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(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所,河北石家莊 050051)
果醋是以水果為主要原料,經(jīng)酒精、醋酸兩個(gè)階段發(fā)酵釀制而成的營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的酸性保健飲品[1-2]。果醋的酸味決定于其有機(jī)酸的構(gòu)成和含量,而有機(jī)酸的構(gòu)成和含量決定了果醋的酸感與風(fēng)味特點(diǎn),進(jìn)而影響果醋的感官品質(zhì)。蘋(píng)果酸酸味爽快柔和、刺激性緩慢、保留時(shí)間較長(zhǎng);檸檬酸酸味爽口,其酸度比蘋(píng)果酸高,人的味覺(jué)更易感知;奎寧酸和莽草酸則可產(chǎn)生苦味[3];醋酸具有較強(qiáng)的刺激性,而檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸可緩沖醋酸的刺激性,使酸味柔和、醇厚[4-5]。這些有機(jī)酸共同決定了果醋的酸感。梨汁本身含有蘋(píng)果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、奎寧酸、莽草酸、乳酸等多種有機(jī)酸[6-7]。釀酒酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中不僅會(huì)將糖轉(zhuǎn)化為酒精,而且在其生長(zhǎng)代謝過(guò)程還會(huì)產(chǎn)生蘋(píng)果酸和琥珀酸等有機(jī)酸[8]。醋酸菌在蘋(píng)果醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中代謝消耗蘋(píng)果酸、乳酸、琥珀酸,而產(chǎn)生和積累檸檬酸[9]。國(guó)內(nèi)對(duì)梨醋的釀造工藝進(jìn)行了許多研究,然而,有關(guān)梨醋釀造過(guò)程中有機(jī)酸變化的研究卻報(bào)道很少。本文以河北特產(chǎn)鴨梨為原料釀制成梨醋,采用反相高效液相色譜(HPLC),分析研究了酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵條件對(duì)梨酒和梨醋有機(jī)酸的影響,以期為梨醋釀造的工藝優(yōu)化及酸感質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論參考。
鴨梨 河北省趙縣產(chǎn);安琪釀酒酵母(約220億個(gè)/g) 湖北安琪酵母股份有限公司;釀酒酵母1416、33133、1253、31009 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;滬釀1.01醋酸菌 石家莊珍極釀造集團(tuán);巴氏醋酸菌 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;醋酸菌SG19、SG20 本實(shí)驗(yàn)室自篩;草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、乳酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,分析純;酒石酸 天津市博迪化工有限公司,分析純;奎寧酸、琥珀酸、莽草酸 上海源葉生物科技公司,分析純。
JYZ-E6螺桿式榨汁機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司;SPX-250B-II型生化培養(yǎng)箱 上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng);LG16-B型高速離心機(jī) 北京雷勃爾設(shè)備有限公司;LC-20AT液相色譜儀,配有紫外檢測(cè)器、在線(xiàn)脫氣機(jī)和色譜柱恒溫箱 島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。
1.2.1 梨汁的制備 選擇新鮮無(wú)病的成熟鴨梨,清水洗凈、去核后,用螺桿式榨汁機(jī)榨汁。采用阿貝折光儀測(cè)得梨汁的糖度為11.2%。
1.2.2 酒精發(fā)酵
1.2.2.1 安琪釀酒酵母的活化 配制5%的葡萄糖水,以100∶1(v/w)比例加入安琪干酵母,35℃活化40min。
1.2.2.2 釀酒酵母種子培養(yǎng)基 2%葡萄糖,0.5%酵母粉,0.3%蛋白胨,0.2% KH2PO4,0.2%(NH4)2SO4,pH 5.0。
1.2.2.3 釀酒酵母種子液的制備 在100mL釀酒酵母菌種子培養(yǎng)基中,分別接入2~3環(huán)斜面保藏的釀酒酵母1416、33133、1253、31009,30℃、180r/min 搖床培養(yǎng)2d。
