李 鵬 苗增良 王健鑫

(浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 舟山 316022)

堿性蛋白酶(Alkaline protease)是指在pH在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類, 廣泛存在于動、植物及微生物體中, 是一類非常重要的工業(yè)用酶。堿性蛋白酶應(yīng)用很廣泛, 在洗滌劑、絲綢、飼料、飼料、制革、食品、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用(Bhaskaret al,2007; Wanget al, 2008; Jellouliet al, 2009), 在全世界范圍內(nèi)占工業(yè)酶制劑市場的65%以上(Baniket al,2004), 具有很重要的工業(yè)和經(jīng)濟(jì)價值(Guptaet al,2002)。微生物由于生長速度快、生長條件較簡單、代謝過程特殊等特點(diǎn), 使之成為蛋白酶的重要來源。微生物蛋白酶均為胞外酶, 其從微生物中提取, 不受資源、環(huán)境和空間的限制, 具有動物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比擬的優(yōu)越性(梅承芳等, 2005)。

目前對堿性蛋白酶的研究主要集中在3個方面:通過誘變、培養(yǎng)條件優(yōu)化、異源表達(dá)等提高酶產(chǎn)量;分子結(jié)構(gòu)研究和定點(diǎn)、定向突變以提高酶的性能; 篩選新型堿性蛋白酶和產(chǎn)酶菌株。在篩選新型堿性蛋白酶和產(chǎn)酶菌株方面, 近年來已報道了具有較高pH適應(yīng)性的堿性蛋白酶(郝建國等, 2010), 水解多種底物的堿性蛋白酶(肖昌松等, 2001), 堿性彈性蛋白酶(Kumaret al, 1999), 具有耐表面活性劑、耐熱、耐氧化劑等特性的堿性蛋白酶等(Banerjeeet al, 1999;Johnveslyet al, 2001)?，F(xiàn)階段所報道的產(chǎn)酶菌株主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)。堿性蛋白酶仍然存在品種單一的問題, 酶的活性不高, 價格昂貴等不足, 加上各國都十分注重對已有的重要微生物資源的保護(hù), 使得優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酶菌株的篩選和選育有著十分重要的研究前景。

海洋微生物與陸生微生物相比其生存環(huán)境更加惡劣, 如高滲、低溫、高壓、低營養(yǎng)等, 也造就其獨(dú)特的代謝途徑, 因此海洋微生物所產(chǎn)蛋白酶可能具有更加獨(dú)特的酶學(xué)性質(zhì)和構(gòu)造。

Sreeja等(2011)從海洋微生物Engyodontium albumBTMFS10中分離到堿性絲氨酸蛋白酶, 該酶除了具有很好的耐高溫(60°C酶活最高)、嗜堿(pH 11時酶活最高)以外, 還具有很好的穩(wěn)定性, 如其在烴類、天然油脂、表面活性劑及大部分的有機(jī)溶劑中均表現(xiàn)很好的穩(wěn)定性, 在洗滌劑工業(yè)具有很好的應(yīng)用前景。

Anjali等(2014)從海洋微生物Bacillus tequilensisP15中發(fā)現(xiàn)耐受絕大部分有機(jī)溶劑的堿性蛋白酶, 試驗結(jié)果顯示該酶對于去除衣物上的血漬、脫毛及除去感光膠片上的明膠具有很好的效果。

國產(chǎn)堿性蛋白酶主要在酶活、成本和酶學(xué)性質(zhì)等方面不能滿足工業(yè)發(fā)展的要求, 大規(guī)模工業(yè)用堿性蛋白酶主要還依賴于進(jìn)口, 希望通過本次試驗研究,能發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)蛋白酶的海洋微生物, 并為下一步的研究, 如: 發(fā)酵條件的優(yōu)化、蛋白酶基因的克隆、工程菌的構(gòu)造等方面的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

分別在浙江舟山的三江碼頭、鴨蛋山碼頭、東極島、朱家尖、東港等地的潮間帶采集海水、海泥。

1.1.1 培養(yǎng)基

(1) 高氏一號改良培養(yǎng)基: 可溶性淀粉20g,KNO31g, K2HPO40.5g, MgSO4?7H2O 0.5g, NaCl 0.5g,FeSO40.01g, 瓊脂20g, 人工海水1000mL, pH 7.4—7.6。

