林立紅，于 巍，孟慶賀，孫常松，李曉磊，湯保華，段明郁

(沈陽化工研究院有限公司安全評價中心，遼寧沈陽 110021)

氨氟樂靈在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)

林立紅，于 巍，孟慶賀，孫常松，李曉磊，湯保華，段明郁

(沈陽化工研究院有限公司安全評價中心，遼寧沈陽 110021)

目的 建立大鼠血漿中氨氟樂靈(PDM)及其代謝產(chǎn)物2,4-二硝基-N3-丙基-6-三氟甲基-1,3-苯二胺(DTB)的分析方法,進行氨氟樂靈大鼠體內(nèi)毒代動力學(xué)研究。方法 分別采用ig(100 mg·kg－1, 1000 mg·kg－1)和iv(100 mg·kg－1)單次給予雄性SD大鼠PDM,應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS/MS)測定大鼠血漿中PDM和DTB的含量,采用DAS軟件擬合毒代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 單次ig給予PDM 100 mg·kg－1, PDM和DTB的主要毒代動力學(xué)參數(shù)分別為:曲線下面積〔AUC(0－t)〕分別為2715±102和(6845±316)μg·h·L－1；半衰期(t1/2z)分別為9.0±1.4和(7.1±1.3)h；達峰時間(Tmax)分別為7.0±1.6和(7.0±0.0)h；峰值濃度(cmax)分別為146±51和(473±103)μg·L－1。單次ig給予PDM 1000 mg·kg－1,PDM和DTB的主要毒代動力學(xué)參數(shù)分別為:AUC(0－t)分別為3401±242和(10364±573)μg·h·L－1；t1/2z分別為8.8±2.1和(6.0±1.8)h；Tmax均為(7.0± 1.6)h；cmax分別為175±56和(586±152)μg·L－1。PDM在大鼠體內(nèi)的絕對生物利用度分別為44.9% (100 mg·kg－1)和17.1%(1000 mg·kg－1)。結(jié)論 該LC-MS/MS分析方法適用于大鼠血漿中PDM和DTB的測定。PDM和DTB在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)過程具有非線性動力學(xué)性質(zhì)。

氨氟樂靈；2,4-二硝基-N3-丙基-6-三氟甲基-1,3-苯二胺；毒代動力學(xué)

氨氟樂靈(prodiamine，PDM)化學(xué)名為2，4-二硝基-N3，N3-二丙基-6-三氟甲基-1，3-苯二胺(圖1A)。PDM是1986年由日本Sandoz Crop Protection公司開發(fā)的二硝基苯胺類出芽前除草劑，其主要作用方式為抑制紡錘體的形成，從而抑制細胞分裂、根系和芽的生長，為選擇性芽前土壤處理劑[1－2]。PDM主要用于大豆、棉花、觀賞性植物、蕓苔作物和胡蘿卜等植物的一年生雜草的防治和消除[3]。PDM原藥大鼠(雄/雌)急性經(jīng)口LD50＞5000 mg·kg－1，屬于低毒農(nóng)藥，其對家兔眼睛有輕微刺激作用、對皮膚無刺激性、對豚鼠皮膚為I級弱致敏物[1]。有關(guān)PDM原藥及殘留等的分析已有報道[4－8]，但PDM在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)研究至今未見文獻報道，本文建立了PDM原藥及代謝產(chǎn)物N-去丙基化合物2，4-二硝基-N3-丙基-6-三氟甲基-1，3-苯二胺(2，4-dinitro-N3-propyl-6-trifluoromethyl-1，3-benzenediamine，DTB；圖1B)血漿樣品的LC-MS/MS分析方法，將該方法應(yīng)用于毒代動力學(xué)研究，為該農(nóng)藥的毒性安全評價提供科學(xué)依據(jù)，并為該農(nóng)藥風(fēng)險評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

