席蕓，錢曉萍，劉寶瑞

(1. 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210008)

抗腫瘤藥物細(xì)胞毒殺傷作用無(wú)選擇性，且在體內(nèi)環(huán)境中難以保持穩(wěn)定的有效濃度。將抗腫瘤藥物通過(guò)載體靶向運(yùn)送至腫瘤組織后再釋放是降低藥物毒副作用、減少用藥劑量、增強(qiáng)藥物在局部藥效的最佳辦法?？茖W(xué)家們嘗試過(guò)多種方法提取或仿生合成紅細(xì)胞膜用于載藥系統(tǒng)，但面臨生物相容性、生物安全性等問題，于是采用紅細(xì)胞直接作為載體的想法應(yīng)運(yùn)而生[1]。自體血液中分離的紅細(xì)胞具有類似脂質(zhì)體作為藥物載體的潛能，不同載藥方式處理和修飾后建立起來(lái)的載體紅細(xì)胞有較好的安全性、有效性和易耐受性。此外，紅細(xì)胞經(jīng)修飾后可具有不同的靶向性，應(yīng)用于抗腫瘤藥物的運(yùn)輸可以提高其腫瘤局部治療的效果。

1 紅細(xì)胞作為藥物載體的優(yōu)勢(shì)

紅細(xì)胞除了運(yùn)送氧氣、二氧化碳之外還有抗原識(shí)別能力，能調(diào)節(jié)體內(nèi)多種免疫殺傷細(xì)胞的活性，同時(shí)能識(shí)別、黏附和提呈腫瘤抗原。其作為一種藥物載體除了有提高治療效果、減小毒副作用[2]外，還具有以下一些獨(dú)特的優(yōu)越性[3- 4]。

1.1 易獲得和體內(nèi)循環(huán)生存時(shí)間長(zhǎng)

正常人體血液中的紅細(xì)胞數(shù)量多達(dá)(3.5～5)×1012L-1，占所有血細(xì)胞的99 %以上。而且載體紅細(xì)胞空載時(shí)在體內(nèi)循環(huán)中的壽命平均為89～131d，半衰期為19～29d，接近于正常紅細(xì)胞的值。因此，血液學(xué)指標(biāo)較好的腫瘤患者可以利用自身的紅細(xì)胞作為藥物載體而不影響其健康狀況。同時(shí)對(duì)紅細(xì)胞或藥物進(jìn)行修飾，通過(guò)一些化學(xué)鍵或靜電作用改變藥物與紅細(xì)胞的連接方式，還可以使藥物釋放達(dá)到理想的速率[5]。

1.2 可觀的表面積、體積和生物靶向性

紅細(xì)胞膜面積約為160μm2，體積約為90μm3，為載體修飾和藥物包載提供了大量的位置和空間[6]。衰老、變性的紅細(xì)胞主要在機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)被清除，這雖然可以被設(shè)計(jì)成脾、肝靶向的藥物載體，但并不能發(fā)揮紅細(xì)胞作為生物載體長(zhǎng)循環(huán)的優(yōu)勢(shì)，但是通過(guò)對(duì)紅細(xì)胞的修飾可使載體紅細(xì)胞將藥物選擇性地定向于靶部位[7]。

1.3 安全性和耐受性

與其他藥物載體相比，紅細(xì)胞作為機(jī)體自身的組成部分具有其他人工合成的藥物載體無(wú)法比擬的生物相容性和生物可降解性，應(yīng)用患者自身的紅細(xì)胞還可以避免免疫系統(tǒng)的干擾。紅細(xì)胞膜為半透膜，對(duì)載入藥物的緩慢釋放可以使藥物在循環(huán)中維持穩(wěn)定的有效濃度，可以減少用藥量和給藥次數(shù)，同時(shí)安全性、耐受性也能顯著提高。

2 載藥方式

目前已研究出多種包載藥物的方法，主要分為細(xì)胞內(nèi)包埋和細(xì)胞表面吸附兩種途徑，將包有藥物的微球吸附于紅細(xì)胞表面是最近提出的載藥方式。

2.1 細(xì)胞內(nèi)包埋

當(dāng)紅細(xì)胞外滲透壓為150mOsm·kg-1H2O(即溶血臨界點(diǎn))時(shí)，紅細(xì)胞可逆性膨脹至原體積的125%，呈橢圓形，紅細(xì)胞膜上孔隙(D=20～50nm) 短暫開放，外界物質(zhì)即可進(jìn)入紅細(xì)胞，同時(shí)紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白部分逸出紅細(xì)胞；當(dāng)紅細(xì)胞外滲透壓恢復(fù)至300mOsm·kg-1H2O時(shí)，紅細(xì)胞可以恢復(fù)原狀，膜上孔隙隨之關(guān)閉，外界物質(zhì)即包封于紅細(xì)胞內(nèi)[7]。

