董會，李彩霞，王晶，賈竟，劉超

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣州510515；2.公安部物證鑒定中心，北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，北京100038；3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)實驗室，鄭州450000）

·技術(shù)方法·

一種快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的探究和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

董會1，李彩霞2，王晶2，賈竟3，劉超1

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣州510515；2.公安部物證鑒定中心，北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，北京100038；3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)實驗室，鄭州450000）

目的優(yōu)化和建立一套快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增體系和程序，縮短擴增時間，提高短串聯(lián)重復(fù)序列分型的速率和辦案效率。方法運用AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒和7種快速擴增酶進行篩選和優(yōu)化，最后對篩選出的酶優(yōu)化其擴增體系和擴增程序，并對幾種常規(guī)檢材中提取的DNA進行擴增和檢測，然后對其分型結(jié)果進行驗證和討論。結(jié)果最終優(yōu)化的擴增程序由常規(guī)的3 h左右縮短至24 min，DNA檢驗結(jié)果與常規(guī)方法一致。結(jié)論應(yīng)用優(yōu)化后的快速PCR擴增體系可以成功準(zhǔn)確擴增DNA樣本，顯著提高DNA分型速率。

法醫(yī)學(xué)；快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；復(fù)合短串聯(lián)重復(fù)序列

生物物證的DNA檢驗在公安辦案實踐中發(fā)揮著舉足輕重的作用，案（事）件尤其是一些大要案往往要求在極短時間甚至在現(xiàn)場就提供檢驗結(jié)果，為案（事）件的快速處置、偵查訴訟等提供及時的線索和證據(jù)。目前，生物物證常規(guī)檢測步驟包括DNA提取、定量、復(fù)合短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）擴增、電泳檢測等，最終獲得常染色體或Y染色體STR分型，整個過程大致需要10～12 h。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）一般需要3 h左右，是生物物證檢驗的一個重要限速過程［1］。如果能將此過程進一步縮短，將會顯著提升物證檢驗的速度，提高法醫(yī)檢驗的效率，滿足案件偵查和訴訟對于時效性的要求，提升生物物證的證據(jù)價值和證明力，為公安機關(guān)進行PCR擴增提供便利。

快速PCR就是基于普通PCR的工作原理，在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏度和保真度的前提下，在更短時間內(nèi)完成對核酸分子的擴增［2］。近年來，快速PCR主要從3個方面分別進行了研發(fā)：聚合酶的改進、添加劑的研發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造［3］?？焖贁U增DNA聚合酶以及快速升/降溫速率的PCR擴增儀［4］的出現(xiàn)，使快速PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中大規(guī)模應(yīng)用成為可能?？焖貾CR技術(shù)在核基因組DNA和線粒體DNA的相關(guān)研究［5］中均占據(jù)重要位置。本文以當(dāng)前法醫(yī)DNA實驗室常用的STR復(fù)合擴增試劑［6］和快速擴增酶為主要研究對象，建立了一套快速擴增體系和程序，整個擴增程序只需24 min即可完成，顯著縮短了物證檢驗時間，為公安機關(guān)及科研院所進行PCR擴增和檢驗提供了便利。

1 材料與方法

1.1 樣本

50份無關(guān)個體靜脈血由中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，84份案例檢材（血布片10份、血棉簽10份、唾液布片10份、唾液棉簽10份、接觸類檢材10份、骨頭7份、牙齒7份、精斑5份、口腔拭子10份、頭發(fā)毛囊5份）由公安部物證鑒定中心提供。

1.2 主要試劑和儀器

SpeedSTAR?HS DNA酶（日本TaKaRa公司），KAPA2GTM快速PCR試劑盒（美國Kapa Biosystems公司），QIAGEN快速PCR試劑盒和M48 QIAGEN?試劑盒（美國QIAGEN公司），PyroStartTMFast PCR Master Mix（2×）（加拿大Fermentas公司），F(xiàn)astStart Taq DNA酶，dNTPack（德國Roche Applied Science公司），PfuUltraⅡFusion HS DNA酶（美國Agilent公司），F(xiàn)ast HiFidelity PCR試劑盒（TIANGEN公司），AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒和ABI 3130XL遺傳分析儀（美國Applied Biosystems公司），蛋白酶K（德國Merck公司），Mastercycler pro Eppendorf?熱循環(huán)儀（德國Eppendorf公司），SpeedCycler2熱循環(huán)儀（德國Analytik Jena公司），NANODROP 2000C分光光度計（美國Thermo Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA的提取：采用磁珠法［7］提取全部的實驗樣本，具體操作參照M48 QIAGEN?試劑盒使用說明。