1.2.2.4 酒精發(fā)酵 將150mL梨汁加入250mL的三角瓶中,并按10%接種量接入釀酒酵母種子液,用8層干凈的紗布封口,在生化培養(yǎng)箱靜置進(jìn)行酒精發(fā)酵,并采用阿貝折光儀監(jiān)測(cè)發(fā)酵液糖度。當(dāng)糖度不再明顯降低,終止酒精發(fā)酵。
1.2.3 醋酸發(fā)酵
1.2.3.1 醋酸菌種子培養(yǎng)基 5%(v/v)無(wú)水乙醇、1%葡萄糖、1%酵母粉、0.2%(NH4)2SO4、0.2% KH2PO4、0.2% MgSO4。
1.2.3.2 醋酸菌種子液的制備 將2~3環(huán)斜面保藏的滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和SG20,分別接種到100mL醋酸種子培養(yǎng)基中,30℃、180r/min 搖床培養(yǎng)2d。
1.2.3.3 醋酸發(fā)酵 酒精發(fā)酵結(jié)束后,5000r/min離心10min除去酵母菌體和果肉殘?jiān)0?0%接種量接入醋酸菌種子液進(jìn)行靜置醋酸發(fā)酵,并采用酸堿滴定法監(jiān)測(cè)發(fā)酵液的酸度。直到酸度不再明顯升高,終止醋酸發(fā)酵。
1.2.4 釀酒酵母種類(lèi)對(duì)梨酒有機(jī)酸的影響 在150mL梨汁中,按10%接種量分別接入安琪酵母、釀酒酵母1416、33133、1253、31009種子液,28℃下靜置進(jìn)行酒精發(fā)酵。
1.2.5 發(fā)酵溫度對(duì)梨酒有機(jī)酸的影響 按10%接種量向150mL梨汁中接入釀酒酵母1416種子液,分別在25、28、30、34℃下進(jìn)行靜置酒精發(fā)酵。
1.2.6 醋酸菌種類(lèi)對(duì)梨醋有機(jī)酸的影響 150mL梨汁中,按10%接入釀酒酵母1416種子液,28℃靜置發(fā)酵3d。酒精發(fā)酵結(jié)束后,5000r/min離心10min,制得澄清梨酒(酒精含量3.86%)。在120mL梨酒中按8%接種量分別接入滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和醋酸菌SG20種子液,30℃下進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵。
1.2.7 醋酸發(fā)酵溫度對(duì)梨醋有機(jī)酸的影響 在120mL梨酒中按8%接種量接入滬釀1.01醋酸菌種子液,分別在25、30、34、37℃下進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵。
1.2.8 醋酸發(fā)酵方式對(duì)梨醋有機(jī)酸的影響 在120mL梨酒中按8%接種量接入滬釀1.01醋酸菌種子液,在30℃下分別進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵(10d)和搖床深層醋酸發(fā)酵(120r/min、8d)。
1.3.1 色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6mm×250mm);流動(dòng)相:0.01mol/L KH2PO4溶液,pH2.55(用50%的H3PO4調(diào)節(jié));流速:0.50mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;進(jìn)樣量:20μL/次。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確(精確至0.0001g)稱(chēng)取0.2g草酸、1.0g酒石酸、5.0g蘋(píng)果酸、1.0g莽草酸、5.0g乳酸、6.0g乙酸、3.0g檸檬酸、8.0g琥珀酸、0.1g奎寧酸,用三蒸水溶解并定容至100mL,制備得到有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。上述溶液配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液,用0.22μm濾膜過(guò)濾后,上機(jī)繪制9種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
1.3.3 樣品預(yù)處理 取5mL梨酒或梨醋,8000r/min離心10min,得到上清液。用三蒸水稀釋合適倍數(shù)后經(jīng)0.22μm膜濾后進(jìn)行HPLC測(cè)定。
1.3.4 有機(jī)酸定性定量方法 樣品以保留時(shí)間和各有機(jī)酸紫外吸收光譜來(lái)定性,以峰面積外標(biāo)法定量。每個(gè)樣品重復(fù)3次,取其平均值。
