王樹(shù)香+李術(shù)娜+李紅亞

摘要：試驗(yàn)研究了產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX-29的芽孢產(chǎn)率及芽孢數(shù)量，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)該菌產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳條件為：培養(yǎng)基成分：0.5%可溶性淀粉、2.0%蛋白胨、0.10% KH2PO4和0.05% MnSO4·H2O；培養(yǎng)條件：pH 8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL（250 mL三角瓶）。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中該菌株的芽孢數(shù)量達(dá)到6.4×109個(gè)/mL，芽孢產(chǎn)率達(dá)到97.61%。

關(guān)鍵詞：植酸酶；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX-29；發(fā)酵；芽孢

中圖分類號(hào)：TQ920.6；Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0160-03

Optimization of Spore Production Conditions of Strain of Producing Phytase

Bacillus subtilis ZX-29

WANG Shu-xiang，LI Shu-na，LI Hong-ya

（College of Life Science， Hebei Agriculture University， Baoding 071001， Hebei，China）

Abstract： The sporulation rate and spore quantity of Strain of producing phytase B. subtilis ZX-29 were studied and the spore production process were optimized through single factor experiment and orthogonal experiment. The results showed that the optimal conditions of spore production were 0.5% Sorbitol， 2% Peptone， 0.1% KH2PO4 and 0.05% MnSO4·H2O， initial pH8.0， inoculating 20 h and filling 30 mL/250mL bottle the spore quantity of strain Bacillus subtilis ZX-29 achieves 6.4×109 per mL and the spore production rate achieved 97.61%.

Key words： phytase； Bacillus subtilis ZX-29； fermentation； spore

收稿日期：2013-06-19

基金項(xiàng)目：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QJ201233）

作者簡(jiǎn)介：王樹(shù)香（1977-），女，河北唐山人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物、生物飼料和生物肥料方面的研究，（電話）15930281873

（電子信箱）wangshuxiang@hebau.edu.cn。

植酸酶（Phytase）在畜禽飼料生產(chǎn)中使用可解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高飼料中多種礦物元素和蛋白質(zhì)、氨基酸的可利用性，又能提高植酸磷的利用率，降低糞便磷排泄造成的環(huán)境污染[1]。植酸酶對(duì)人體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有明顯的促進(jìn)作用[2]。近年來(lái)植酸酶開(kāi)始應(yīng)用于植物性食品中，可達(dá)到分解植酸、平衡營(yíng)養(yǎng)的作用[3]。

植酸酶是一類對(duì)熱敏感的酶類，制粒過(guò)程中高溫、高壓及高含水量可對(duì)其產(chǎn)生極大破壞，導(dǎo)致目前商品植酸酶存在價(jià)格昂貴、產(chǎn)量低、不耐高溫及產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[4]，因此獲得高熱穩(wěn)定性的植酸酶是近年來(lái)植酸酶工業(yè)的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在飼用植酸酶方面，篩選到能夠直接產(chǎn)耐高溫植酸酶的菌株是最佳方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道已分離到的產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌產(chǎn)酶普遍較低，達(dá)不到預(yù)期用于發(fā)酵生產(chǎn)的目的，因此增加芽孢桿菌植酸酶的產(chǎn)量成為目前亟待解決的研究課題之一[5，6]。目前已有關(guān)于芽孢桿菌植酸酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究[7-11]，但仍不能達(dá)到預(yù)期可應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)的效果[12]。

近年的研究已證明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX-29具有安全、高效、耐熱的特點(diǎn)。本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和多因素試驗(yàn)對(duì)B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行研究，旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 B. subtilis ZX-29，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室分離篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基 本試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基等[13，14]。

1.1.3 測(cè)定方法 芽孢染色及生物量測(cè)定（血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)）均參照文獻(xiàn)[15]。

