張洪杰，李文凱，劉 娜

(江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212003)

我國(guó)是世界柑桔大國(guó)，橘皮中富含橙皮甙、桔皮素、果膠以及色素、黃酮類和纖維素等多種生物活性成分，采用高科技手段將其“吃光用盡”是可能的，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效益也是顯而易見的.目前對(duì)橘柑皮渣的利用主要有兩個(gè)途徑:一是從中提取精油、色素、果膠、橙皮苷等;另一個(gè)是利用微生物技術(shù)發(fā)酵，果醋、乳酸飲料等食品添加劑主要就是利用微生物技術(shù)發(fā)酵果皮生產(chǎn)出來的.植物中黃酮類化合物的提取是近年來具有研究意義的課題，常見的提取黃酮類化合物的方法有溶劑萃取法、酶法、超臨界流體萃取法［1］、超聲波提取法、微波提取法等［2］.由于其具有較好的抗氧化性及自由基的清除作用，黃酮類化合物越來越受到人們的重視［3］.

本實(shí)驗(yàn)以橘皮為原料，超聲輔助乙醇浸取的方法提取橘皮中的黃酮類物質(zhì)，討論超聲波功率、乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比等4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響;通過Design－Expert V8.0.6軟件設(shè)計(jì)橘皮中總黃酮提取率工藝實(shí)驗(yàn)，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化法確定最佳提取工藝;采用Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型［4］，在相同條件下，比較橘皮提取液和VC對(duì)羥基自由基的清除效果.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料和試劑

橘皮(超市購(gòu)買，產(chǎn)地廣州)、蘆丁(生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、亞硝酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、氯化鋁、鄰二氮菲、氯化鐵、雙氧水、氯化亞鐵、濃鹽酸、抗壞血酸(Vc)(均為分析純).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

紫外可見光分光光度計(jì)UV－3010(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、電子天平FA2004(上海精密儀器制造廠)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱101A－2(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)、超聲波清CQ－250DB(上海第三分析儀器廠)、離心沉淀機(jī)80－2B(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)等.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮提取的工藝路線

橘皮干燥→粉碎→超聲輔助乙醇浸取→抽濾得濾液→硝酸鋁顯色法測(cè)定吸光度→計(jì)算總黃酮量.

稱取一定量的橘皮粉于錐形瓶中，加入乙醇溶液超聲浸取，精確移取適量的提取液置于25.00 mL的比色管中，用60%的乙醇稀釋到10.00mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.00mL，搖勻，靜置6 min;加入10%硝酸鋁溶液1.00mL，搖勻，靜置6 min;加入4%氫氧化鈉10.00mL，蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15min后在510 nm處測(cè)定其吸光度［5］.

1.3.2 橘皮總黃酮的提取及測(cè)定

將蘆丁置于干燥箱內(nèi)120℃條件下恒重1.5h，然后精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用60%乙醇溶解，配成100mL的溶液，備用，此時(shí)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.2mg/mL.

精確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00，1.00，2.00， 3.00，4.00，5.00，6.00mL于7支25mL的比色管中，其他條件參照1.3.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以0.00mL為空白溶液，以吸光度和蘆丁溶液濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得C=0.0977A+0.000 6(R2=0.9996，在0.008～0.048 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系).

1.3.3 總黃酮質(zhì)量與提取率的計(jì)算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的質(zhì)量

式中:m為總黃酮質(zhì)量(g);A為樣品溶液吸光度;V為過濾后的體積(mL);w為稀釋倍數(shù).

式中:y為總黃酮提取得率(%);m為總黃酮質(zhì)量(g);M為原料質(zhì)量(g).

1.4 橘皮中提取物的抗氧化性研究

［6］的方法，在10.00mL具塞試管中加入1mL 0.75moL/L鄰二氮菲溶液，2.00mL 0.2 moL/L、pH7.4磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水1.00mL，充分搖勻，再加入0.75moL/LFeSO4溶液，搖勻后加入1.00mL3%雙氧水啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴1 h后在510 nm處測(cè)量吸光度A1值，用1.00mL提取液代替1.00 mL雙氧水測(cè)定吸光度 A2，用提取液1.00mL代替1mL蒸餾水測(cè)定吸光度A3值.黃酮類化合物可與Fenton系統(tǒng)中自由基反應(yīng)，從而阻斷其反應(yīng)鏈，導(dǎo)致樣品吸光度降低，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算清除率.