1.3.2 對模板DNA的定量：使用NANODROP 2000C分光光度計進行DNA定量，操作參照儀器試劑使用說明。

1.4 快速擴增酶的篩選和優(yōu)化

1.4.1 擴增時間為1 h左右的快速酶的篩選和優(yōu)化：對以上7種酶和1種常規(guī)擴增試劑盒進行擴增，擴增時間在1 h左右，擴增體系為每種酶的標(biāo)準(zhǔn)擴增體系。最終篩選出TaKaRa、Roche、Fermentas這3家公司的3種酶，位點擴出較多，可以進一步優(yōu)化和篩選［8，9］。7種酶的推薦擴增體系如下：（1）TaKaRa 10 μL PCR擴增體系：Fast BufferⅠ（10×，含有30 mmol/L MgCl2）1 μ L，Identifiler primer mix 2 μ L，SpeedSTAR?HS DNA酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）0.8 μL，滅菌水5.1 μL，模板DNA 1 μL。（2）QIAGEN 10 μL PCR擴增體系：QIAGEN Fast Cycling PCR Master Mix 5 μL，Identifiler primer mix 2 μL，滅菌水2 μL，模板DNA 1 μL。（3）Roche 10 μL PCR擴增體系：PCR reaction buffer（10×，含有20 mmol/L MgCl2）1 μL，Identifiler primer mix 2 μL，F(xiàn)astStart Taq DNA酶（5 U/μL）0.2 μL，MgCl2（25 mmol/L）0.4 μL，PCR Grade Nucleotide Mix 0.2 μL，滅菌水5.2 μL，模板DNA 1 μL。（4）KAPA 10 μL PCR擴增體系：5×KAPA2G Buffer A（含有20 mmol/L MgCl2）2 μL，dNTP Mix（10 mmol/L each）0.2 μL，Identifiler primer mix 2 μL，KAPA2G Fast DNA酶（5 U/μL）0.2 μL，滅菌水4.6 μL，模板DNA 1 μL。（5）Aglient 10 μL PCR擴增體系：10×PfuUltraⅡreaction buffer 1 μL，dNTP mix（25 mmol/L each）0.2 μ L，Identifiler primer mix 2 μL，PfuUltraⅡfusion HS DNA酶0.2 μL，滅菌水5.6 μL，模板DNA 1 μL。（6）TIANGEN 10 μL PCR擴增體系：5×Fast HiFidelity PCR Buffer 2 μL，Identifiler primer mix 2 μL，F(xiàn)ast HiFidelity酶0.4 μL，滅菌水4.6 μL，模板DNA 1 μL。（7）Fermentas 10 μL PCR擴增體系：PyroStartTMFast PCR Master Mix（2×）5 μL，Identifiler primer mix 2 μL，滅菌水2 μL，模板DNA 1 μL。

2組篩選擴增程序（此程序是綜合擴增程序時間在1 h左右以及根據(jù)每種酶推薦程序推導(dǎo)得出）如下：擴增分別在Mastercycler pro Eppendorf?熱循環(huán)儀（擴增儀的升降溫速率分別為6℃/s和4.5℃/s）和SpeedCycler2熱循環(huán)儀（擴增儀的升降溫速率分別為12℃/s和8℃/s）上進行，熱循環(huán)參數(shù)1為：95℃2 min，95℃20 s，59℃20 s，72℃20 s，30個循環(huán)；72℃延伸3 min；25℃保存［10］。擴增時間分別為63 min和43 min。熱循環(huán)參數(shù)2為：95℃4 min，95℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃延伸7 min；25℃保存。擴增時間分別為78 min和58 min。