Fig.1 Structure of prodiamine(PDM，A)and 2，4-dinitro-N3-propyI-6-trifIuoromethyI-1，3-benzenediamine (DTB，B)

1 材料與方法

1.1 試劑

PDM原藥(96.0%)由沈陽化工研究院新藥所提供，PDM(98.1%)和DTB標樣(98.8%)由沈陽化工研究院農(nóng)標所提供；利血平標樣(99.8%，內(nèi)標)由北京盛世康普化工技術(shù)研究院提供；乙腈，色譜純，批號8277029，購自美國Dikma公司；甲醇，色譜純，批號110301，購自美國Fisher Scientific公司；超純水由Milli-Q Reference純水系統(tǒng)制備；乙酸銨，色譜純，批號1392584，購自德國Fluka公司；DMSO，色譜純，批號08100317，購自國藥集團；CO2，麻醉用；玉米油，金龍魚牌非轉(zhuǎn)基因油。

1.2 儀器

LC-20A/API3200液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津公司/美國AB公司)，配備Analyst1.5.1軟件(美國AB公司)；DAS 2.1.1軟件(由上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物臨床研究中心編制)；T18型勻質(zhì)機(德國IKA公司)；BP211D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；3K15型高速離心機(德國Sigma公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；實驗室常規(guī)玻璃儀器。

1.3 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜柱:Phenomenex Luna 5 μm C18(2)100 A，50 mm×4.6 mm；流速:0.6 mL·min－1；柱溫:室溫；進樣體積:10 μL；PDM RT:2.9 min，DTB RT: 2.3 min，流動相:A相 2 mmol·L－1乙酸銨水溶液；B相乙腈；梯度洗脫程序:0.5 min時A∶B(30∶70)，1.5 min時A∶B(5∶95)，3.4 min時A∶B(30∶70)。質(zhì)譜條件，離子源:ESI源；離子源溫度:500℃；噴霧電壓:－4500 V；CAD:5.00；DP:－35.00 V；EP:－2.00 V；CXP:－4.00；GAS1:50.00；GAS2: 55.00；氣簾氣:20.00；檢測方式:MRM；定量離子對:PDM 349.00/232.00，CE:－35，CEP:－32.3；DTB 306.90/203.90，CE:－35，CEP:－31.16；利血平607.6/210.8，CE:－20，CEP:－39.28。

1.4 動物及分組處理

15只SD雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號: SCXK(京)2012-0001。動物室溫度(22.5±3.5)℃，濕度:40%～70%，照明:150～300 Lux(明暗各12 h)，噪聲＜60 dB。動物飼料為全價顆粒飼料，飼養(yǎng)于塑料動物盒內(nèi)，自由進食飲水。大鼠引入后適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，每只大鼠飼養(yǎng)于一個代謝籠內(nèi)，染毒前禁食約18 h。分為ig給PDM 100和1000 mg·kg－1及iv給PDM 100 mg·kg－1組，每組5只。

1.5 血漿樣品采集及處理

ig染毒組分別于染毒前和染毒后10，30 min，1，2，4，7，24，31和48 h采集血樣。iv染毒組于染毒前和染毒后10，20 min，1，2，4，6，23和27 h采集血樣。血樣采集方式為大鼠眼眶靜脈叢采血，每個時間點采集全血約200 μL。血液用肝素抗凝，11 680×g，離心10 min，取上層血漿，－20℃冷凍。取大鼠血漿50 μL于1.5 mL EP管中，加入200 g·L－1的利血平內(nèi)標液10 μL，然后加入100 μL甲醇，渦旋混勻1 min，21 900×g，離心10 min，取上清液適量，加入相同體積的超純水，渦旋混勻后進行儀器分析。超過定量上限的樣品，用空白血漿稀釋到線性范圍內(nèi)進行分析。

