遠(yuǎn)婷+劉遠(yuǎn)林+陳希元

摘要：為測(cè)試酵母葡聚糖遺傳毒性，為酵母葡聚糖的安全性以及毒性機(jī)制提供有益的借鑒，試驗(yàn)以成年SD大鼠和SPF-KM小鼠為研究對(duì)象，以鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)綜合評(píng)估酵母葡聚糖遺傳毒性。結(jié)果表明，酵母葡聚糖在上述試驗(yàn)中均表現(xiàn)陰性結(jié)果，均無(wú)致突變性，因而沒(méi)有呈現(xiàn)出顯著的遺傳毒性。說(shuō)明酵母葡聚糖對(duì)正常狀態(tài)的細(xì)胞沒(méi)有遺傳毒性作用。在該試驗(yàn)條件下，可以初步認(rèn)為在推薦劑量?jī)?nèi)使用酵母葡聚糖是安全可靠的。

關(guān)鍵詞：酵母葡聚糖；遺傳毒性；安全性

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0142-04

Study on Genetic Toxicity of Yeast Glucan

YUAN Ting，LIU Yuan-lin，CHEN Xi-yuan

（Zhangjiakou College，Zhangjiakou 075000，Hebei，China）

Abstract： With SD adult rats and SPF-KM mouse as subjects， the genetic toxicity of yeast glucan were evaluated though Ames test， micronucleus test and sperm shape abnormality test. The results showed that the above tests for yeast glucan were all negative and it had no mutagenicity. It indicated that the yeast glucan had no genetic toxicity effect on normal cells. The utilization of yeast glucan were safe and reliable in recommended dose.

Key words： yeast glucan； genetic toxicity； safety

收稿日期：2013-06-19

基金項(xiàng)目：河北省張家口市科技局青年基金項(xiàng)目（zjkkj-2012-067）

作者簡(jiǎn)介：遠(yuǎn) 婷（1983-），女，河北張家口人，講師，碩士，主要從事生物專業(yè)教學(xué)與研究工作，（電話）15830375291（電子信箱）

yuantingting2013@163.com。

酵母葡聚糖為一種多糖，分子呈三重超微螺旋狀，存在于酵母細(xì)胞壁中，可以從酵母中提取而來(lái)[1]。已有研究表明，酵母葡聚糖能夠激活人體內(nèi)的IgM抗體，發(fā)揮比較顯著的免疫活性，應(yīng)用于人類腫瘤、創(chuàng)傷恢復(fù)以及感染病的治療[2]；酵母葡聚糖還能有效改善血脂指數(shù)，降低人類心腦血管和冠心病等疾病的患病率[3，4]；此外，酵母葡聚糖還可以通過(guò)激活紅細(xì)胞、單核白細(xì)胞和粒細(xì)胞的生成，抵御輻射源的損害；還能增強(qiáng)人體消化功能[5，6]。近年來(lái)，作為一種效果顯著、毒副作用較小的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，酵母葡聚糖已經(jīng)在不少領(lǐng)域（食品、醫(yī)藥及保健品）得到推廣應(yīng)用[7]。當(dāng)前，中國(guó)有關(guān)酵母葡聚糖生產(chǎn)工藝以及抑菌、免疫學(xué)的研究取得了不少成果，但有關(guān)其遺傳毒性的研究報(bào)道較少。本研究以酵母葡聚糖為受試物，以成年SD大鼠和SPEKM小鼠作為研究對(duì)象，以鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）、骨髓微核試驗(yàn)以及精子畸形試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)酵母葡聚糖遺傳毒性，旨在為系統(tǒng)研究酵母葡聚糖的安全性及毒性機(jī)制提供有益的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

50日齡170 g左右成年SD大鼠及50日齡20 g左右清潔級(jí)SPF-KM小鼠，購(gòu)自河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)部動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所，正常飼喂，室溫與相對(duì)濕度保持正常，并隨時(shí)觀察其健康狀況。

1.2 藥物和試劑

小牛血清（Deproteinised calf blood lnjection），購(gòu)自錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司；注射用環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide），購(gòu)自上海研晶實(shí)業(yè)有限公司；伊紅染色液（Eosin staining solution），購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司；吉姆薩染液及吉姆薩應(yīng)用液（Giemsa stain），購(gòu)自上海百威靈化工商貿(mào)有限責(zé)任公司；酵母葡聚糖（Dextran），購(gòu)自徐州賽傅生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基與菌株