1.4.2 擴增時間為30 min左右的快速酶的篩選和優(yōu)化：用Roche、TaKaRa、Fermentas 3種酶分別擴增AmpFlSTR?Identifiler?Plus Primer Mix。在Mastercycler pro Eppendorf?熱循環(huán)儀和SpeedCycler2熱循環(huán)儀上進行優(yōu)化和調(diào)整。從以下10個方面對熱循環(huán)程序進行優(yōu)化調(diào)整：（1）酶的用量：0.05、0.10、0.20、0.40 μL；（2）引物的用量：2、3、4 μL；（3）鎂離子終濃度調(diào)整：2、3、4、5 mmol/L；（4）預(yù)變性時間調(diào)整：1、2、3、4 min；（5）變性時間調(diào)整：5、10、15、20、30 s；（6）退火時間調(diào)整：5、10、15、20、30 s；（7）延伸時間調(diào)整：5、10、15、20、30 s；（8）終延伸時間調(diào)整：1、3、5、7、10、20 min；（9）退火溫度調(diào)整：56、57、58、59、60、61、62℃；（10）循環(huán)數(shù)調(diào)整：25、28、30、33、35個循環(huán)［11，12］。

最終優(yōu)化出擴增時間最短、擴增效力最好的Ta-KaRa公司的SpeedSTAR酶的10 μL PCR擴增體系：Fast BufferⅠ（10×，含有30 mmol/L MgCl2）1 μL，Identifiler primer mix 2 μL，SpeedSTAR?HS DNA酶（5 U/μL）0.05 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）0.8 μL，滅菌水5.15 μL，模板DNA 1 μL。擴增在SpeedCycler2熱循環(huán)儀上進行，熱循環(huán)參數(shù)為：95℃1 min，95℃10 s，59℃10 s，72℃10 s，30個循環(huán)；72℃延伸1 min；25℃保存。擴增時間為24 min。

1.4.3 對優(yōu)化的擴增體系和擴增程序進行一致性和樣品適應(yīng)性驗證：應(yīng)用優(yōu)化的熱循環(huán)條件對收集的134份樣本進行復(fù)合擴增，將1 μL擴增產(chǎn)物和9 μL甲酰胺內(nèi)標(biāo)混合物混合變性后，應(yīng)用ABI 3130XL型遺傳分析儀進行電泳檢測，用GeneMapper ID V3.3軟件自動分析數(shù)據(jù)。每組均設(shè)置陽性對照和空白試劑陰性對照。甲酰胺內(nèi)標(biāo)混合物配比參照AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒使用說明。

1.4.4 對優(yōu)化的擴增體系和擴增程序進行靈敏度測試：將9947A（陽性標(biāo)準(zhǔn)品）和樣本1、2、3、4、5五份DNA分別稀釋為1、0.750、0.500、0.250、0.125、0.063、0.032 ng/μL［13］，用優(yōu)化的熱循環(huán)條件進行擴增，產(chǎn)物用ABI 3130XL型遺傳分析儀進行電泳檢測。每組均設(shè)置空白試劑陰性對照。

1.4.5 對優(yōu)化的擴增體系和擴增程序進行穩(wěn)定性檢測：運用優(yōu)化后的快速PCR擴增程序和擴增體系對同一份樣品在同一批次進行5次重復(fù)實驗［14］，擴增后用ABI 3130XL型分析儀進行電泳檢測。每組均設(shè)置陽性對照和空白試劑陰性對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所得DNA檢測圖譜均與已知分型結(jié)果比對，以各等位基因峰高大于50相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）者為有效分型結(jié)果［15，16］。檢出率（%）=檢測到的樣本數(shù)/總樣本數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 快速擴增酶的篩選和優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 擴增時間為1 h左右的快速酶的篩選和優(yōu)化結(jié)果：圖1為7種酶的商品化試劑盒推薦擴增體系和Identifiler plus引物在同一擴增程序1下，在Eppendorf熱循環(huán)儀上進行擴增，然后進行3130電泳檢測的分型圖，通過綜合分析DNA分型圖譜的準(zhǔn)確性、均衡性等初次篩選出3個公司的3種酶：Roche、TaKaRa、Fermentas。

