勻后冰

浴30 min。然后42℃水浴熱擊90 s，迅速冰浴1-2 min。每管加400 μL LB培養(yǎng)基，37℃復蘇60 min。5 000 r/min離心6 min，棄上清400 μL，剩余的涂布至含100 μg/mL Kan的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12-16 h至單菌落出現(xiàn)。

1.2.6 PCR檢測陽性菌 挑取平板上的單菌落于3 mL（含100 μg/mL的Amp）LB培養(yǎng)基中，37℃300 r/min振搖培養(yǎng)過夜。取1 μL菌液作模板進行PCR檢測。檢測陽性后送武漢擎科測序公司進行測序。測序結果與GenBank序列一致的菌液可以直接擴大培養(yǎng)，提取去內(nèi)毒素質粒。

1.2.7 超純質粒提取 采用Omega公司Endo-free Plasmid Mini Kit II試劑盒提取質粒并將得到的質粒進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對酶切片段進行初步驗證。

1.2.8 細胞轉染及Western blot分析 按照Invitrogen公司脂質體2000的使用說明書，將構建的重組質粒pIRES2-EGFP-CD151、pIRES2-EGFP-CD163轉染到6孔板上處于對數(shù)生長期的Marc 145細胞，無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，并收集細胞提取蛋白進行Western blot分析。

2 結果

2.1 CD151和CD163基因的PCR擴增

利用PCR方法從豬PAM細胞cDNA中擴增CD151和CD163基因，電泳結果表明，擴增產(chǎn)物大小與預期的結果相符，C151為762 bp，CD163為3 333 bp（圖1）。測序結果表明，克隆的CD151和CD163基因片段均含有該基因完整的編碼區(qū)序列，也包含信號肽序列。

圖1 目的基因DNA片段電泳結果

2.2 pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163重組質粒的鑒定

將構建的真核表達質粒用Sal I和Kpn I進行雙酶切，可以分別得到約5.3 kb、762 bp片段和5.3 kb、3 300 bp片段（圖2），進一步證實了陽性重組質粒。測序結果經(jīng)Blast軟件比對分析，上述結果與NCBI公布序列一致（含信號肽編碼區(qū)），表明構建載體成功。

圖2 重組質粒雙酶切結果

2.3 細胞轉染及Western blot分析結果

細胞轉染48 h后在熒光顯微鏡下可以觀察到明亮的綠色熒光表達（圖3）。Western blot結果（圖4）表明，與對照組（未轉染組）相比，穩(wěn)定轉染單一受體蛋白或CD151、CD163共轉染細胞中目的蛋白表達水平均高于未轉染細胞組，共轉染組較單一轉染組同一目的蛋白表達水平略低。

3 討論

PRRSV 侵染靶細胞的先決條件是實現(xiàn)與宿主細胞的吸附，而宿主細胞表面的受體是完成這種吸附過程必不可少的［12，13］。研究發(fā)現(xiàn)，CD151分子無論是在體外還是體內(nèi)都能與PRRSV的3'非編碼區(qū)相結合，猴抗CD151多克隆抗體可以完全阻斷PRRSV對MARC-145細胞的感染［14］。同時，CD15l分子在PRRSV易感細胞（如PAM、MARC-145、MA-104）中廣泛存在，而在BHK、MDBK等不敏感細胞中不表達［14］，說明CDl51在PRRSV體外研究中扮演著重要角色。大量研究表明，豬肺泡巨噬細胞上的CD163分子可以使PRRSV非允許細胞系PK-15獲得感染PRRSV并產(chǎn)生子代病毒粒子的能力。表明

CD163分子不僅可以介導病毒的吸附，還可以介導PRRSV的復制產(chǎn)生子代病毒，是PRRSV感染PAM細胞必不可少的受體分子［15-17］。因此，本研究將CD151和CD163作為研究對象，進行真核表達載體構建。

