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(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

1982年,徐懷恕等通過(guò)對(duì)霍亂弧菌和大腸桿菌存活規(guī)律的觀察,首次提出細(xì)菌“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but non-culturable state,VBNC)”的存在[1]。微生物的VBNC狀態(tài)近年來(lái)受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。至2010年,70多種細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)能進(jìn)入這種狀態(tài)[2]。VBNC狀態(tài)是細(xì)菌的一種特殊存活形式,是指細(xì)菌處于不良環(huán)境條件下,細(xì)胞縮小成球形,用常規(guī)方法培養(yǎng)不能生長(zhǎng)繁殖,但仍然具有代謝活性的一種特殊生理狀態(tài)[3]。進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌存在潛在的致病性,不但具有與正常細(xì)胞類似的抗原成分、毒力因子,還保留了較低的代謝活性[4],且經(jīng)過(guò)適宜條件下復(fù)蘇后,可以重新獲得感染能力,對(duì)人類以及周圍環(huán)境造成嚴(yán)重威脅[5]。

不同細(xì)菌甚至同一細(xì)菌的不同菌株進(jìn)入VBNC狀態(tài)的條件以及復(fù)蘇條件都不盡相同。溫度、射線、鹽度或滲透壓、寡營(yíng)養(yǎng)、干燥、pH的劇烈變化等可能引起細(xì)菌一系列的生理變化,進(jìn)入VBNC狀態(tài)。而大多數(shù)報(bào)道中,VBNC菌的復(fù)蘇方法主要有:逐步升溫法、與宿主共同培養(yǎng)法、化學(xué)物質(zhì)添加法、富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)法等。

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是一種常見(jiàn)的病原菌,可引起嚴(yán)重感染。其廣泛分布于自然界,因此食品受污染的機(jī)會(huì)很多,常見(jiàn)于奶、肉、蛋、魚(yú)及其制品,另外,剩飯、油煎蛋、涼粉引起的中毒事件也有報(bào)道。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心報(bào)告,由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位,僅次于大腸桿菌。

食源性致病菌是造成食品安全問(wèn)題的首要因素。然而,目前細(xì)菌檢測(cè)基本是利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法,此方法因無(wú)法檢測(cè)出VBNC菌而易造成漏檢現(xiàn)象。因此,VBNC狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)不僅讓人們對(duì)微生物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的生理變化有了新的認(rèn)識(shí),同時(shí)也為流行病學(xué)、食品安全、水質(zhì)監(jiān)測(cè)、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)等許多方面的研究做出了重大貢獻(xiàn)[6]。本文采用低溫和食品防腐劑山梨酸鉀等條件誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌進(jìn)入VBNC狀態(tài),對(duì)其復(fù)蘇條件進(jìn)行研究,為金黃色葡萄球菌VBNC狀態(tài)的研究提供了理論依據(jù),對(duì)加強(qiáng)食品安全的檢測(cè)和控制亦具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓊脂粉、蛋白胨 北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任有限公司;牛肉膏、酵母浸出汁、NaCl 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;吐溫20、吐溫80、山梨酸鉀 東盛生物有限公司;腦心浸液培養(yǎng)基(BHI) 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司;API STAPH生化鑒定試劑盒 法國(guó)生物梅里埃公司;金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 編號(hào)26003,中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心,在4℃條件下保存于7.5% NaCl的牛肉膏蛋白胨斜面上,并接種于斜面中于37℃培養(yǎng)活化。

150A恒溫培養(yǎng)箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;Forma Class A2生物安全柜 Thermo公司;掃描電鏡 德國(guó)TVIPS公司;5417R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的誘導(dǎo) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)菌株的適宜培養(yǎng)條件,選擇對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)不利條件作為誘導(dǎo)VBNC狀態(tài)的候選因素。在考慮溫度、pH、養(yǎng)分、鹽度、山梨酸鉀濃度的基礎(chǔ)上,確定誘導(dǎo)條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用混合均勻設(shè)計(jì)誘導(dǎo)方案,選定對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)入 VBNC狀態(tài)具有重要影響的3個(gè)因素,其中溫度和山梨酸鉀的濃度各取3個(gè)水平,營(yíng)養(yǎng)條件為2個(gè)水平,富營(yíng)養(yǎng)(含7.5% NaCl的肉湯)記為1,寡營(yíng)養(yǎng)(含7.5% NaCl溶液)記為0,實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表 1。