(2) 脫脂奶培養(yǎng)基(沈萍等, 1999): 牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g, 氯化鈉1.0g, 瓊脂20.0g, pH值7.2—7.4,加熱溶解于海水中, 121°C高壓滅菌20min, 備用。脫脂牛奶10.0g, 溶解于海水中, 115°C滅菌30min。兩者在無菌環(huán)境下混勻得到1000mL的培養(yǎng)基。

(3) 酪素瓊脂改良培養(yǎng)基: 酪蛋白4g, CaCl20.002g, MgSO4?7H2O 0.5g, K2HPO4?7H2O 1.07g, KH2PO40.36g, ZnCl20.014g, NaCl 0.16g, FeSO40.0002g, 水解干酪素0.05g, 瓊脂18g, 人工海水1000mL, pH 8.0。

(4) 放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基, 分別記為1—6號:

① 淀粉5g, 黃豆粉10g, KH2PO41g, 人工海水1000mL, pH 8.5。

② 胰蛋白胨10g, 酵母膏5g, 玉米粉5, Na2HPO4?12H2O 4g, KH2PO40.3g, Na2CO31g, 人工海水1000mL,pH 8.5。

③ 酪蛋白10.0g, 牛肉膏3.0g, NaCl 5.0g, K2HPO42.0g, 人工海水1000mL, pH 8.5。

④ 可溶性淀粉4.0%, 酵母膏0.5%, 牛肉膏1.0%蛋白胨1.5%, NaCl 0.5%, K2HPO40.35%, NaH2PO40.03%, Na2CO30.056%, 人工海水1000mL, pH 8.5(沈萍等, 1999)。

⑤ 蛋白胨5.0g, 酵母膏3.0g, 葡萄糖5.0g, 人工海水 1000mL, pH 8.5 (周德慶, 2006)。

⑥ 牛肉膏5.0g, 蛋白胨10.0g, NaCl 1.0g, 脫脂奶10.0g, 人工海水1000mL, pH 8.5。

1.1.2 實(shí)驗試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp BacteriaDNA Kit)由天根生化科技(北京)有限公司提供, 常規(guī)化學(xué)試劑DNA Marker購自TaKaRa公司, 其余均購于國藥集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 菌株的分離與純化 將采樣得到的潮間帶海泥進(jìn)行梯度稀釋, 在高氏I號培養(yǎng)基平板上涂布培養(yǎng), 按照菌落形態(tài)、大小、顏色等不同挑選單菌落在高氏I號培養(yǎng)基平板上劃線, 倒置25°C培養(yǎng)3—5d,繼續(xù)挑取單菌落, 重復(fù)劃線。重復(fù)上述步驟2—3次,共得到純菌株50株。

1.2.2 目標(biāo)菌株的篩選 將分離純化得到的放線菌在脫脂奶平板上進(jìn)行點(diǎn)種, 25°C培養(yǎng), 觀察有無透明圈的產(chǎn)生。

1.2.3 酶活測定 將篩選到的菌株接種于放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基50/250mL搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng), 溫度25°C,轉(zhuǎn)速120r/min培養(yǎng)3—5d后測酶活。

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用酪氨酸配置0—100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 酪氨酸在275nm下有特征光吸收, 通過建立酪氨酸濃度與該濃度下的酪氨酸在275nm下光吸收關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 通過紫外分光光度法測定堿性蛋白酶促蛋白質(zhì)消化反應(yīng)的生成物在275nm下的吸光度, 就可以計算反應(yīng)生成酪氨酸的量,根據(jù)酶活力的定義計算堿性蛋白酶的活力。按表1制備不同濃度的酪氨酸溶液。

用分光光度計于680nm波長下測各管的光吸收值(A), 進(jìn)行測量, 用“1”號管作為空白對照, 以于680nm波長下測各管的A值為縱坐標(biāo), 每管的酪氨酸含量為橫坐標(biāo), 繪制酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 堿性蛋白酶活力的測定 將目標(biāo)菌株發(fā)酵酶液進(jìn)行5000r/min離心去除菌體后, 取粗酶液適當(dāng)稀釋后按照表2進(jìn)行酶活測定, 每種樣品做2次平行試驗。其中試管1為空白對照。具體步驟見表2。

蛋白酶活力: 以酪蛋白為底物, 每分鐘水解產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位。

式中,Up表示蛋白酶活力,A680表示由樣品測得的吸光度值,K為吸光系數(shù)(從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到), 4為反應(yīng)試劑的總體積, 10為反應(yīng)時間,n為稀釋倍數(shù)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作Tab.1 Data for making standard curves