2.2 表面吸附及修飾

紅細(xì)胞膜表面為載藥提供了大量的鏈接位置和空間，目前常用的結(jié)合方式有化學(xué)鍵結(jié)合(共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵)、藥物作為配體與載體紅細(xì)胞上修飾的受體結(jié)合、在藥物上連接抗體結(jié)構(gòu)與載體紅細(xì)胞表面固有的抗原結(jié)合[8]。表面吸附可以減少對(duì)載體紅細(xì)胞的損傷及生物相容性的影響，前藥的應(yīng)用可以避免血漿中抑制因子對(duì)藥物的滅活。

2.3 載微球紅細(xì)胞

微球是最近發(fā)展起來(lái)的新型藥物載體，微球的控釋效果好但循環(huán)清除率高，而紅細(xì)胞載體易獲得、在循環(huán)中生存時(shí)間長(zhǎng)，但控釋效果差，這樣兩者正好進(jìn)行互補(bǔ)，使得載微球紅細(xì)胞在理論上有循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)、藥物釋放穩(wěn)定、藥物清除后對(duì)紅細(xì)胞無(wú)影響的優(yōu)點(diǎn)。

Elizabeth等[9]證實(shí)，直徑在100nm～1.1μm的微球可以吸附在紅細(xì)胞表面，并且不影響紅細(xì)胞的形態(tài)，且在24h內(nèi)較穩(wěn)定。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，微球吸附于紅細(xì)胞表面后體內(nèi)循環(huán)時(shí)間從2h延長(zhǎng)到12h，并且在微球被完全清除后被其黏附的紅細(xì)胞在體內(nèi)的循環(huán)并沒有受到影響。吸附和脫落方式研究結(jié)果顯示：(1) 血清中的調(diào)理素、補(bǔ)體等物質(zhì)會(huì)影響微球與紅細(xì)胞的連接；(2) 連接方式(疏水鍵/共價(jià)鍵/靜電作用) 不同、直徑不同，導(dǎo)致體內(nèi)循環(huán)時(shí)間不同；(3) 脾臟主要作用于大顆粒，使微球從紅細(xì)胞上脫落，而肝臟主要作用于小顆粒，清除體內(nèi)的微球；(4) 細(xì)胞間相互作用、毛細(xì)血管壁的作用和血管內(nèi)剪切力是微球從紅細(xì)胞上脫落的主要作用因素，其中細(xì)胞間的相互作用最大。后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用聚乙二醇修飾載微球紅細(xì)胞能進(jìn)一步降低微球的清除率，循環(huán)中微球被完全清除所需的時(shí)間從2d延長(zhǎng)到7d以上。

最近，F(xiàn)an 等[10]成功地將低分子殼聚糖微球吸附于載體紅細(xì)胞表面，并且對(duì)紅細(xì)胞的功能及壽命沒有產(chǎn)生明顯的影響，為紅細(xì)胞- 低分子殼聚糖復(fù)合物成為血管內(nèi)藥物運(yùn)輸系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

3 紅細(xì)胞的修飾與保護(hù)

為了增強(qiáng)載體紅細(xì)胞與藥物連接的穩(wěn)定性、控制藥物釋放、改善靶向性，對(duì)載體紅細(xì)胞進(jìn)行修飾也是目前研究的熱點(diǎn)。

3.1 戊二醛

Marczak[8]經(jīng)一系列的實(shí)驗(yàn)后認(rèn)為用戊二醛修飾載體紅細(xì)胞可以達(dá)到以下目的：(1) 增加藥物穩(wěn)定性；(2) 增強(qiáng)載藥紅細(xì)胞體內(nèi)、體外的活性；(3) 使載藥紅細(xì)胞不被巨噬細(xì)胞“吞噬”；(4) 使包載的藥物與包膜連接，在連接鍵水解后藥物經(jīng)包膜緩釋，但戊二醛會(huì)影響載體紅細(xì)胞功能并使載體紅細(xì)胞壽命縮短而使其應(yīng)用受阻。