圖1 7種快速酶的初次篩選電泳分型圖Fig.1 Classification of the seven fast PCR enzyme for the initial selection

2.1.2 擴增時間為30 min左右的快速酶的篩選和優(yōu)化結(jié)果：通過系統(tǒng)研究和優(yōu)化，以時間最短和擴增效力最好為優(yōu)化選擇條件，最終從Fermentas、 Roche和TaKaRa 3個公司的3種酶中篩選出TaKaRa公司的酶，擴增程序在SpeedCycler2熱循環(huán)儀上進行，擴增時間僅為24 min，見圖2。

圖2 3種快速酶的最終優(yōu)化篩選電泳分型圖Fig.2 Classification of the three fast PCR enzyme for the final selection

2.2 一致性與樣品適應(yīng)性驗證實驗結(jié)果

應(yīng)用優(yōu)化的熱循環(huán)條件對50份靜脈血DNA和84份案件檢材DNA進行擴增和電泳，在擴增不同類型的檢材時均獲得完整分型結(jié)果，且所得分型結(jié)果均與常規(guī)擴增方法分型結(jié)果一致，見表1和圖3。

表1 快速PCR分型與常規(guī)分型一致性的實驗結(jié)果Tab.1 Classification results of the fast PCR and the standard procedure

2.3 靈敏度測試

實驗結(jié)果顯示當(dāng)樣品DNA濃度達到或超過0.25 ng/μL可以獲得完整基因座分型，且無非特異擴增現(xiàn)象，每個濃度6份樣品平均的峰高即RFU值以散點圖的形式呈現(xiàn)。見表2和圖4。

2.4 體系穩(wěn)定性

運用快速PCR程序和體系用AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒引物對同一份樣品在同一批次進行5次重復(fù)實驗，PCR分型結(jié)果一致，峰面積無較大差異。見圖5和圖6。

3 討論

本文從縮短PCR擴增的時間和快速熱循環(huán)儀參數(shù)的優(yōu)化出發(fā)，針對AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒引物和7種快速PCR擴增酶，進行快速酶的篩選以及擴增體系和擴增程序的建立和優(yōu)化，構(gòu)建適合法醫(yī)學(xué)檢驗的快速擴增體系和程序。本研究對快速擴增酶的篩選、快速PCR擴增體系的構(gòu)建和優(yōu)化進行了較完整和系統(tǒng)的實驗研究和匯報，為快速PCR實驗提供了可供參考的實驗條件和理論依據(jù)。對快速PCR的實驗條件進行優(yōu)化后，擴增時間明顯縮短，平均耗時僅為24 min，比標(biāo)準(zhǔn)的耗時3 h左右的熱循環(huán)程序明顯縮短，與Tsukada［13］和Wang［2］的文獻報道的2 h左右的快速擴增時間相比也明顯縮短。在實驗初篩中，F(xiàn)ermentas和Roche的快速酶在擴增時間為1 h左右時，擴增效力較好，明顯優(yōu)于TaKaRa公司的快速酶，但在擴增時間縮短至30 min內(nèi)時，F(xiàn)ermentas和Roche的快速酶出現(xiàn)丟點現(xiàn)象，峰高均衡性較差，而TaKaRa公司的快速酶在擴增時間分別為1 h與30 min內(nèi)時相對保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)丟點現(xiàn)象，峰高相對均衡。因此實驗最終針對TaKaRa公司的快速酶進行了深度優(yōu)化，最終獲得了擴增效力較好、擴增時間僅為24 min的擴增體系和程序。

圖3 不同類型的檢材用最終優(yōu)化的TaKaRa酶的快速擴增體系擴增所得的電泳分型結(jié)果Fig.3 Classification results of the final fast PCR with DNA extracted from different types of samples using AmpFLSTR Identifiler plus PCR amplification kits and the fast PCR enzyme of TaKaRa