圖3 細胞轉染

圖4 Western blot 分析結果

在構建載體的過程中采用pIRES2-EGFP雙基因表達載體，該載體帶有的增強型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）編碼基因，是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，其產(chǎn)生的熒光較普通綠色熒光蛋白強35倍［18］，大大增強了其報告基因的敏感度，且熒光強度及穩(wěn)定性強，目前得到廣泛應用。pIRES2-EGFP還含有CMV強啟動子和SV40 poly A加尾信號，前者可增強外源基因的表達，后者可增強mRNA的穩(wěn)定性及轉錄效率。該載體還攜帶新霉素抗性基因，提供了G418篩選的標志，便于轉染細胞的穩(wěn)定篩選。本研究將編碼CD151和CD163的 cDNA插入到表達熒光蛋白的pIRES2-EGFP的多克隆位點處，通過轉化、擴增和單酶切、雙酶切鑒定，成功地構建了含有CD151和CD163目的基因和熒光蛋白報告基因的質粒pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163。它的應用可以使轉染細胞同時表達目的蛋白和綠色熒光蛋白，所以它不僅能導入外源性目的基因，而且可利用熒光蛋白的表達對轉染結果進行直觀、及時地觀察和檢測。

4 結論

本研究成功克隆了 PRRSV 感染細胞過程中的兩個重要的受體CD151和CD163的全長編碼區(qū)域，包含了起始密碼子、終止密碼子和信號肽。信號肽的存在保證了表達產(chǎn)物正常分泌到胞外。在此基礎上構建的豬CD151和CD163基因真核表達載體經(jīng)酶切鑒定、序列分析完全正確，為進一步研究PRRSV兩個最重要的受體 CD163 和CD151在其感染過程中的作用奠定了基礎，有助于了解 PRRSV 侵入的過程，揭示 PRRSV 感染靶細胞的分子機制。

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（責任編輯 李楠）

Construction of Eukaryotic Expression Vector for the CD151 and CD163 Receptor Proteins of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Ruan Zheng1，2Li Jie1Liu Kaiwu2Wang Lianfang1Hua Juan1Hu Xiaoming3Liu Jie1，3Huang Haijun1，4
（1 .Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science，Wuhan 430208；2. Wuhan Animal Disease Prevention and Control Center，Wuhan 430023；3. Key Laboratory of Swine Breeding and Genetics，Ministry of Agriculture & Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics，Breeding and Reproduction（Huazhong Agricultural University），Ministry of Education，Wuhan 430070；4. Wuhan Bureau of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhan 430023）

In order to study the interaction mechanism between the PRRSV and cell receptors, the CD151 and CD163 code fragments were obtained from PAM cells by PCR. These PCR products were digested with Sal I and Kpn I, then inserted into pIRES2-EGFP vectors separately to construct eukaryotic expression plasmid pIRES2 EGFP - CD151 or pIRES2 EGFP - CD163. These vectors were identified by the methods of restriction enzyme digestion, PCR and sequencing. Marc 145 cells transfected with CD151 or CD163 or CD151/CD163 expressed strong green fluorescence, which was further confirmed by western blot. The successful establishment of eukaryotic expression vectors of CD151 and CD163 provides the material foundation for the further exploring the synergistic effect of CD151 and CD163 in the process of PRRSV infection, especially to the further study of PRRS virus invasion and the host identification.

Porcine reproductive and respiratory syndrome CD151 CD163 Eukaryotic expression vector Cell transfection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.032

2014-09-22

國家自然科學基金項目（31201938），武漢市科技局項目（2013020705070350-9，2013020705070350-14），武漢市農(nóng)科院創(chuàng)新項目（CX201309），武漢市農(nóng)科院青年英才項目（YC201101）

阮征，男，學士，高級獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病防控；E-mail：paper2006@sina.cn

黃海軍，男，博士，高級畜牧師，研究方向：動物生物技術與疫病防控；E-mail：hygene@qq.com