3.2 DTSP/BS3

DTSP[3，3′- 二硫代雙(磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯)]和BS3(雙琥珀酰亞胺辛二酸酯鈉鹽) 都是一種Band 3(帶3蛋白) 交聯(lián)試劑。用Band 3交聯(lián)試劑修飾的載體紅細(xì)胞更易被巨噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬(吞噬率從3 %提高到了11 %)，并且經(jīng)Band 3與巨噬細(xì)胞形成牢固連接[7]，但其生物安全性和生物相容性需要進(jìn)一步認(rèn)證。

3.3 磁化

磁化載體紅細(xì)胞是將有磁性的納米顆粒包埋入載體紅細(xì)胞或者吸附在載體紅細(xì)胞表面，再利用體外磁場(chǎng)作用引導(dǎo)，提高靶部位藥物濃度，降低抗腫瘤藥物對(duì)正常組織的毒副作用[11]。

3.4 免疫逃避保護(hù)

藥物長(zhǎng)期與紅細(xì)胞接觸會(huì)使紅細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，易過(guò)早地被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)識(shí)別，進(jìn)而被吞噬細(xì)胞清除[11]。徐艷艷等[12]證實(shí)用海藻酸鈉- 聚賴氨酸- 海藻酸鈉微囊包裹紅細(xì)胞可保護(hù)其免受宿主免疫系統(tǒng)的排斥，且該囊膜具有一定的通透性，氧氣、葡萄糖等小分子物質(zhì)能透過(guò)囊膜。用該囊膜包裹載藥的紅細(xì)胞可以在保證藥物穩(wěn)定釋放的同時(shí)發(fā)揮紅細(xì)胞作為生物載體長(zhǎng)循環(huán)的優(yōu)勢(shì)，或許還能保護(hù)異體紅細(xì)胞載體逃避體內(nèi)免疫系統(tǒng)的排斥。

4 載體紅細(xì)胞在抗腫瘤藥物運(yùn)輸方向的應(yīng)用

目前能被載體紅細(xì)胞包載的物質(zhì)有50多種，其中載L- 門冬酰胺酶紅細(xì)胞已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療急性淋巴細(xì)胞白血病[5]；部分細(xì)胞抑制劑、抗生素、激素、維生素、酶類和疫苗已經(jīng)成功地被載體紅細(xì)胞包載[2- 3，13]。

4.1 依托泊苷

Lotero等[7]建立了載依托泊苷(etoposide) 紅細(xì)胞，并進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。用低滲透析等滲重封的方法包載，最大包載率為22%，細(xì)胞回收率為56.6 %。用BS3處理載體紅細(xì)胞能使巨噬細(xì)胞對(duì)載依托泊苷紅細(xì)胞的吞噬量從4 %提高到14 %，載依托泊苷紅細(xì)胞能使巨噬細(xì)胞內(nèi)(15.36±4.67)%的DNA骨架斷裂，而依托泊苷裸藥只能使巨噬細(xì)胞內(nèi)(9.0±2.65)%的DNA骨架斷裂，說(shuō)明經(jīng)紅細(xì)胞包載后依托泊苷對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性增強(qiáng)。

4.2 5- Aza- 2- dC

Caterina等[14]用病毒刺突融合糖蛋白修飾載體紅細(xì)胞包載5- Aza- 2- dC(5- 雜氮- 2′- 脫氧胞苷)，并用熒光染色觀察其作用于人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的過(guò)程：(1) 30min后載藥紅細(xì)胞開始與HeLa細(xì)胞連接；(2) 6h后大部分載藥紅細(xì)胞進(jìn)入HeLa細(xì)胞的胞漿內(nèi)；(3) 12h后載藥紅細(xì)胞的膜開始與HeLa細(xì)胞的膜黏附，藥物釋放入腫瘤細(xì)胞內(nèi)；(4) 96h后大部分HeLa細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡晚期的典型微核形態(tài)。該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，用HA病毒蛋白修飾載體紅細(xì)胞能通過(guò)與HeLa細(xì)胞的高效黏附增強(qiáng)藥物的生物利用度。

4.3 甲氨蝶呤

袁盛華等[15]對(duì)載體紅細(xì)胞包載甲氨蝶呤做了一系列的臨床前試驗(yàn)。首先，用正交試驗(yàn)確定了高滲法制備的最佳條件值，使載藥率提高到了41.58 %，并且證實(shí)該方法不改變載體紅細(xì)胞的免疫黏附性。接下來(lái)的體內(nèi)研究證實(shí)，甲氨蝶呤經(jīng)載體紅細(xì)胞包載后血藥濃度高峰從(13.6±3.7)mg·L-1下降到(2.7±1.2)mg·L-1，半衰期從(3.9±0.8)h延長(zhǎng)到(13.5 ± 2.0)h，說(shuō)明載體紅細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤有緩釋效應(yīng)；在產(chǎn)生與裸藥相近的抑瘤作用的同時(shí)將荷瘤小鼠的8d存活率從50 %提高到87.5 %，而且對(duì)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血清肌酸酐等生化指標(biāo)的異常有明顯逆轉(zhuǎn)作用。彭麗華[16]也證實(shí)載甲氨蝶呤紅細(xì)胞相較于甲氨蝶呤裸藥能提高大鼠的生存能力，還能保護(hù)大鼠的肝腎功能。