表2 測樣品酶活的步驟Tab.2 Steps of measuring enzyme activity in the samples

1.2.4 菌株形態(tài)觀察 利用插片法對目標(biāo)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.2.5 菌株A20的生理生化試驗 采用不同的糖作為碳源, 對目標(biāo)菌株的碳源利用情況進(jìn)行觀察。將篩選得到的目標(biāo)菌株進(jìn)行常規(guī)項目的生理生化實(shí)驗,觀察結(jié)果。

1.2.6 菌株A20的16S rDNA分子鑒定 用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取目標(biāo)菌株的DNA, 以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Kunamneniet al, 2003),PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析, PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收1500bp的PCR產(chǎn)物, 產(chǎn)物以Seq Forward、Seq Reverse、Seq Internal為引物進(jìn)行16S rDNA測序, 測序工作由寶生物工程(大連)有限公司完成。

1.2.7 菌株A20的系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制 利用Blast對得到的序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似序列的搜索, 獲得與目標(biāo)菌株相似性較高的菌株(97%以上相似性),對同源性較好的序列進(jìn)行比對(Clustalx 1.8), 繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(PhyloDraw V8.0)。

1.2.8 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株A20的酶活影響分別采用淀粉培養(yǎng)基、胰蛋白胨培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基等六種培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗, 得到最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

1.2.9 菌株的誘變 先將目標(biāo)菌株進(jìn)行紫外誘變, 獲得的高產(chǎn)株再分別進(jìn)行DES誘變, 獲得最終的高產(chǎn)菌株。

1.2.9.1 紫外誘變 取2mL的菌懸液放入6cm培養(yǎng)皿中, 垂直照射距離為30cm。先蓋蓋子照射1min,打開蓋子照射處理, 同時用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌, 處理時間為30、60、90、120、150、180s。在各個處理時間點(diǎn)將處理的菌液取100μL用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋, 稀釋至10–3濃度, 取0.1mL在脫脂奶培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布, 3個重復(fù), 同時對未經(jīng)紫外處理的對照菌液也進(jìn)行稀釋后平板涂布, 計算致死率, 致死率 =(1－誘變處理后每0.1mL菌落數(shù)/對照每0.1mL菌落數(shù))×100%。涂布后的平板在暗處培養(yǎng)3—5d后觀察, 選取HC比值(透明圈直徑/菌落直徑)較對照明顯大的單菌落進(jìn)行發(fā)酵, 25°C, 120r/min, 50mL/ 250mL裝量, 做3個平行, 測其酶活。

1.2.9.2 DES誘變 挑取經(jīng)紫外誘變后的斜面保種突變菌株于液體高氏1號培養(yǎng)基, 50mL/250mL接種, 25°C、120r/min培養(yǎng)5d。誘變處理將處于對數(shù)生長期的菌液在室溫下5000r/min離心10min, 棄上清液, 收集菌體。用10mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌2次, 然后重懸于pH 7.0的磷酸緩沖液中, 調(diào)整菌液濃度為108個/mL(調(diào)整OD600= 0.5左右即可)。移取4mL菌液到16mL磷酸鉀緩沖溶液(pH 7.0)中,加入0.2mL硫酸二乙酯, 分別振蕩處理10、20、30、40、50、60min, 最后加入0.5mL 25%硫代硫酸鈉中止反應(yīng)。將誘變處理10、20、30、40、50、60min的菌液稀釋到10–3稀釋度, 做3個重復(fù), 取0.1mL平板涂布, 以未經(jīng)化學(xué)誘變處理的出發(fā)菌為對照, 25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d (邱雁臨等, 2008)。將培養(yǎng)好的平板取出, 菌落計數(shù), 計算致死率。挑取HC比值大的單菌落進(jìn)行發(fā)酵(同時斜面保種), 做3個平行重復(fù),測其酶活。

1.2.9.3 穩(wěn)定性試驗 將誘變得到的高產(chǎn)菌株連續(xù)傳代10代, 測其酶活。

1.2.10 最適溫度的選擇 將誘變得到的菌株分別在28、37、45、50、55、60°C下?lián)u瓶培養(yǎng), 分別測酶活。

1.2.11 最適pH選擇 將誘變得到的菌株分別接種于pH為7.5、8、8.5、9、9.5、10的發(fā)酵培養(yǎng)液中,分別測酶活。

1.2.12 最適培養(yǎng)時間選擇 將誘變得到的菌株分別接種于pH 7.5的發(fā)酵培養(yǎng)液中, 28°C分別培養(yǎng)24、36、48、60、72、84、96h。分別測酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