為了研究鴨梨醋釀造過(guò)程中有機(jī)酸的變化,采用HPLC測(cè)定了鴨梨汁中9種有機(jī)酸,分析結(jié)果見(jiàn)表1。鴨梨汁中含有豐富的有機(jī)酸,其中含量最高的為蘋(píng)果酸,占總酸含量的52.2%;其次為草酸和奎寧酸,分別占總酸含量的18.6%和10.9%;而檸檬酸含量較少。高海燕等人[7]也測(cè)定了河北鴨梨汁中的有機(jī)酸,發(fā)現(xiàn)鴨梨汁中主要有機(jī)酸含量依次為:蘋(píng)果酸﹥檸檬酸﹥奎寧酸,這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不完全一致,造成這種差異的原因是由于土壤、栽培管理、果實(shí)成熟度等條件的不同。
2.2.1 釀酒酵母種類(lèi)對(duì)梨酒有機(jī)酸的影響 為了考察釀酒酵母種類(lèi)對(duì)梨酒中有機(jī)酸的影響,本實(shí)驗(yàn)使用了安琪酵母、釀酒酵母1416、33133、1253、31009釀酒酵母來(lái)釀制梨酒,并測(cè)定了其中9種有機(jī)酸的含量,分析結(jié)果見(jiàn)表2。
表1 鴨梨汁中有機(jī)酸的含量(mg/100mL)Table 1 The contents of organic acids in Ya’ pear juice(mg/100mL)
表2 不同釀酒酵母釀制梨酒中有機(jī)酸的含量(mg/100mL)Table 2 The contents of organic acids in perry fermented with different yeasts(mg/100mL)
由表2可見(jiàn),同發(fā)酵前(鴨梨汁)相比,梨酒中的草酸、奎寧酸含量均表現(xiàn)為下降,乳酸、琥珀酸含量則均表現(xiàn)為上升,這表明5種釀酒酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中,代謝消耗了部分草酸和奎寧酸,同時(shí)產(chǎn)生乳酸和琥珀酸。在葡萄酒的酒精發(fā)酵過(guò)程中,酵母菌也會(huì)產(chǎn)生乳酸和琥珀酸[10]。其它5種有機(jī)酸變化因釀酒酵母種類(lèi)的不同而有很大差別。例如,釀酒酵母1416、31009和安琪釀酒酵母均產(chǎn)生大量的乙酸,而釀酒酵母1253卻不產(chǎn)生乙酸;釀酒酵母31009會(huì)大量利用消耗蘋(píng)果酸,而釀酒酵母1253卻可少量合成蘋(píng)果酸。在葡萄酒釀造過(guò)程中,也發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果酸既可被酵母代謝,又可被合成[11]。由于使用的釀酒酵母的不同,造成所釀制的梨酒中主要有機(jī)酸(含量>100mg/100mL)種類(lèi)也不同。例如,釀酒酵母1253釀制梨酒的主要有機(jī)酸為蘋(píng)果酸,與鴨梨汁的相同,而釀酒酵母31009釀制梨酒的主要有機(jī)酸為乙酸。
從表2還可見(jiàn),僅有釀酒酵母1416使得酒精發(fā)酵后的有機(jī)酸總量顯著增加,造成這種現(xiàn)象的主要原因是釀酒酵母1416大量產(chǎn)生乙酸,達(dá)到了363.74mg/100mL;安琪釀酒酵母、釀酒酵母1253、釀酒酵母31009卻使得梨酒中的有機(jī)酸顯著減少,其原因是草酸、奎寧酸、莽草酸及蘋(píng)果酸(釀酒酵母1253例外)大幅度減少;對(duì)于釀酒酵母33133而言,梨酒中的有機(jī)酸總量幾乎保持不變,而這種不變實(shí)際是幾種有機(jī)酸漲消平衡的結(jié)果。由此可見(jiàn),釀酒酵母的種類(lèi)對(duì)梨酒中有機(jī)酸含量有著很大的影響。選擇使用酸感良好的釀酒酵母,對(duì)于獲得風(fēng)味優(yōu)良的高品質(zhì)梨醋是非常重要的。在酒精發(fā)酵過(guò)程中,釀酒酵母1416在產(chǎn)生酒精的同時(shí)還產(chǎn)生較多的有機(jī)酸,而且其中主要是乙酸(56.0%)和蘋(píng)果酸(18.2%)。故從梨醋生產(chǎn)的角度考慮,1416為較適宜的釀酒酵母。
2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)梨酒有機(jī)酸的影響 發(fā)酵溫度是影響釀酒酵母生長(zhǎng)和產(chǎn)生酒精的重要影響因素之一。酒精發(fā)酵溫度對(duì)梨酒中9種有機(jī)酸的影響分別見(jiàn)圖1和圖2。
圖1 酒精發(fā)酵溫度對(duì)梨酒有機(jī)酸的影響 Fig.1 Effect of ethanol fermentation temperature on organic acids in perry
圖2 酒精發(fā)酵溫度對(duì)梨酒有機(jī)酸的影響 Fig.2 Effect of ethanol fermentation temperature on organic acids in perry