誘導(dǎo)過(guò)程中每隔2d取樣,用平板計(jì)數(shù)記錄菌數(shù)的變化,當(dāng)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)降到0時(shí),再連續(xù)測(cè)定3d可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)仍然為0時(shí),即初步認(rèn)為實(shí)驗(yàn)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。以誘導(dǎo)天數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)誘導(dǎo)方案進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平U6(32×21)Table 1 Experiment factors U6(32×21)

1.2.2 VBNC狀態(tài)金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇 分別采用直接升溫法(升溫至37℃)、添加液體培養(yǎng)基升溫法(含0.5%、7.5% NaCl的肉湯,BHI液體培養(yǎng)基)、添加不同濃度酵母液(0.025%、0.05%、0.1%)的培養(yǎng)基升溫法、添加不同濃度吐溫20或吐溫80(0.25%、0.5%、1%)的培養(yǎng)基升溫法對(duì)VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行復(fù)蘇。每隔24h取合適稀釋度的菌液100μL涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,于37℃培養(yǎng),觀察是否有菌落長(zhǎng)出。繪制VBNC狀態(tài)金黃色葡萄球菌復(fù)蘇生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的形態(tài)觀察 將正常狀態(tài)以及復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌劃線于平板上,進(jìn)行菌落形態(tài)觀察,并對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色觀察和掃描電鏡觀察,描述細(xì)菌個(gè)體形態(tài)特征。

1.2.4 復(fù)蘇后金黃色葡萄球菌的生理生化特性 對(duì)復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌進(jìn)行生理生化特性分析,采用法國(guó)生物梅里埃公司的API STAPH試劑條進(jìn)行。根據(jù)說(shuō)明書(shū)判斷反應(yīng),參照分析圖索引和鑒定軟件可以得出鑒定的結(jié)果。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 利用DPS7.05軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)

2.1.1 不同pH和低溫條件下金黃色葡萄球菌的存活 由圖1可以看到,低溫環(huán)境中,6種pH條件下的金黃色葡萄球菌隨著處理時(shí)間的增加,其數(shù)量都呈下降趨勢(shì)。其中pH3.8和pH4.4的曲線下降最快,經(jīng)過(guò)近3個(gè)月的處理后,細(xì)菌的存活數(shù)量已經(jīng)接近于0,這意味著有可能進(jìn)入VBNC狀態(tài)。而其他pH下,菌數(shù)下降到一定程度后,仍有一定的活菌。

圖1 金黃色葡萄球菌在不同pH條件下4℃中的存活曲線 Fig.1 Survival curves of S. aureus under 4℃ at different pH

2.1.2 金黃色葡萄球菌在山梨酸鉀溶液中的存活 圖2顯示金黃色葡萄球菌在山梨酸鉀溶液中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的誘導(dǎo),可培養(yǎng)菌的總數(shù)不斷減少。從第16d開(kāi)始,4℃下的金黃色葡萄球菌存活菌數(shù)由原來(lái)最初的2.10×109CFU/mL下降至0,經(jīng)過(guò)再次平板涂布實(shí)驗(yàn)后,確定已無(wú)存活菌,說(shuō)明其可能進(jìn)入VBNC狀態(tài)。而37℃條件下至16d的金黃色葡萄球菌存活菌數(shù)仍維持在2.60×104CFU/mL,未能進(jìn)入VBNC狀態(tài)。

圖2 金黃色葡萄球菌在山梨酸鉀溶液中的存活曲線 Fig.2 Survival curves of S. aureus in potassium sorbate solutions

2.1.3 不同鹽度下金黃色葡萄球菌的存活 從圖3可知,在誘導(dǎo)的過(guò)程中,金黃色葡萄球菌具有一定的耐鹽性,在誘導(dǎo)初始,均受到一定的抑制,但在耐鹽范圍內(nèi)的金黃色葡萄球菌隨后開(kāi)始適應(yīng)環(huán)境,而高鹽度(20%)下金黃色葡萄球菌受到了明顯抑制,但都未能進(jìn)入VBNC狀態(tài)。

圖3 金黃色葡萄球菌在不同鹽度下的存活曲線 Fig.3 Survival curves of S. aureus under different salinity

2.1.4 混合均勻設(shè)計(jì)誘導(dǎo)方案下金黃色葡萄球菌的存活 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),金黃色葡萄球菌可培養(yǎng)數(shù)不斷減少,下降最慢的是10mmol/L山梨酸鉀富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)37℃的誘導(dǎo)方案(誘導(dǎo)方案1),當(dāng)至132d時(shí),可培養(yǎng)菌總數(shù)下降為0;而0.5mmol/L山梨酸鉀、寡營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、-20℃條件下(誘導(dǎo)方案6),誘導(dǎo)時(shí)間最短,為76d;另外4種誘導(dǎo)方案下分別于84、84、85、85d進(jìn)入VBNC狀態(tài),結(jié)果如圖4。不同誘導(dǎo)條件下的誘導(dǎo)天數(shù)見(jiàn)表2。