式中:S為清除率(%)，A1為不加樣液時(shí)的吸光度，A2為不加H2O2時(shí)的吸光度，A3為加入H2O2和樣液的吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)橘皮總黃酮提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g橘皮粉置于錐形瓶，固定乙醇濃度為60%，液料比為20∶1，超聲波功率為125 W，浸取20，30，40，50，60，70min后，分別吸取提取液1.00mL，其他條件參照1.3.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以不加入提取液為空白溶液，結(jié)果見圖1.

圖1 提取時(shí)間對(duì)橘皮總黃酮提取得率的影響Fig.1 Effect time on extraction of total flavonoid from orange peel

由圖1可知在20～50min內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)增大，20～40min黃酮提取得率增加顯著.50min之后總黃酮提取得率隨時(shí)間變化下降，可能是因?yàn)殚倨ぶ兴S酮類物質(zhì)已基本溶出，所以增加提取時(shí)間不能使提取得率升高.另外超聲時(shí)間長(zhǎng)，使得環(huán)境溫度升高，部分溶劑乙醇揮發(fā)從而影響提取效果;溫度升高，蛋白質(zhì)及雜質(zhì)沉淀下來，影響黃酮類物質(zhì)的溶出，另一方面溫度升高也導(dǎo)致提取液中有效成分破壞，黃酮分解.所以選擇最佳提取時(shí)間為50min.

2.1.2 液料比對(duì)橘皮總黃酮提取得率的影響

準(zhǔn)確提取處理好的橘皮粉1.00 g，在60%的乙醇，超聲波功率為125W，提取時(shí)間為50min的條件下，選取液料比分別為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1ml/g，研究液料比對(duì)橘皮粉總黃酮提取得率的影響，分別吸取提取液1.00mL，其他條件參照1.3.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以不加入提取液為空白溶液，結(jié)果見圖2.

圖2 液料比對(duì)橘皮總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction of total flavonoid from orange peel

由圖2可以看出，液料比不斷增大，總黃酮提取得率呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì)，其原因可能是液料比增大，系統(tǒng)稀釋度就增大，有利于黃酮的溶出，液料比的提高主要是增加了物料體系與提取劑體系間有效成分的濃度差，也減少了物料內(nèi)部有效成分的殘余量，從而提高提取得率.在液料比為50∶1后繼續(xù)增加液料比，得率有下降的趨勢(shì).所以選擇50∶1為最佳液料比.

2.1.3 乙醇濃度對(duì)橘皮總黃酮提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g橘皮粉，在超聲波功率為125 W、提取時(shí)間為50min、液料比為50∶1的條件下，選擇乙醇濃度分別為40%，50%，60%，70%，80%，90%，研究乙醇濃度對(duì)橘皮粉黃酮提取率的影響.分別吸取提取液1.00 mL，其他條件參照1.3.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以不加入提取液為空白溶液，結(jié)果見圖3.

由圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，橘皮中總黃酮提取得率出現(xiàn)先增高后基本處于穩(wěn)定，變化不明顯.因?yàn)橐掖紳舛忍岣?，增加了提取劑?duì)物料的滲透性，并提高了黃酮類化合物的溶解度，從而提高黃酮提取得率.下降的原因可能是由于乙醇濃度過高時(shí)，揮發(fā)嚴(yán)重，同時(shí)一些醇溶性雜質(zhì)、色素、脂溶性強(qiáng)的成分溶出量增加，與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)與乙醇結(jié)合，因而導(dǎo)致提取得率略有下降.所以乙醇最佳濃度為70%.

圖3 乙醇濃度對(duì)橘皮總黃酮提取得率的影響Fig.3 Effect of concentration of alcoholon extraction of total flavonoid from orange peel

2.1.4 超聲功率對(duì)橘皮總黃酮提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00g橘皮粉，在提取時(shí)間為50min、液料比為50∶1、乙醇濃度為70%的條件下，選擇超聲波功率分別為125，150，175，200，225，250W，研究超聲波功率對(duì)橘皮粉黃酮提取得率的影響.分別吸取提取液1.00mL，其他條件參照1.3.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以不加入提取液為空白溶液，結(jié)果見圖4.