表2 靈敏度測試的實驗結(jié)果Tab.2 Experimental results of sensitivity tests

實驗通過134份包含不同種類的檢材，進行一致性和樣品適應(yīng)性驗證，均獲得良好分型圖譜，從圖3可以得出，此擴增體系和擴增程序能夠廣泛適用于各種法醫(yī)常規(guī)檢材。對隨機一份樣品同一條件下重復(fù)實驗5次，PCR分型結(jié)果一致穩(wěn)定，峰高和峰面積無較大差異，從圖5和圖6可以看出，峰高分布集中，5次重復(fù)實驗無較大差異。表明此擴增體系和擴增程序不是隨機性，而是具有良好的穩(wěn)定性且具有峰高均衡性。Vallone等［6］的一些實驗研究中出現(xiàn)大量非特異擴增現(xiàn)象和雙尖情況，而使用本研究建立的快速擴增體系和擴增程序進行擴增時則無此現(xiàn)象，體現(xiàn)了此快速擴增體系和擴增程序的優(yōu)勢。

圖4 不同濃度時9947A的各基因座的平均峰高散點圖Fig.4 The scatter diagram of the average peak height of different concentration in all loci of 9947A

圖5 樣品5次重復(fù)的電泳分型圖Fig.5 Classification results of the sample for five repeat

圖6 樣品5次重復(fù)的各基因座的平均峰高散點圖Fig.6 The scatter diagram of the average peak height of different concentration in all loci of the sample for five repeat

針對隨機5份樣品和9947A進行靈敏度驗證，結(jié)果顯示只要模板DNA濃度達到或超過0.250 ng/μL就能保證等位基因不丟失，表明此擴增體系和程序?qū)悠妨恳筝^低。從圖4可以得出，樣本在不同濃度擴增時峰高較均衡集中，體現(xiàn)了此擴增體系和擴增程序的均衡性較好，也從側(cè)面反映了此體系和程序的穩(wěn)定性。常規(guī)擴增時AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒的靈敏度為0.125 ng/μL，在Vallone等［6］的一些實驗研究中，其快速檢測體系和程序的靈敏度也均在0.125 ng/μL左右。與常規(guī)擴增相比，本研究建立的快速擴增體系和擴增程序顯著提升了檢測速率，但在一定程度上降低了檢測的靈敏度，其靈敏度為0.250 ng/μL，但是仍能滿足各種常見法醫(yī)檢材檢驗的需求，且與目前國際上關(guān)于快速PCR檢測的各項研究中的靈敏度相一致。

在Vallone［6］和Laurin［3］的研究中，其用酶量均消耗較大，本文建立的擴增體系和擴增程序顯著提高了擴增效率，10 μL擴增體系中酶的用量僅為0.25 U且適用于各種常規(guī)檢材，這為公安機關(guān)以及科研院所進行PCR擴增提供了便利。隨著新的快速酶的不斷產(chǎn)生、熱循環(huán)儀的不斷優(yōu)化，PCR擴增時間和擴增效力將有望進行進一步縮短和提高。

綜上所述，本研究建立的快速PCR擴增體系和擴增程序，擴增時間僅為24 min，比標(biāo)準(zhǔn)的耗時3 h左右的熱循環(huán)程序明顯縮短，為公安機構(gòu)和科研院所進行快速PCR反應(yīng)提供了便捷方法。

［1］Verheij S，Harteveld J，Sijen T.A protocol for direct and rapid multiplex PCR amplification on forensically relevant samples［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（2）：167-175.

［2］Wang DY，Chang CW，Hennessy LK.Rapid STR analysis of single source DNA samples in 2 h［J］.Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：115-116.

［3］Laurin N，F(xiàn)regeau C.Optimization and validation of a fast amplification protocol for AmpFLSTR profiler plus for rapid forensic human identification［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（1）：47-57.

［4］楊文超，張曉東.快速PCR研究進展［J］.中國生物工程雜志，2007，27（4）：99-103.

［5］張明陽，單海燕，徐冬冬，等.PCR-SSCP技術(shù)分析線粒體DNA多態(tài)性及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，40（4）：334-336.