4.4 長(zhǎng)春新堿

施瑩等[17]對(duì)載體紅細(xì)胞包載長(zhǎng)春新堿做了一系列臨床前研究。用改良低滲預(yù)膨脹法制得了穩(wěn)定的對(duì)載體紅細(xì)胞天然免疫活性無(wú)影響的載長(zhǎng)春新堿紅細(xì)胞，平均載藥率高達(dá)(61.42±3.69) %，細(xì)胞平均回收率高達(dá)(90.61±4.95) %，高倍鏡下觀察載體紅細(xì)胞形態(tài)，比較包載前后均無(wú)明顯變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，長(zhǎng)春新堿載藥紅細(xì)胞組對(duì)小鼠移植瘤的抑制率為42.42 %，是單用長(zhǎng)春新堿組的2.43倍，而且長(zhǎng)春新堿載藥紅細(xì)胞組小鼠的體重增加也較單用長(zhǎng)春新堿組更明顯，說(shuō)明長(zhǎng)春新堿經(jīng)載體紅細(xì)胞包載后不僅抗腫瘤效應(yīng)增強(qiáng)，還減少了毒副作用；連續(xù)檢測(cè)小鼠血液、腫瘤、肝臟內(nèi)的藥物濃度可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)紅細(xì)胞包載后長(zhǎng)春新堿在血中的半衰期達(dá)4.1h，是單用長(zhǎng)春新堿組的2.68倍，并且靜脈輸注后72h內(nèi)長(zhǎng)春新堿載藥紅細(xì)胞組在肝臟、腫瘤內(nèi)長(zhǎng)春新堿的濃度高于單用長(zhǎng)春新堿組，說(shuō)明載體紅細(xì)胞對(duì)包載的長(zhǎng)春新堿有緩釋作用，并且有肝臟、腫瘤靶向性。

5 結(jié) 語(yǔ)

用完整的細(xì)胞作為運(yùn)輸載體的思路在載藥系統(tǒng)建立的研究中已產(chǎn)生多年[18]，且越來(lái)越多地被關(guān)注和研究，其中將患者自身的紅細(xì)胞作為藥物載體來(lái)減少化療藥物的毒副作用、延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間、增強(qiáng)藥物的腫瘤局部作用效果是一種既簡(jiǎn)單又安全的途徑。相較于納米載體，技術(shù)方法較易普及，且有更好的生物相容性和生物可降解性。但是腫瘤患者自身的紅細(xì)胞通常有某些結(jié)構(gòu)和分子的改變影響其藥物運(yùn)輸?shù)墓δ躘19]，海藻酸鈉- 聚賴氨酸- 海藻酸鈉微囊等技術(shù)使載體紅細(xì)胞的建立不局限于自身的紅細(xì)胞，使得該技術(shù)能被更廣泛地應(yīng)用。對(duì)紅細(xì)胞載藥研究至今，科學(xué)家們雖然有很多重大的突破，同時(shí)也面臨著許多難題。如何能更好地控制載體紅細(xì)胞對(duì)所載藥物的釋放；通過(guò)各種修飾提高載體紅細(xì)胞的靶向性，增加載體紅細(xì)胞的靶向部位；使載藥過(guò)程和對(duì)載體紅細(xì)胞的修飾過(guò)程不影響載體紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和生物相容性等這些問題都是值得我們?nèi)ミM(jìn)一步探索的。對(duì)載藥紅細(xì)胞的研究大都只停留于臨床前的研究，只有少數(shù)幾種藥物進(jìn)入了臨床應(yīng)用，這其中缺乏資金支持、缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證等都是亟待解決的問題。接下來(lái)對(duì)紅細(xì)胞載藥的研究應(yīng)更多地著重于向臨床的推廣，確定紅細(xì)胞載藥系統(tǒng)統(tǒng)一的安全性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)增加載體紅細(xì)胞的載藥種類，增強(qiáng)載體紅細(xì)胞的靶向性等都是科學(xué)家們接下來(lái)要努力的方向。

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