圖4 超聲功率對(duì)橘皮總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power of total flavonoid from orange peel

由圖4可知，隨著超聲功率的增加，總黃酮提取得率逐漸增大，慢慢趨于平衡.由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備最大超聲功率為250W，實(shí)驗(yàn)選250W為超聲功率，并且在后面的響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝不予考慮.

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定超聲波功率為250 W，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和液料比為自變量，橘皮中總黃酮提取得率為響應(yīng)值(Y)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果見表2.

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of response surface(RS)test

實(shí)驗(yàn)隨機(jī)次序進(jìn)行，利用 Design－ExpertV8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總黃酮提取得率Y為目標(biāo)函數(shù):

表2 響應(yīng)面及實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果Table2 Program and results of RS test

表3 回歸分析結(jié)果Table3 Statistical results of regression analysis

表4 模型可信度分析表Table4 Fit statistics for Y

回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性用F檢驗(yàn)來判定，概率P(F＞Fα)值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，P(F＞Fα)＜0.01時(shí)影響為高度顯著.表3中模型的F值為183.86，P值為小于0.0001，說明模型回歸高度顯著.失擬性P值為0.1376，大于0.05，表示失擬性不顯著，說明該模型是合理的.B，C，A2，B2，C2的P值均小于0.05，對(duì)總黃酮的提取率影響顯著.模型調(diào)整后決定系數(shù)R=0.9904，說明模型能解釋99.04的響應(yīng)值變化，僅有總變異的0.96%不能用此模型解釋;信噪比(Adeq-Precision)=37.621＞4，說明方程的擬合度和可信度均較高，可用于預(yù)測(cè)反應(yīng)的分離度.C.V./%(Y的變異系數(shù))表示試驗(yàn)的精確度，C.V./%值越高，說明試驗(yàn)的可靠性越低.該試驗(yàn)中C.V.=0.55%，說明試驗(yàn)操作可信.綜合分析該模型擬合程度良好，可以用來分析和預(yù)測(cè)橘皮總黃酮提取的最佳操作條件.

圖5～7是通過多元回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，所擬合的響應(yīng)曲面和等高線能比較直觀地反應(yīng)各因素間的互交作用.

圖5 Y=f(A，B)的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，B)

圖6 Y=f(B，C)的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Responsive surfaces and contours of Y=f(B，C)

圖7 Y=f(A，C)的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，C)

由圖5～7直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線均在－1～1范圍內(nèi)，3個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下并有最高點(diǎn)，說明響應(yīng)值(橘皮總黃酮提取得率)最大值在設(shè)計(jì)的范圍之內(nèi).由Design－ExpertV8.0.6軟件分析得到最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.78%，液料比為48.92∶1，提取時(shí)間為50.2min，理論總黃酮提取率為1.51%.為實(shí)驗(yàn)操作方便，總黃酮提取優(yōu)化工藝參數(shù)選為乙醇體積分?jǐn)?shù)72%，液料比為50∶1，提取時(shí)間為50min.在此條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，橘皮中總黃酮平均提取得率是1.50%，與理論值相差0.01%，由此可知，響應(yīng)面優(yōu)化橘皮總黃酮提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確，具有實(shí)際可操作性.

2.3 橘皮中總黃酮的抗氧化性

橘皮總黃酮對(duì)羥基自由基的清除效果如圖8.不同濃度的橘皮黃酮對(duì)該體系中產(chǎn)生的·OH均有一定的清除作用，并且隨著總黃酮濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除能力增強(qiáng);濃度相同時(shí)，總黃酮清除羥基自由基活性能力略高于Vc.

圖8 橘皮總黃酮對(duì)·OH自由基的清除作用Fig.8 ·OH scavenging effects of total flavonoid from orange peel

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)超聲波輔助乙醇提取橘皮總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)得到的模型回歸顯著，失擬誤差不顯著，說明通過本實(shí)驗(yàn)所建立的二次回歸方程能較好地描述各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系.應(yīng)用Design－Expert軟件分析得到橘皮總黃酮提取的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度72%、液料比50∶1 mL/g、超聲時(shí)間50min，在此條件下，實(shí)際提取得率最高達(dá)1.50%，跟預(yù)測(cè)值基本一致，說明該模型可很好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果.橘皮中總黃酮具有一定的抗氧化作用，其在Fenton體系中對(duì)羥基自由基的清除率大于同濃度的Vc.

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