1.7 PDM和DTB標準曲線的制備

準確稱取PDM和DTB標樣于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1.00 g·L－1的標準儲備液。用乙腈將標準儲備液逐級稀釋成100，200，400，800，2000，8000和10 000 μg·L－1的標準曲線工作溶液。精密量取空白大鼠血漿190 μL于帶蓋的 1.5 mL EP管中，加入標準曲線工作溶液10 μL，渦旋混勻，配制成標準曲線樣品，濃度分別為5.00(最低定量限)，10.0，20.0，40.0，100，400和500 μg·L－1。按 1.6項的方法預(yù)處理后進行LC-MS/MS分析，分別以PDM和DTB的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值(y)對濃度(x)進行加權(quán)(1/x2)線性回歸，計算校正標準曲線方程。

1.8 PDM和DTB在血漿中的回收率和精密度考察

用乙腈將標準儲備液逐級稀釋成200，1000和8000 μg·L－1的質(zhì)控樣品工作溶液，用空白大鼠血漿稀釋質(zhì)控樣品工作溶液，配制成考察回收率與精密度的質(zhì)控樣品，濃度分別為10.0，50.0和400 μg·L－1，每個濃度平行配制5份，按1.6項的方法預(yù)處理后進行LC-MS/MS分析，通過線性方程計算質(zhì)控樣品樣品的濃度，以檢測濃度與理論濃度之比計算回收率，精密度用質(zhì)控樣品樣品測定濃度的日內(nèi)和日間相對標準差(RSD)表示。

1.9 PDM和DTB在血漿中的穩(wěn)定性考察

用空白大鼠血漿稀釋質(zhì)控樣品工作溶液，配制成考察穩(wěn)定性的質(zhì)控樣品，濃度分別為10.0，50.0和400 μg·L－1，每個濃度平行配制12份，其中3份在室溫下放置6 h后再經(jīng)血漿樣品預(yù)處理方法處理后進行分析，考察室溫穩(wěn)定性；3份保存于－20℃冰箱中冷凍7 d后預(yù)處理進行分析，考察冷凍穩(wěn)定性；3份預(yù)處理后進樣器中保存24 h后進行分析，考察預(yù)處理后穩(wěn)定性；最后3份－20℃冰箱冷凍后，室溫自然解凍，冷凍與解凍循環(huán)3次，分析考察凍融穩(wěn)定性。穩(wěn)定性樣品按1.6項的方法預(yù)處理后進行LC-MS/MS分析，通過計算穩(wěn)定性樣品測定濃度的平均值與理論濃度的百分比來考察血漿樣品的穩(wěn)定性。

1.10 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

用DAS Ver2.1.1軟件對血漿濃度數(shù)據(jù)進行擬合，計算毒代動力學(xué)參數(shù)和進行統(tǒng)計分析，采用梯形法計算AUC，cmax與Tmax均為實測值。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS分析方法驗證

Fig 2. LC-MS/MS chromatograms of prodiamine(PDM)and 2，4-dinitro-N3-propyI-6-trifIuoromethyI-1，3-benzenediamine(DTB)in rat pIasma.A:chromatogram of blank plasma；B:chromatogram of blank plasma spiked with PDM，DTB and internal standard；C:chromatogram of plasma after administration of PDM(iv 100 mg·kg－1，2 h).Peak 1:DTB；Peak 2:internal standard；Peak 3:PDM.

LC-MS/MS測定得到的色譜圖(圖2)顯示，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對PDM和DTB的分析沒有影響，此方法的特異性良好。PDM和DTB的保留時間分別為2.9和2.3 min，此分析方法對PDM和DTB的最小檢出量為5.0×10－11g，最小檢出濃度為5.00 μg·L－1。當PDM和DTB標準曲線濃度范圍在5.00～500 μg·L－1范圍內(nèi)時，PDM典型回歸方程為y＝0.0108x＋0.0169，r＝0.9975；DTB典型回歸方程為y＝0.00361x＋0.00592，r＝0.9971，回歸方程相關(guān)性良好。