如圖1、圖2所示,梨酒中乙酸、琥珀酸隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而增加,尤其是乙酸,當(dāng)發(fā)酵溫度從25℃升高到34℃時(shí),乙酸含量從70.13mg/100mL增加到482.0mg/100mL,增加了5倍多;而蘋(píng)果酸、乳酸、奎寧酸含量則隨著酒精發(fā)酵溫度的增加而降低。蘋(píng)果酸含量的降低是由于部分蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化成了琥珀酸[10]。酒石酸、檸檬酸含量分別在28、30℃下達(dá)到最高值,隨著溫度的進(jìn)一步增加,其含量降低。發(fā)酵溫度對(duì)梨酒的莽草酸、草酸含量影響很小。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),當(dāng)發(fā)酵溫度為34℃時(shí),梨酒在12h之內(nèi)出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,發(fā)酵結(jié)束后的風(fēng)味明顯不如低溫的。造成這一現(xiàn)象的原因,可能是因?yàn)?0℃以上的高溫發(fā)酵容易使酵母生長(zhǎng)繁殖過(guò)快,過(guò)多的消耗了梨汁的營(yíng)養(yǎng)成分,導(dǎo)致梨酒果香味淡薄[12]。上述結(jié)果表明,酒精發(fā)酵溫度對(duì)梨酒中有機(jī)酸的代謝和合成有著顯著影響,因此,在選擇酒精發(fā)酵溫度時(shí),不僅要考慮發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵效率的影響,還要考慮對(duì)有機(jī)酸變化以及由此產(chǎn)生的對(duì)梨酒風(fēng)味的影響。從梨酒風(fēng)味角度考慮,28℃為適宜酒精發(fā)酵溫度。
2.3.1 醋酸菌種類(lèi)對(duì)梨醋有機(jī)酸的影響 在梨酒中分別接種滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和SG20,30℃下進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 不同醋酸菌釀造梨醋中有機(jī)酸的含量(mg/100mL)Table 3 The contents of organic acids in pear vinegar fermented with different acetic acid bacteria(mg/100mL)
如表3所示,4種醋酸菌均大量產(chǎn)生乙酸,乙酸含量占總酸比例均達(dá)到80%以上,特別是滬釀1.01氧化乙醇產(chǎn)生乙酸能力很強(qiáng),其產(chǎn)酸量比其它3個(gè)菌種高一倍以上,這是由于滬釀1.01是一個(gè)米醋工業(yè)生產(chǎn)上使用的菌種。與梨酒中的有機(jī)酸相比,4種醋酸菌均使得梨醋中酒石酸含量增加,而使得檸檬酸含量降低,說(shuō)明4種醋酸菌均有代謝酒石酸和檸檬酸的能力,醋酸發(fā)酵過(guò)程中消耗檸檬酸,而產(chǎn)生和積累酒石酸。除乙酸、酒石酸和檸檬酸外,梨醋中的有機(jī)酸變化因使用的醋酸菌而異。例如,巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和醋酸菌SG20在醋酸發(fā)酵期間顯著地消耗了部分蘋(píng)果酸,而滬釀1.01醋酸菌卻產(chǎn)生一些蘋(píng)果酸;滬釀1.01、巴氏醋酸菌和醋酸菌SG20可產(chǎn)生部分奎寧酸,而醋酸菌SG19卻將梨酒中奎寧酸代謝殆盡。梨醋中主要有機(jī)酸也因使用的醋酸菌而異,例如,滬釀1.01梨醋的主要有機(jī)酸依次為:乙酸>蘋(píng)果酸>奎寧酸>酒石酸,而巴氏醋酸菌梨醋主要有機(jī)酸依次為:乙酸>酒石酸>蘋(píng)果酸>奎寧酸。醋酸發(fā)酵結(jié)束后,滬釀1.01發(fā)酵液總酸達(dá)到2348.4mg/100mL,有明顯的醋酸味,而其它3種醋酸菌發(fā)酵液由于總酸較少,醋酸味較淡,梨醋的品質(zhì)較差。由上述可知,醋酸菌的種類(lèi)對(duì)梨醋中有機(jī)酸的代謝有顯著影響。
2.3.2 醋酸發(fā)酵溫度對(duì)梨醋有機(jī)酸的影響 為了了解發(fā)酵溫度對(duì)梨醋釀制過(guò)程中有機(jī)酸產(chǎn)生的影響,在梨酒中接種滬釀1.01醋酸菌,分別在25、30、34、37℃下進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。
圖3 醋酸發(fā)酵溫度對(duì)梨醋有機(jī)酸的影響 Fig.3 Effect of acetic fermentation temperature on organic acids in pear vinegar