圖4 不同誘導(dǎo)條件下金黃色葡萄球菌的存活曲線 Fig.4 Survival curves of S. aureus under different induce conditions

利用DPS7.05軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)表2所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析,得回歸方程:

Y=80.7645460+0.14842831047X2+2.9719679350X1×X3+0.4339634295X2×X3

表2 不同誘導(dǎo)條件下的誘導(dǎo)天數(shù)Table 2 The induce period of different induce conditions

2.2 VBNC狀態(tài)金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇

2.2.1 直接升溫復(fù)蘇法 經(jīng)每隔24h取樣37℃培養(yǎng)觀察,發(fā)現(xiàn)直至14d后仍未發(fā)現(xiàn)有菌落生長(zhǎng)。因此,推測(cè)單純采用升溫復(fù)蘇的方法不能使VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌復(fù)蘇。

2.2.2 添加液體培養(yǎng)基升溫復(fù)蘇法 經(jīng)每隔24h取樣37℃培養(yǎng)計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)采用肉湯培養(yǎng)基升溫的方法不能使菌體復(fù)蘇,直至14d后仍未見(jiàn)有菌落長(zhǎng)出。而采用BHI液體培養(yǎng)基升溫復(fù)蘇法培養(yǎng)2d時(shí),取樣涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板可見(jiàn)有大小一致的金黃色葡萄球菌單一菌落,菌數(shù)為102CFU/mL。隨著復(fù)蘇時(shí)間的延長(zhǎng),可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)迅速增加,至 5d時(shí),可培養(yǎng)菌數(shù)約為107CFU/mL。表明BHI液體培養(yǎng)基復(fù)蘇法可使VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌復(fù)蘇。

2.2.3 添加酵母液升溫復(fù)蘇法 經(jīng)每隔24h取樣37℃培養(yǎng)觀察,發(fā)現(xiàn)14d后仍未有菌落生長(zhǎng)。因此推測(cè)添加酵母液升溫的方法不能使VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌復(fù)蘇。

2.2.4 添加吐溫升溫復(fù)蘇法 經(jīng)每隔24h取樣37℃培養(yǎng)觀察,發(fā)現(xiàn)采用0.25%的吐溫20或吐溫80培養(yǎng)液升溫的方法不能使菌體復(fù)蘇,而采用0.5%及1%的吐溫20或吐溫80培養(yǎng)液升溫復(fù)蘇法培養(yǎng)2d時(shí),可培養(yǎng)菌落數(shù)達(dá)到1.0×102CFU/mL,隨著復(fù)蘇時(shí)間的延長(zhǎng),可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)迅速增加,至5d時(shí),可培養(yǎng)菌數(shù)最多達(dá)到1.0×108CFU/mL。吐溫20和吐溫80的濃度越大,菌落數(shù)越多,且相同濃度下吐溫80復(fù)蘇的菌落數(shù)略多于吐溫20。結(jié)果如圖5所示。

表3 復(fù)蘇后及正常狀態(tài)的金黃色葡萄球菌的生理生化檢測(cè)結(jié)果Table 3 The identification results of the resuscitative and normal cells by API STAPH system

圖5 VBNC狀態(tài)金黃色葡萄球菌在吐溫20 及吐溫80培養(yǎng)液中的復(fù)蘇曲線 Fig.5 Resuscitation curves of S. aureus in Tween 20 and Tween-80 solutions

2.3 金黃色葡萄球菌的形態(tài)觀察

在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,正常狀態(tài)的及復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌菌落厚、表面光滑濕潤(rùn)、圓形凸起、邊緣整齊,但正常狀態(tài)的菌落呈黃色,復(fù)蘇后的菌落乳白色,而進(jìn)入VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌無(wú)法長(zhǎng)出菌落。

取正常狀態(tài)、VBNC狀態(tài)及復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌在掃描電鏡下進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)及復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌呈圓球狀(圖6a,圖6b),而進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)胞變成不規(guī)則球形,細(xì)胞體積變小,且菌體分散(圖6c)。

圖6 掃描電鏡下不同狀態(tài)的 金黃色葡萄球菌的形態(tài)特征(×10000) Fig.6 Morphological characteristics of different states of S. aureus