得到2株產(chǎn)較大透明圈的菌株, 分別記A8和A20。篩選結(jié)果如圖1和圖2所示。透明圈大小情況如表3所示。

2.2 酶活測定結(jié)果

圖1 菌株A8平板圖Fig.1 Shape of Strain A8

圖2 菌株A20平板圖Fig.2 Shape of Strain A20

表3 兩株放線菌所形成透明圈直徑大小Tab.3 The size of diameter of transparent zone

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用100μg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液, 在OD680nm處進(jìn)行測定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同含量的酪氨酸的吸光度值結(jié)果見表4。

以光吸收值(A)為縱坐標(biāo), 酪氨酸含量為橫坐標(biāo),繪制酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 見圖3?；貧w方程y=0.0088x－0.0111, 相關(guān)系數(shù)R2= 0.9977, 具有較好的線性關(guān)系。

表4 不同含量的酪氨酸吸光度值結(jié)果Tab.4 Results of different levels of tyrosine absorbance

圖3 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of tyrosine

2.2.2 目標(biāo)菌株酶活測定 對菌株A8、A20進(jìn)行兩組平行測定酶活, 最后取平均值作為最終結(jié)果, 如表5所示。

表5 堿性蛋白酶活力測量結(jié)果Tab.5 Results of alkaline protease activity

菌株A20的酶活較高, 因此選取菌株A20作為研究對象, 進(jìn)行紫外線和DES誘變處理以獲得高產(chǎn)菌株。

2.3 菌株A20的形態(tài)觀察

利用插片法觀察A20形態(tài), 菌絲呈鏈狀, 斷裂,無卷曲狀分布。顯微觀察結(jié)果如圖4所示。

2.4 菌株A20的生理生化試驗

菌株A20在不同培養(yǎng)基條件下的生長3d情況如表6所示, 對不同碳源的利用情況如表7所示, 生理生化結(jié)果如表8所示。

由生理生化試驗結(jié)果可知, 菌株A20可以利用除了除了鼠李糖之外的常見碳源, 并都能使硝酸鹽還原, 還具有水解淀粉的能力。

圖4 菌株A20顯微觀察圖Fig.4 Hyphal morphology of Strain A20

表6 菌株在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的生長情況Tab.6 Strain A20 in different culture media on the growth after 3d

表7 菌株A20對不同碳源的利用情況Tab.7 Strain A20 on the utilization of different carbon sources

表8 菌株A20的生理生化試驗結(jié)果Tab.8 Physiological and biochemical tests on Strain A20

2.5 16S rDNA序列分析結(jié)果

16S rDNA分子鑒定結(jié)果顯示菌株A20的核苷酸長度為1361bp, 將測序得到的核苷酸序列上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號為GU263841。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹繪制

利用Blast軟件, 從GenBank數(shù)據(jù)庫中查找同源性較高的菌株, 來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5所示。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示菌株A20與Streptomyces roseoviridisJS-9(玫瑰綠鏈霉菌)和Streptomyces roseusJS-18(淺玫瑰色鏈霉菌)的進(jìn)化位置最近, 相似性達(dá)99.8%, A20不產(chǎn)水溶性色素, 并在燕麥汁、PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)時產(chǎn)生淺玫瑰色菌落, 菌株A20很可能為一種淺玫瑰色鏈霉菌。

2.7 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株A20的酶活影響

在1—6號不同發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下菌株A20的酶活大小如表9所示。結(jié)果顯示1號培養(yǎng)基(淀粉培養(yǎng)基)培養(yǎng)條件下酶活較大。因此誘變均在1號培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基條件下進(jìn)行。

2.8 誘變結(jié)果

2.8.1 紫外誘變結(jié)果 紫外誘變致死率情況如表10所示, 結(jié)果顯示紫外線處理時間應(yīng)控制在60—150s。

在120s處理的平板上得到HC比值最大的菌株(HC比值為5.3)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng), 最終得到酶活為182.8U/mL。相比于初始酶活104.7U/mL, 酶活提高74.6%, 并將得到的菌株進(jìn)行DES誘變。

圖5 根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的菌株A20以及相關(guān)種、屬的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 The NJ evolutionary tree based on completed sequence of Strain A20 16S rDNA