1.1.4 試驗(yàn)方法 用單因素試驗(yàn)確定B. subtilis ZX-29產(chǎn)芽孢最佳的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽；按正交試驗(yàn)L16（44）確定最佳的培養(yǎng)基成分；L16（34）確定最佳的培養(yǎng)條件[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖1可看出，以可溶性淀粉作碳源時(shí)，B. subtilis ZX-29菌株芽孢和菌體的數(shù)量達(dá)到最高，芽孢產(chǎn)率為80.25%，說(shuō)明可溶性淀粉作碳源有利菌體生長(zhǎng)，因此最佳碳源選擇可溶性淀粉為宜。

2.2 氮源對(duì)B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖2可看出，培養(yǎng)48 h時(shí)，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中芽孢的產(chǎn)率最高，為98.15%，而且各種氮源的芽孢產(chǎn)率差異較大，因此，選擇蛋白胨為B. subtilis ZX-29菌株產(chǎn)芽孢的最佳氮源。

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖3可看出，不同的無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)芽孢形成的影響差異較大。B. subtilis ZX-29在培養(yǎng)72 h時(shí)，KH2PO4試驗(yàn)組中芽孢產(chǎn)率可達(dá)95.57%；銅鹽組中則既沒(méi)有菌體存在也無(wú)芽孢形成；MnSO4·H2O作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，其芽孢生成率也較高，可達(dá)到93.51%。試驗(yàn)結(jié)果顯示KH2PO4為B. subtilis ZX-29菌株產(chǎn)芽孢的最佳無(wú)機(jī)鹽。但由于用KH2PO4做無(wú)機(jī)鹽時(shí)，雖然芽孢產(chǎn)率較高，但菌體的生長(zhǎng)狀況欠佳，而以MnSO4·H2O作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，其芽孢產(chǎn)率較高，菌體生長(zhǎng)狀況也較好，故B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽采用KH2PO4和MnSO4·H2O的復(fù)合鹽為最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

首先對(duì)B. subtilis ZX-29菌株不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行芽孢計(jì)數(shù)，結(jié)果表明其發(fā)酵48 h時(shí)的芽孢產(chǎn)率達(dá)到90%以上，從而以發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進(jìn)行正交分析。由表1可見(jiàn)，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基最佳成分組成為：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

以B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進(jìn)行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，B. subtilis ZX-29菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色結(jié)果

按以上優(yōu)化條件對(duì)B. subtilis ZX-29菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定其總生物量，并對(duì)所得芽孢進(jìn)行孔雀綠染色和結(jié)晶紫染色觀察。觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：發(fā)酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢數(shù)量達(dá)到6.4×109個(gè)/mL，芽孢產(chǎn)率為97.61%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)比較B. subtilis ZX-29在不同條件下的芽孢產(chǎn)率，從而確定了該菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳條件為：培養(yǎng)基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培養(yǎng)條件：pH 8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時(shí)間48 h。優(yōu)化后的芽孢產(chǎn)率達(dá)到97.61%。最終生物量為6.4×109個(gè)/mL。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)一些拮抗菌、益生菌等的產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化進(jìn)行了多年研究，已達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。并且通過(guò)多年研究可知，某些條件的刺激也有可能導(dǎo)致芽孢快速生成，比如突然降溫、靜置、添加固體介質(zhì)等，但本研究中未進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，將在以后進(jìn)行相關(guān)方面的研究，進(jìn)一步完善試驗(yàn)結(jié)果，以便更快、更好地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳華東，吳志青.植酸酶的特性及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2011（5）：5-8.

[2] 王 陶，李 文，袁佩佩.中性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2012，33（1）：120-124.

[3] 李 文，王 陶.酸性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究[J].食品科學(xué)，2011，32（5）：228-233.

[4] 蔣治國(guó).植酸酶的研究進(jìn)展及其在飼料中的應(yīng)用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（8）：37-40.

[5] EDWARD J，MULIANEY H J. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2000，168（4）：35-36.

[6] 于 平 陳益潤(rùn). 高產(chǎn)耐熱型植酸酶菌株 ZJ0702 發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（3）：98-103.