2.4 復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌的生理生化特性

以法國(guó)生物梅里埃公司的API STAPH生化鑒定試劑盒對(duì)復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌進(jìn)行生化鑒定,按照API STAPH生化反應(yīng)表對(duì)反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行判讀和記錄,結(jié)果見(jiàn)表3。將鑒定結(jié)果輸入軟件,得出復(fù)蘇菌株的鑒定百分比為98.1%。復(fù)蘇后的菌株除尿素酶陰性外,其他代謝特征均與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同,因此可推斷VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)復(fù)蘇基本恢復(fù)了正常的代謝過(guò)程。

3 結(jié)論與討論

3.1 金黃色葡萄球菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)

誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的條件較多,其中,低溫、高溫、寡營(yíng)養(yǎng)、重金屬、光照等是主要的影響因素[7]。本研究采用了不同pH、溫度、不同濃度山梨酸鉀以及不同鹽度處理等方法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行誘導(dǎo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫對(duì)誘導(dǎo)影響最大,且溫度越低誘導(dǎo)天數(shù)越短,山梨酸鉀濃度與營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌的誘導(dǎo)起協(xié)同作用。而單一的條件處理,如鹽度,在本實(shí)驗(yàn)中未能成功誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。說(shuō)明金黃色葡萄球菌對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng),需更為不利的環(huán)境才有可能誘導(dǎo)其進(jìn)入狀態(tài)。

3.2 VBNC狀態(tài)金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇

本研究對(duì)菌株的復(fù)蘇采用了直接升溫復(fù)蘇法、添加液體培養(yǎng)基升溫復(fù)蘇法、添加酵母液升溫復(fù)蘇法及添加吐溫的升溫復(fù)蘇法。最后實(shí)現(xiàn)復(fù)蘇的是采用BHI培養(yǎng)基升溫的方法,以及添加0. 5%和1%的吐溫20或吐溫80的培養(yǎng)液升溫方法,由復(fù)蘇曲線顯示,5d后所有復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌均達(dá)到了1.0×106的數(shù)量級(jí)以上,且相同濃度下吐溫80培養(yǎng)液的復(fù)蘇能力優(yōu)于吐溫20。

復(fù)蘇看似簡(jiǎn)單的誘導(dǎo)逆過(guò)程,即將誘導(dǎo)因素去除,復(fù)蘇就可以實(shí)現(xiàn)。然而事實(shí)上,復(fù)蘇是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,同種復(fù)蘇方法對(duì)于不同細(xì)菌乃至同一細(xì)菌的不同菌株的影響都不盡相同。Jiang等[8]發(fā)現(xiàn)進(jìn)入VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌在溫度由3.5℃升高到室溫后,3d內(nèi)就可從活的非可培養(yǎng)狀態(tài)恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)。而魯梅芳等[9]研究指出,逐步升溫法對(duì)于VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌沒(méi)有任何作用。本實(shí)驗(yàn)采用直接升溫復(fù)蘇法、添加肉湯培養(yǎng)基升溫復(fù)蘇法、添加酵母液升溫復(fù)蘇法均沒(méi)有使VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌復(fù)蘇成功,而采用BHI培養(yǎng)基升溫方法,以及添加0.5%、1%的吐溫20及吐溫80培養(yǎng)液升溫的方法,細(xì)菌恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)。Bloomfield等[10]研究推測(cè),由于營(yíng)養(yǎng)缺乏而進(jìn)入VBNC狀態(tài)的微生物,其營(yíng)養(yǎng)機(jī)制與轉(zhuǎn)運(yùn)途徑之間親和力有了極大的提高,當(dāng)重新接種到營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上時(shí),由于過(guò)量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入,基質(zhì)會(huì)迅速氧化導(dǎo)致過(guò)多的自由基和超氧化物的產(chǎn)生,從而損害了細(xì)胞甚至導(dǎo)致其死亡。因此,實(shí)驗(yàn)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如肉湯和酵母液,可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)多損害細(xì)胞的自由基和超氧化物,使其無(wú)法復(fù)蘇。而吐溫20及吐溫80為非離子表面活性劑,可降低表面張力,從而增大細(xì)菌的活性,且其可為VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌提供充分的碳源,使細(xì)菌恢復(fù)可培養(yǎng)狀態(tài)[11]。本研究中,相同濃度下吐溫80培養(yǎng)液的復(fù)蘇能力優(yōu)于吐溫20,可能是由于吐溫80的乳化性較強(qiáng),可作為增溶劑,從而增強(qiáng)了復(fù)蘇的效果。

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