表9 堿性蛋白酶活力測量結(jié)果Tab.9 Alkaline protease activity measurement results

表10 紫外線誘變結(jié)果Tab.10 The result of ultraviolet mutation

2.8.2 DES誘變結(jié)果 DES誘變結(jié)果致死率如表11所示, 結(jié)果顯示處理時間應(yīng)控制在30—50min。

表11 DES處理結(jié)果Tab.11 The result of DES mutation

在處理50min的平板上獲得HC比值最大的菌株(HC比值為5.9), 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng), 最終得到酶活為227.5U/mL, 酶活提高51.8%。

2.9 傳代試驗

將DES處理過的酶活為227.5U/mL的A20菌株進(jìn)行傳代試驗, 轉(zhuǎn)接種10次, 測試酶活結(jié)果如表12所示。

表12 傳代10次的酶活測試結(jié)果Tab.12 Results of enzyme activity test after ten times of subculture

連續(xù)傳代10代結(jié)果顯示酶活最低為第10代的208.9U/mL, 酶活下降8.17%, 酶活下降較少, 誘變后的菌株較為穩(wěn)定。

2.10 最適溫度

各溫度下酶活測試結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示發(fā)酵溫度為50°C具有最高酶活, 酶活為227.9U/mL。

2.11 最適pH值

各pH下酶活如圖7所示。結(jié)果顯示當(dāng)pH 9.0時酶活最高。

圖6 最適溫度試驗Fig.6 The optimal temperature test

圖7 最適pH試驗Fig.7 The optimal pH test

2.12 最適培養(yǎng)時間

培養(yǎng)時間為36h之前為菌體生長階段, 此時產(chǎn)酶較少, 酶活較低, 當(dāng)培養(yǎng)時間超過48h以后, 菌體進(jìn)入產(chǎn)酶階段, 酶活逐漸增加, 當(dāng)培養(yǎng)時間為72h時, 酶活最高, 為228.5U/mL。詳見圖8。

圖8 最適培養(yǎng)溫度試驗Fig.8 Testing for the optimal culture time

3 討論

從舟山潮間帶海域中篩選得到產(chǎn)堿性蛋白酶的放線菌菌株A20, 生理生化試驗和16S rDNA分析結(jié)果顯示該菌株為Streptomyces roseus, 記為Streptomyces roseusA20, 該菌株在淀粉-黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基中酶活較高, 這可能與黃豆粉屬于慢速利用氮源有關(guān)。紫外誘變顯示在處理時間為60—120s, 致死率為76.5%—90.1%時得到正突變株, 此時得到的誘變菌株透明圈明顯較大, 經(jīng)測定酶活為182.8U/mL, 與初始菌株相比酶活提高74.6%。再經(jīng)過30—50min DES誘變處理,致死率為68.8%—93.8%時得到正突變株, 酶活為227.5U/mL, 比初始酶活104.7U/mL提高117.3%, 誘變效果較為明顯。傳代試驗顯示突變株具有較好的遺傳穩(wěn)定性, 在連續(xù)傳代10次測定酶活發(fā)現(xiàn)該酶酶活無明顯下降。單因素試驗結(jié)果顯示在發(fā)酵溫度為50°C、pH值為9.0, 培養(yǎng)時間為72h時候酶活最高。

利用物理或者化學(xué)方法進(jìn)行誘變育種是一種常規(guī)的獲取高產(chǎn)菌株的方法, 盡管其具有一定的優(yōu)點(diǎn),如: 能夠提高突變率, 在較短的時間內(nèi)獲得更多的優(yōu)良變異類型。但是, 誘變育種也存在一些問題, 如:有益突變頻率仍然較低, 變異的方向和性質(zhì)難控制。因此提高誘變效率, 迅速鑒定和篩選突變體以及探索定向誘變的途徑, 是當(dāng)前研究的重要課題。

復(fù)合誘變的效果往往要好于單種誘變劑的誘變效果, 這可能是由于先用物理誘變劑處理以后, 微生物細(xì)胞細(xì)胞膜的完整性或者滲透性有所改變, 然后再用化學(xué)試劑進(jìn)行處理, 就能更好的與細(xì)胞染色體位點(diǎn)進(jìn)行接觸從而使得誘變效率增加。Ahmed等(2013)先后用伽馬輻射和EMS復(fù)合誘變菌株P(guān)enicillium chrysogenumNRRL 792, 得到產(chǎn)最高酶活誘變體菌株EMS-1, 試驗結(jié)果還顯示突變體菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的穩(wěn)定性(pH, 熱穩(wěn)定性)要大大好于野生型。電泳結(jié)果顯示野生型與突變型的蛋白酶分子量大小也不同, 誘變結(jié)果改變了堿性蛋白酶的分子結(jié)構(gòu)。