如表1所示，3個批次3個濃度PDM的質(zhì)控樣品的回收率在100.4%～101.0%之間，批內(nèi)精密度在1.7%～7.2%之間，批間精密度在1.6%～2.6%之間；3個批次3個濃度DTB的質(zhì)控樣品的回收率在98.6%～100.7%之間，批內(nèi)精密度在1.3%～7.9%之間，批間精密度在0.3%～2.6%之間。

Tab.1 Recovery and precision of PDM and DTB in rat pIasma

如表2所示，PDM和DTB在室溫放置6 h、－20℃冷凍7 d、3次凍融、預(yù)處理后進樣器中保存24 h等條件下，穩(wěn)定性樣品測定濃度與理論濃度百分比在83.7%～98.8%之間，各濃度相對標準差＜10%。

Tab.2 StabiIity of PDM and DTB in rat pIasma

2.2 PDM和DTB的藥時曲線及毒代動力學(xué)參數(shù)

圖3A為ig給PDM 100和1000 mg·kg－1后的藥物濃度-時間曲線，ig給藥后，PDM和DTB在大鼠體內(nèi)7 h達峰(cmax)，48 h時血漿中 PDM和DTB濃度已經(jīng)低于cmax的5%。圖3B為iv給PDM 100 mg·kg－1后的藥時曲線，iv給藥后，DTB在大鼠體內(nèi)20 min達峰(cmax)，23 h時血漿中PDM和DTB濃度已經(jīng)低于cmax的5%。

Fig.3 Concentration-time curves of PDM and DTB after a singIe dose of PDM with different administration determined by LC-MS/MS given ig(A)or iv(B).n＝5.

經(jīng)DAS Ver2.1.1軟件處理，用統(tǒng)計距模型計算，主要動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表3。PDM經(jīng)口染毒和靜脈注射染毒后10 min血漿中就可檢出代謝產(chǎn)物DTB，表明原形藥物在大鼠體內(nèi)可迅速代謝為DTB；PDM半衰期較代謝產(chǎn)物DTB長，同時表觀分布容積較代謝產(chǎn)物大，表明PDM比DTB消除慢且分布較廣；隨給藥劑量的提高，PDM 1000 mg·kg－1的cmax相對于給藥劑量卻較低，提示PDM高劑量組存在吸收飽和現(xiàn)象，PDM 100和1000 mg·kg－1組濃度-時間曲線下面積〔AUC(0－t)〕分別為2715±102和(3401±242)μg·h·L－1，隨著劑量的增加，AUC和給藥劑量的比值減小，而二者的MRT基本相同，說明藥物吸收過程出現(xiàn)了飽和。經(jīng)計算PDM 100和1000 mg·kg－1劑量在大鼠體內(nèi)的絕對生物利用度分別為44.9%和17.1%。

Tab.3 Toxicokinetic parameters of PDM and DTB

3 討論

采用C18色譜柱進行PDM和DTB血漿樣品的分析，流動相采用乙腈和水，梯度洗脫，結(jié)果PDM響應(yīng)太低，定量限(信噪比為10)為50 μg·L－1，無法滿足毒代生物樣品測定要求，嘗試向水相中加入乙酸銨，當乙酸銨濃度為2 mmol·L－1時，PDM響應(yīng)大大提高，定量限為5 μg·L－1，DTB響應(yīng)也隨之提高，因此，采用2 mmol·L－1的乙酸銨水溶液和乙腈為流動相檢測PDM及其代謝物DTB。經(jīng)驗證，PDM和DTB檢測方法的各項指標符合生物樣品分析指導(dǎo)原則對分析測定方法的要求。