圖4 醋酸發(fā)酵溫度對(duì)梨醋有機(jī)酸的影響 Fig.4 Effect of acetic fermentation temperature on organic acids in pear vinegar
作為梨醋中最主要的有機(jī)酸,乙酸含量在25~34℃范圍內(nèi)隨著發(fā)酵溫度的上升而增加;當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)34℃時(shí),梨醋乙酸含量明顯下降,這是由于醋酸發(fā)酵溫度過(guò)高時(shí)菌體老化加快,產(chǎn)酸量降低[13]。酒石酸、奎寧酸、莽草酸、琥珀酸和乳酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加,但增幅不一。在較低(25℃)或較高(37℃)發(fā)酵溫度下有利于檸檬酸的產(chǎn)生。蘋(píng)果酸和草酸的含量受發(fā)酵溫度影響很小。
2.3.3 醋酸發(fā)酵方式對(duì)梨醋有機(jī)酸的影響 將滬釀1.01醋酸菌接種在梨酒中,分別進(jìn)行表面靜置醋酸發(fā)酵和搖床深層醋酸發(fā)酵,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可發(fā)現(xiàn),搖床深層發(fā)酵釀制梨醋的總酸要高于表面靜置發(fā)酵,其有機(jī)酸含量差別及對(duì)梨醋酸感的影響主要體現(xiàn)在乙酸和蘋(píng)果酸上。搖床深層發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸顯著高于表面靜置發(fā)酵,其原因是醋酸發(fā)酵是一個(gè)好氧發(fā)酵過(guò)程,搖床深層發(fā)酵可提供比表面靜置發(fā)酵更多的氧氣,而較充足的氧氣供給更有利于乙醇的轉(zhuǎn)化。從表4中還可發(fā)現(xiàn),表面靜置發(fā)酵會(huì)使得滬釀1.01合成部分蘋(píng)果酸,與之相反,搖床深層發(fā)酵卻會(huì)造成大量蘋(píng)果酸的消耗;蘋(píng)果酸酸味爽快柔和,這可能是導(dǎo)致靜置發(fā)酵梨醋風(fēng)味好于搖床發(fā)酵的原因之一。陳義倫等[9]研究了醋酸發(fā)酵方式對(duì)蘋(píng)果醋中有機(jī)酸的影響,發(fā)現(xiàn)靜置發(fā)酵釀制蘋(píng)果醋中蘋(píng)果酸僅略高于搖床發(fā)酵,且發(fā)酵方式對(duì)酸種類(lèi)和含量影響不大,與本研究的結(jié)果不太一致,其原因可能是由于所使用的釀造原料及醋酸菌的不同。
表4 不同發(fā)酵方式釀造梨醋中有機(jī)酸的含量(mg/100mL)Table 4 The contents of organic acids in pear vinegar brewed in different fermentation process(mg/100mL)
以河北特產(chǎn)鴨梨為原料釀制成梨醋,采用反相HPLC分析研究了酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵條件對(duì)梨酒和梨醋有機(jī)酸的影響,研究結(jié)果表明:
a.釀酒酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中,可代謝梨汁中各種有機(jī)酸。與梨汁相比,梨酒中的草酸、奎寧酸含量均表現(xiàn)為下降,乳酸、琥珀酸含量則均表現(xiàn)為上升。梨酒中主要有機(jī)酸含量因釀酒酵母種類(lèi)的不同而有很大差別。
b.梨酒中乙酸、琥珀酸隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而增加,而蘋(píng)果酸、乳酸、奎寧酸含量則隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而降低。發(fā)酵溫度對(duì)梨酒的莽草酸、草酸含量影響很小。
c.實(shí)驗(yàn)使用的4種醋酸菌轉(zhuǎn)化乙醇生成乙酸的能力相差較大。4種醋酸菌均具有代謝各種有機(jī)酸的功能,在醋酸發(fā)酵過(guò)程中消耗檸檬酸,而產(chǎn)生和積累酒石酸。
d.滬釀1.01醋酸菌的最適產(chǎn)乙酸溫度為34℃。梨醋中酒石酸、奎寧酸、莽草酸、琥珀酸和乳酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加。梨醋中蘋(píng)果酸和草酸的含量幾乎不受發(fā)酵溫度的影響。
e.發(fā)酵方式影響乙酸的產(chǎn)生及有機(jī)酸的代謝。搖床深層發(fā)酵釀制梨醋的總酸要高于表面靜置發(fā)酵,其有機(jī)酸含量差別及對(duì)梨醋酸感的影響主要體現(xiàn)在乙酸和蘋(píng)果酸上。表面靜置發(fā)酵梨醋的蘋(píng)果酸含量明顯高于搖床深層發(fā)酵。
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