頂層瓊脂培養(yǎng)基、底層瓊脂平板培養(yǎng)基（用于Ames試驗(yàn)）、普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基（NutrientAgar）。鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102（上海北諾生物科技有限公司）。

1.4 Ames試驗(yàn)

通過(guò)多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)法，獲取被試大鼠肝微粒體酶（S-9），與輔助因子（0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液、1.65 mol/L氯化鉀溶液及0.4 mol/L氯化鎂溶液等）配制濃度為10%的S-9混合液作為體外代謝活化系統(tǒng)。

以鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102作為試驗(yàn)用菌株，分別在加S-9混合液與不加S-9混合液條件下進(jìn)行平皿摻入試驗(yàn)，試驗(yàn)菌株先進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后與不同劑量的酵母葡聚糖（加或不加S-9混合液）在頂層培養(yǎng)基充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上， 轉(zhuǎn)動(dòng)平板， 使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后， 倒置于37 ℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[8]。

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)酵母葡聚糖劑量組，即200、500、1 000、2 500、5 000 μg/皿，每個(gè)劑量組均做3個(gè)平行平板。同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組（生理鹽水）、空白對(duì)照組（自發(fā)回變）以及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照組。其中，加S-9混合液的陽(yáng)性對(duì)照組的誘變劑：TA97、TA98及TA100為2-氨基芴，TA102為1，8-二羥基蒽醌；不加S-9混合液的陽(yáng)性對(duì)照組的誘變劑：TA97為瘧的平、TA98為正定霉素，TA100和TA102為甲基磺酸甲酯。

1.5 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

選擇50日齡20 g左右清潔級(jí)SPF-KM小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)72 h之后，隨機(jī)分5組，每組10 只，雌雄各半。酵母葡聚糖低、中、高劑量處理組分別按1 000、2 500、5 000 mg/kg體重的劑量腹腔注射酵母葡聚糖；陽(yáng)性對(duì)照組以40 mg/kg體重的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺；陰性對(duì)照組以蒸餾水分2次灌胃，劑量控制在25 mL/kg體重，每次間隔時(shí)間為24 h。在末次給藥后6 h，以頸椎脫臼法處死被試小鼠并解剖，取其胸骨骨髓懸于小牛血清，以常規(guī)方法涂片染色，在油鏡下鏡檢，以有核細(xì)胞形態(tài)完好作為微核發(fā)生率計(jì)算依據(jù)，計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）含微核的PCE數(shù)，并且計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE與RBC（紅細(xì)胞）的比值。

1.6 小鼠精子畸形試驗(yàn)

選擇50日齡20 g左右清潔級(jí)SPF-KM小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)72 h之后，隨機(jī)分5組，每組10 只，雌雄各半。試驗(yàn)組：受試小鼠連續(xù) 5 d以不同劑量的酵母葡聚糖（低、中、高劑量組分別為1 000、

2 500、5 000 mg/kg體重）灌胃；陰性對(duì)照組：連續(xù)5 d以蒸餾水按20 mL/kg體重灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組：連續(xù)5 d以 40 mg/kg體重的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺。在注射或灌注受試藥物后35 d，以頸椎脫臼法處死被試小鼠，剝離其附睪置于裝有1 mL生理鹽水的燒杯中，以眼科剪縱向剪2 刀，吸濾液涂片、固定、染色。光學(xué)顯微鏡鏡檢，每只被試小鼠鏡檢1 000 個(gè)精子，并計(jì)算其畸形率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果

在試驗(yàn)過(guò)程中，各個(gè)劑量組與對(duì)照組均可見(jiàn)有背景菌生長(zhǎng)，并且未發(fā)生污染。培養(yǎng)基中若存在致突變物，則菌株會(huì)表現(xiàn)出野生型回復(fù)突變。因此回復(fù)突變菌落數(shù)可以表明受試物是否是突變菌落的誘因。不同劑量酵母葡聚糖Ames試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，無(wú)論加還是不加S-9混合液，酵母葡聚糖各劑量組中其回變菌落數(shù)均基本無(wú)變化，與溶劑對(duì)照組相當(dāng)，而陽(yáng)性對(duì)照組數(shù)值則遠(yuǎn)高于其他組別。文獻(xiàn)表明，受試樣品的回變菌落數(shù)如果增加至溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系者，則可判定為具備了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽(yáng)性反應(yīng)。而表1中受試物各劑量組數(shù)據(jù)與溶劑對(duì)照組相比均未出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)，因此可以判定酵母葡聚糖Ames試驗(yàn)中不存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明酵母葡聚糖對(duì)TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株均無(wú)致突變性，沒(méi)有呈現(xiàn)出顯著的遺傳毒性。