美國EPA(68D80056)登記資料顯示，PDM在大鼠體內(nèi)可經(jīng)N脫烷基作用生成N，N-去二丙基化合物(M1)；還可經(jīng)環(huán)化作用生成N-丙基苯并咪唑A (M2)和N-丙基苯并咪唑B(M3)，M3可進一步經(jīng)硝基還原、N-脫烷基和環(huán)的羥化作用生成羥化苯并咪唑(M4)。本研究發(fā)現(xiàn)了文獻未見報道的代謝產(chǎn)物N-去丙基化合物DTB，DTB與M1結(jié)構(gòu)相近，M1為N位上的2個丙基全部脫去，而DTB為N位上僅脫去1個丙基的代謝產(chǎn)物。經(jīng)質(zhì)譜二級碎片比對，DTB與PDM大部分碎片相同，并且在給藥后的大鼠血漿中也檢測到了代謝物DTB，說明DTB為PDM在大鼠體內(nèi)生成的代謝產(chǎn)物。毒代動力學(xué)參數(shù)表明，PDM能迅速吸收入血，快速代謝為DTB，隨后緩慢分布，快速消除。隨著劑量的增加，原形及代謝產(chǎn)物的cmax和AUC并未成比例增加，說明高劑量出現(xiàn)吸收飽和現(xiàn)象。在毒性劑量下，PDM和DTB在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)過程具有非線性動力學(xué)性質(zhì)。

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Toxicokinetics of prodiamine in rats

LIN Li-hong，YU Wei，MENG Qing-he，SUN Chang-song，LI Xiao-lei，TANG Bao-hua，DUAN Ming-yu
(Safety Evaluation Center，Shenyang Research Institute of Chemical Industry，Shenyang110021，China)

OBJECTIVE To develop an LC-MS/MS method for simultaneous determination of prodamine(PDM)and its metabolite 2，4-dinitro-N3-propyl-6-trifluoromethyl-1，3-benzenediamine(DTB)in rat plasma in order to study toxicokinetics of PDM in rats.METHODS SD male rats were administered a single dose of PDM(ig:100 and 1000 mg·kg－1；iv:100 mg·kg－1).LC-MS/MS method was used to determine PDM and DTB in rat plasma.Toxicokinetic parameters were fitted using DAS Ver2.1.1. RESULTS After ig administration of PDM 100 mg·kg－1，the parameters of PDM and DTB were as follows:AUC(0－t)was 2715±102 and(6845±316)μg·h·L－1，t1/2zwas 9.0±1.4 and(7.1±1.3)h，Tmaxwas 7.0± 1.6 and(7.0±0.0)h，cmaxwas 146±51 and(473±103)μg·L－1.After ig administration of PDM 1000 mg·kg－1，the parameters of PDM and DTB were as follows:AUC(0－t)was 3401±242 and(10364± 573)μg·h·L－1，t1/2zwas 8.8±2.1 and(6.0±1.8)h，Tmaxwas(7.0±1.6)h，cmaxwas 175±56 and(586± 152)μg·L－1.The absolute bioavailability of PDM was 44.9%(100 mg·kg－1)and 17.1%(1000 mg·kg－1). CONCLUSION This method is suitable for the analysis of PDM and DTB in rat plasma.There is evidence that PDM and DTB display nonlinear toxicokinetic characteristics in the studied dose range.

prodiamine；2，4-dinitro-N3-propyl-6-trifluoromethyl-1，3-benzenediamine；toxicokinetics

LIN Li-hong，E-mail:linlihong＠sinochem.com，Tel:(024)62353405

R969.1

:A

:1000-3002(2014)06-0887-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.011

Foundation item:The project supported by National Key Technology R＆D Program of China(2011BAE06B09)

2014-03-14 接受日期:2014-08-30)

(本文編輯:喬 虹)

國家科技攻關(guān)計劃(2011BAE06B09)

林立紅(1981－)，女，工程師，在讀博士研究生，主要從事醫(yī)藥、農(nóng)藥及化學(xué)品的毒代動力學(xué)研究。

林立紅，E-mail:linlihong＠sinochem.com，Tel:(024)62353405