[7] 覃擁靈，何海燕. 產(chǎn)植酸酶菌種的選育及發(fā)酵條件初步研究[J].廣西輕工業(yè)，2011（8）：14-16.

[8] 王亞茹，姚 斌，曾 虹.枯草芽孢桿菌中性植酸酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)報(bào)，2001，41（2）：198-203.

[9] 王文君，黃梅娜，夏延國(guó)，等.產(chǎn)中性植酸酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2011（7）：89-93.

[10] 黃魁英，夏楓耿，黃樂(lè)天，等.耐高溫植酸酶畢赤酵母工程菌發(fā)酵中試條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技，2011，21（10）：1238-1241.

[11] 沈莎莎，楊紅建，張曉明.瘤胃微生物植酸酶的分類與酶學(xué)性質(zhì)研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（12）：1655-1660.

[12] 于 平，陳益潤(rùn).響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（3）：86-90.

[13] 李術(shù)娜，王樹(shù)香，王占利，等.大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌B. subtilis LZ2-70產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化[J].棉花學(xué)報(bào)，2009，21（4）：307-312.

[14] 程麗娟，薛泉宏，來(lái)航線.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].西安：世界圖書(shū)出版公司，2000.

[15] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖3可看出，不同的無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)芽孢形成的影響差異較大。B. subtilis ZX-29在培養(yǎng)72 h時(shí)，KH2PO4試驗(yàn)組中芽孢產(chǎn)率可達(dá)95.57%；銅鹽組中則既沒(méi)有菌體存在也無(wú)芽孢形成；MnSO4·H2O作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，其芽孢生成率也較高，可達(dá)到93.51%。試驗(yàn)結(jié)果顯示KH2PO4為B. subtilis ZX-29菌株產(chǎn)芽孢的最佳無(wú)機(jī)鹽。但由于用KH2PO4做無(wú)機(jī)鹽時(shí)，雖然芽孢產(chǎn)率較高，但菌體的生長(zhǎng)狀況欠佳，而以MnSO4·H2O作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，其芽孢產(chǎn)率較高，菌體生長(zhǎng)狀況也較好，故B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽采用KH2PO4和MnSO4·H2O的復(fù)合鹽為最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

首先對(duì)B. subtilis ZX-29菌株不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行芽孢計(jì)數(shù)，結(jié)果表明其發(fā)酵48 h時(shí)的芽孢產(chǎn)率達(dá)到90%以上，從而以發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進(jìn)行正交分析。由表1可見(jiàn)，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基最佳成分組成為：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

以B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進(jìn)行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，B. subtilis ZX-29菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色結(jié)果

按以上優(yōu)化條件對(duì)B. subtilis ZX-29菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定其總生物量，并對(duì)所得芽孢進(jìn)行孔雀綠染色和結(jié)晶紫染色觀察。觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：發(fā)酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢數(shù)量達(dá)到6.4×109個(gè)/mL，芽孢產(chǎn)率為97.61%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)比較B. subtilis ZX-29在不同條件下的芽孢產(chǎn)率，從而確定了該菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳條件為：培養(yǎng)基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培養(yǎng)條件：pH 8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時(shí)間48 h。優(yōu)化后的芽孢產(chǎn)率達(dá)到97.61%。最終生物量為6.4×109個(gè)/mL。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)一些拮抗菌、益生菌等的產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化進(jìn)行了多年研究，已達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。并且通過(guò)多年研究可知，某些條件的刺激也有可能導(dǎo)致芽孢快速生成，比如突然降溫、靜置、添加固體介質(zhì)等，但本研究中未進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，將在以后進(jìn)行相關(guān)方面的研究，進(jìn)一步完善試驗(yàn)結(jié)果，以便更快、更好地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 王 陶，李 文，袁佩佩.中性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2012，33（1）：120-124.

[3] 李 文，王 陶.酸性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究[J].食品科學(xué)，2011，32（5）：228-233.

[4] 蔣治國(guó).植酸酶的研究進(jìn)展及其在飼料中的應(yīng)用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（8）：37-40.