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的目的是檢測(cè)被試小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變情況，如果骨髓細(xì)胞遭到有毒物質(zhì)的干擾，會(huì)出現(xiàn)微核，染色后微核即可與正常細(xì)胞相區(qū)分，從而檢測(cè)出微核率，微核率即可作為細(xì)胞毒性的主要指標(biāo)。試驗(yàn)期內(nèi)，各組試驗(yàn)動(dòng)物均未有死亡。不同劑量酵母葡聚糖灌胃后小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組PCE細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），而酵母葡聚糖不同劑量組小鼠PCE細(xì)胞微核率未發(fā)生明顯變化，均與陰性對(duì)照組接近，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。各組PCE/RBC比值均與陰性對(duì)照組接近，表明酵母葡聚糖對(duì)各組小鼠均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

小鼠精子畸形試驗(yàn)的目標(biāo)是檢驗(yàn)酵母葡聚糖的生殖細(xì)胞致突變作用。被試精子如果發(fā)生畸變則表明小鼠基因突變。小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，與陰性對(duì)照組比較，酵母葡聚糖各劑量組精子畸形率差異均不顯著。一般來(lái)講，小鼠精子的畸形率正常范圍為0.8%～3.5%[9]。由此可判定被試小鼠精子畸形率均在正常范圍內(nèi)，且未受酵母葡聚糖劑量的影響，無(wú)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

3 小結(jié)與討論

在檢測(cè)化學(xué)物或藥物等物質(zhì)致突變性的方法中，Ames試驗(yàn)由于其快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)而使用最多。微核廣泛存在于細(xì)胞的主核之外，相關(guān)研究表明，微核為細(xì)胞個(gè)體由于染色體發(fā)生斷裂而在其有絲分裂階段出現(xiàn)在核外的物質(zhì)，這種物質(zhì)與生物的染色體畸變呈高度相關(guān)[9-11]。PCE細(xì)胞指的是細(xì)胞個(gè)體在最后一次分裂的時(shí)候被排出細(xì)胞核的還沒(méi)有成熟的細(xì)胞，這種細(xì)胞中有微核的存在，所以在試驗(yàn)和測(cè)試中往往以被試動(dòng)物的微核率來(lái)判定染色體畸變是否顯著，進(jìn)而以此作為被試物是否對(duì)動(dòng)物個(gè)體產(chǎn)生了突變作用的依據(jù)；來(lái)自外界的化學(xué)物質(zhì)的致突變影響往往首先表現(xiàn)在動(dòng)物的生殖系統(tǒng)中，哺乳動(dòng)物的生殖腺對(duì)化學(xué)毒物的致突變作用反應(yīng)明顯，因此可以把被試動(dòng)物的精子畸形率作為致突變作用的測(cè)量依據(jù)[12，13]。本研究從Ames試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)幾方面來(lái)評(píng)價(jià)酵母葡聚糖對(duì)原核細(xì)胞、體細(xì)胞、生殖細(xì)胞的遺傳毒性。這3項(xiàng)試驗(yàn)也是《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)[14]。本研究結(jié)果表明，酵母葡聚糖在200、500、1 000、2 500、5 000 μg/皿受試劑量下，無(wú)論加不加S-9混合液，各劑量組回變菌落數(shù)均無(wú)明顯變化，與溶劑對(duì)照組接近，而陽(yáng)性對(duì)照組相應(yīng)數(shù)值則遠(yuǎn)高于其他組別，表明酵母葡聚糖在受試濃度下沒(méi)有呈現(xiàn)出顯著的遺傳毒性，鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)不存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；酵母葡聚糖在1 000、2 500、5 000 mg/kg體重劑量水平下，各組被試動(dòng)物PCE細(xì)胞微核率均無(wú)顯著差異，且與陰性對(duì)照組接近，沒(méi)有明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系，無(wú)誘發(fā)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的效應(yīng)；酵母葡聚糖對(duì)精子的致畸率均在正常范圍，各劑量組精子畸形率差異均不顯著。綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，可以初步認(rèn)為在推薦劑量?jī)?nèi)使用酵母葡聚糖是安全可靠的。

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