［6］Vallone PM，Hill CR，Podini D，et al.Rapid amplification of commercial STR typing kits［J］.Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：111-112.

［7］Kishore R，Reef WH，Anderson VJ，et al.Optimization of DNA extraction from low-yield and degraded samples using the BioRobot EZ1 and BioRobot M48［J］.J Forensic Sci，2006，51（5）：1055-1061.

［8］Pavlov AR，Pavlova NV，Kozyavkin SA，et al.Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications［J］.Trends Biotechnol，2004，22（5）：253-260.

［9］Collins PJ，Hennessy LK，Leibelt CS，et al.Developmental validation of a single-tube amplification of the 13 CODIS STR loci，D2S1338，D19S433 and amelogenin：the AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit［J］.J Forensic Sci，2004，49（6）：1265-1277.

［10］Vallone PM，Hill CR，Butler JM.Demonstration of rapid multiplex PCR amplification involving 16 genetic loci［J］.Forensic Sci Int Genet，2009，3（1）：42-45.

［11］Bienvenue JM，Legendre LA，F(xiàn)errance JP，et al.An integrated microfluidic device for DNA purification and PCR amplification of STR fragments［J］.Forensic Sci Int Genet，2010，4（3）：178-186.

［12］Wang Y，Prosen DE，LI M，et al.A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（3）：1197-1207.

［13］Tsukada K，Harayama Y，Kurasawa Y，et al.Fast PCR amplification AmpFLSTR Identifiler：second report［J］.Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：108-110.

［14］Choung CM，Lee DS，Park KW，et al.Test of the rapid PCR method using AmpFLSTR Identifiler Kit［J］.Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2011，3（1）：475-476.

［15］Butler JM.Forensic DNA typing［M］.2nd ed.New York：Elsevier，2005：410-420.

［16］Butler JM.Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing［J］.J Forensic Sci，2006，51（2）：253-265.

［17］韓俊萍，李彩霞，嚴(yán)紅，等.低體積PCR擴增用于單細(xì)胞分離和檢驗［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（2）：123-125.

（編輯 陳姜）

An Exploration ofthe Rapid Polymerase Chain Reaction Method and Its Application in Forensic Science

DONGHui1，LICai-xia2，WANGJing2，JIAJing3，LIUChao1
（1.DepartmentofForensic Science，Basic Medicine College，Southern MedicalUniversity，Guangzhou 510515，China；2.Institute ofForensic Science，Key Laboratory ofForensic Genetics，Beijing Engineering Research CenterofCrime Scene Evidence Examination，Ministry ofPublic Security，Beijing 100038，China；3.Institute ofGenetics，Basic Medicine College，Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China）

ObjectiveTo establish a rapid polymerase chain reaction（PCR）cycling protocol，so as to help shorten amplification time and improve generating short tandem repeats profiles and working efficiency.MethodsDNA extracted from the common samples were amplified with the optimized PCR method and cycling protocol using AmpFLSTR?Identifiler?Plus PCR Amplification Kits and the fast PCR enzyme filtrated from seven fastPCRenzyme.The genotyping results were then validated and discussed.ResultsThe developed PCRmethod，using filtrated fastPCRenzyme，shortened the time from 3 h of standard procedure to 24 min，and the genotyping results were in accord with the results generated by standard procedure.ConclusionWe successfully amplified the STR loci of several routine forensic specimens using the established rapid cycling protocol.Rapid thermalcycling conditions can significantly improve the rate ofDNA profiling.Moreover，unbalanced amplification ofthe loci，which may occurusing commercialkitsassingle primerconcentration cannotbe adjusted，now can be overcame with the established system.

forensic medicine；rapid polymerase chain reaction；multiplex short tandem repeat

R89

A

0258-4646（2014）10-0931-07

國家自然科學(xué)基金（81202384）；中央公益類基本科研業(yè)務(wù)費（2012JB012）

董會（1990-），女，碩士研究生.

劉超，E-mail：liuchaogaj@21cn.com

2014-07-05

網(wǎng)絡(luò)出版時間：