[5] EDWARD J，MULIANEY H J. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2000，168（4）：35-36.

[6] 于 平 陳益潤(rùn). 高產(chǎn)耐熱型植酸酶菌株 ZJ0702 發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（3）：98-103.

[7] 覃擁靈，何海燕. 產(chǎn)植酸酶菌種的選育及發(fā)酵條件初步研究[J].廣西輕工業(yè)，2011（8）：14-16.

[8] 王亞茹，姚 斌，曾 虹.枯草芽孢桿菌中性植酸酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)報(bào)，2001，41（2）：198-203.

[9] 王文君，黃梅娜，夏延國(guó)，等.產(chǎn)中性植酸酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2011（7）：89-93.

[10] 黃魁英，夏楓耿，黃樂(lè)天，等.耐高溫植酸酶畢赤酵母工程菌發(fā)酵中試條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技，2011，21（10）：1238-1241.

[11] 沈莎莎，楊紅建，張曉明.瘤胃微生物植酸酶的分類與酶學(xué)性質(zhì)研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（12）：1655-1660.

[12] 于 平，陳益潤(rùn).響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（3）：86-90.

[13] 李術(shù)娜，王樹(shù)香，王占利，等.大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌B. subtilis LZ2-70產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化[J].棉花學(xué)報(bào)，2009，21（4）：307-312.

[14] 程麗娟，薛泉宏，來(lái)航線.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].西安：世界圖書(shū)出版公司，2000.

[15] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖3可看出，不同的無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)芽孢形成的影響差異較大。B. subtilis ZX-29在培養(yǎng)72 h時(shí)，KH2PO4試驗(yàn)組中芽孢產(chǎn)率可達(dá)95.57%；銅鹽組中則既沒(méi)有菌體存在也無(wú)芽孢形成；MnSO4·H2O作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，其芽孢生成率也較高，可達(dá)到93.51%。試驗(yàn)結(jié)果顯示KH2PO4為B. subtilis ZX-29菌株產(chǎn)芽孢的最佳無(wú)機(jī)鹽。但由于用KH2PO4做無(wú)機(jī)鹽時(shí)，雖然芽孢產(chǎn)率較高，但菌體的生長(zhǎng)狀況欠佳，而以MnSO4·H2O作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，其芽孢產(chǎn)率較高，菌體生長(zhǎng)狀況也較好，故B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽采用KH2PO4和MnSO4·H2O的復(fù)合鹽為最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

首先對(duì)B. subtilis ZX-29菌株不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行芽孢計(jì)數(shù)，結(jié)果表明其發(fā)酵48 h時(shí)的芽孢產(chǎn)率達(dá)到90%以上，從而以發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進(jìn)行正交分析。由表1可見(jiàn)，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基最佳成分組成為：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

以B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進(jìn)行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，B. subtilis ZX-29菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色結(jié)果

按以上優(yōu)化條件對(duì)B. subtilis ZX-29菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定其總生物量，并對(duì)所得芽孢進(jìn)行孔雀綠染色和結(jié)晶紫染色觀察。觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：發(fā)酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢數(shù)量達(dá)到6.4×109個(gè)/mL，芽孢產(chǎn)率為97.61%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)比較B. subtilis ZX-29在不同條件下的芽孢產(chǎn)率，從而確定了該菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳條件為：培養(yǎng)基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培養(yǎng)條件：pH 8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時(shí)間48 h。優(yōu)化后的芽孢產(chǎn)率達(dá)到97.61%。最終生物量為6.4×109個(gè)/mL。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)一些拮抗菌、益生菌等的產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化進(jìn)行了多年研究，已達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。并且通過(guò)多年研究可知，某些條件的刺激也有可能導(dǎo)致芽孢快速生成，比如突然降溫、靜置、添加固體介質(zhì)等，但本研究中未進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，將在以后進(jìn)行相關(guān)方面的研究，進(jìn)一步完善試驗(yàn)結(jié)果，以便更快、更好地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

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