目前誘變育種已經(jīng)與基因工程進(jìn)行很好的結(jié)合,從而獲得更加穩(wěn)定而高產(chǎn)的突變菌株。Wang等(2010)從嗜冷產(chǎn)堿性蛋白酶海洋微生物菌株P(guān)seudomonassp.中, 利用反向PCR技術(shù)克隆該酶的結(jié)構(gòu)基因, 發(fā)現(xiàn)1443bp的OFR編碼一組無信號肽的463氨基酸, 序列比對結(jié)果顯示該酶屬于絲氨酸類型的金屬蛋白酶,重組蛋白在Escherichia coli成功進(jìn)行表達(dá)。Jasmin等(2010)從海洋真菌Engyodontium album中克隆堿性蛋白酶基因(Eap), 并對其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推測。

堿性蛋白酶主要在洗滌工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用。尤其新型的耐氧化、耐高溫、耐堿性、耐高鹽度、耐有機(jī)溶劑、及在低溫環(huán)境下具有較高酶活的一類堿性蛋白酶更是其中研究的熱點(diǎn)。

Tsuyoshi等(2004)研究了枯草桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的抗氧化性穩(wěn)定性, 并應(yīng)用于洗滌劑行業(yè)。Kunamneni等(2003)研究了枯草芽孢桿菌PE-11產(chǎn)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性, 發(fā)現(xiàn)該酶在60°C處理了350min后仍保持100%酶活力。Sudhir等(2010)在一株新穎的嗜高溫菌株P(guān)aenibacillus tezpurensissp. nov. AS-S24-II發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)清潔穩(wěn)定性良好的堿性蛋白酶。WANG等(2012)在印尼溫泉中篩選到一株產(chǎn)堿性蛋白酶菌株Brevibacillussp. PLI-1, 試驗結(jié)果顯示在70°C時該酶具有最高活性。

Raja等(2006)對耐有機(jī)溶劑的堿性蛋白酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究, 利用硫酸銨鹽析及層析方法純化酶,酶活力提高了近124倍。Subramani等(2009)篩選到一株海洋放線菌MML1614, 發(fā)現(xiàn)其具有很好的耐熱與耐堿性, 與洗滌劑結(jié)合后使洗滌效果大幅增加。Hames-Kocabas等(2007)從海泥樣品中篩選得到堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株MA1-1, 在pH 9.0、50°C有較高酶活, 同時鑒定出此堿性蛋白酶屬于絲氨酸基團(tuán)。Jignasha等(2009)在印度沿海篩選到一株嗜堿放線菌Mit-1, 其產(chǎn)堿性蛋白酶不僅耐鹽耐高溫(70°C最適宜溫度), 且耐受有機(jī)溶劑, 此類蛋白酶的報道極為罕見。Iram等(2012)在克什米爾地區(qū)的冰川土壤中篩選到一株食單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)菌株, 該菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶在較低溫度(15°C)時具有最高酶活, 而低溫清洗能對一些高檔絲綢織物起到很好的保護(hù)作用。

在某些方面, 蛋白酶甚至被用在回收利用廢棄的貝殼類動物中(Anil, 2010), 在處理蓖麻殼的浪費(fèi)上(Madhuriet al, 2012)也能得到應(yīng)用。Feng等(2013)在菌株Kocuria kristinaeF7的發(fā)酵液中分離到一種很罕見的堿性絲氨酸蛋白酶, 該蛋白酶除了耐鹽耐高溫, 還能改善大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的口味, 在食品工業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。蛋白酶可以被用作脫毛劑使用, Vijay等(2011)從Bacillus altitudinisGVC11分離到一種新穎的絲氨酸蛋白酶, 試驗發(fā)現(xiàn)該酶作用于山羊毛具有很好的脫毛效果, 卻不會損壞羊毛中的膠原蛋白也不影響羊毛的完整性。

影響菌株產(chǎn)酶的因素有很多, 如: 溫度、pH、碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、鹽度、溶氧(轉(zhuǎn)速)等等, 選擇合理的粗酶分離純化過程, 從而很好保持甚至提高其酶活也非常重要。因此, 如何優(yōu)化培養(yǎng)方案、選擇合適的分離純化工藝, 將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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