龔詩雁 屠燕萍 謝志浩

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室 寧波 315211)

在長期的生物進化過程中, 海洋微藻和細菌之間形成了獨特的生態(tài)關(guān)系, 一方面, 細菌通過分泌多種胞外酶, 把大分子有機物質(zhì)分解成小分子物質(zhì), 經(jīng)菌體細胞吸收利用, 并把有機物質(zhì)礦化成無機鹽類,促進單細胞藻類的生長, 一些細菌通過消耗藻細胞周圍環(huán)境中高濃度的溶解氧, 為微藻提供一個還原性強的生存壞境, 使得微藻更好地進行光合作用, 藻類通過光合作用為微生物提供溶解氧和有機物(Adachiet al, 1974; Haineset al, 1974; Maruyamaet al,1986; Mougetet al, 1995; 林偉等, 2000; Mayaliet al,2002)。另一方面, 有些細菌可以直接通過營養(yǎng)競爭或產(chǎn)生抑藻物質(zhì)抑制微藻的生長或殺死藻類, 也可通過與藻類直接接觸導(dǎo)致藻細胞死亡; 藻類通過分泌毒素、抗生素或粘液等物質(zhì)抑制、殺死細菌(李福東等,1996; 林偉等, 2001; 王新等, 2007; 張俊等, 2010; 趙銳等, 2013)。目前16S rRNA已經(jīng)成為細菌系統(tǒng)分類研究中最常用有效的分子指標, 廣泛應(yīng)用于微生物的遺傳特性和分子差異的研究, 國際上已建立多個微生物16S rRNA序列數(shù)據(jù)庫, 通過對未知微生物DNA序列的測定和比較, 可以對其進行快速、有效的鑒定(戴欣等, 2000)。米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)是我國海域一種分布廣泛的魚毒性赤潮藻, 本實驗對米氏凱倫藻藻際異養(yǎng)細菌進行了分離鑒定, 并對其種屬關(guān)系進行了分析, 為藻菌關(guān)系的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種和試劑

實驗藻種米氏凱倫藻由中國海洋大學(xué)微藻培養(yǎng)室提供。培養(yǎng)液為f/2營養(yǎng)鹽配方, 培養(yǎng)條件為: 溫度(20±1)°C, 光照強度3000 lx, 光暗比12h:12h, pH=8.0 ± 0.1, 鹽度30 ± 1.0。培養(yǎng)至指數(shù)期用于分離異養(yǎng)細菌實驗。2216E固體培養(yǎng)基購自海博生物公司,2216E液體培養(yǎng)基: 蛋白胨5g, 酵母膏1g, 磷酸高鐵0.1g, 陳海水1000mL。正向引物27F和反向引物907R合成于Invitrogen, 使用前8000r/min離心5min, 加超純水稀釋到10nmol/L, 保存于–20°C備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 異養(yǎng)菌株的分離和保存 超凈工作臺中取指數(shù)生長期的米氏凱倫藻稀釋成不同密度梯度, 各移取100μL到2216E固體培養(yǎng)基上, 用三角玻璃棒均勻涂布開, 倒置培養(yǎng)于21°C培養(yǎng)箱中, 長出單菌落后按照形態(tài)、顏色大小進行分離純化, 挑取單菌落至事先高溫高壓滅菌的2216E液體培養(yǎng)基中, 21°C、100r/min恒溫搖床搖30h, 用于DNA提取, 剩余的加入15% (V/V)甘油, 保存于–80°C超低溫冰箱中。

1.2.2 細菌DNA制備 取搖培后的培養(yǎng)液100μL經(jīng)10000r/min離心5min, 去除上清, 參照曾潤穎等(2002)的方法制備細菌DNA。菌體加入200μL 6mol/L鹽酸胍后混勻裂解, 往裂解液中加入200μL酚/氯仿/異戊醇(25︰24︰1)混合溶液進行抽提。抽提液經(jīng)離心后取上層水相, 加入等體積異丙醇沉淀5min, 離心吸去上清, 沉淀用70%乙醇洗兩次, 放置超凈臺內(nèi)吹干。加入200μL TE溶液溶解, 同時加入2μL RNase(濃度為10μg/μL ), 于37°C酶解1h。往溶液中加入等體積異丙醇和2μL 1mol/L MgCl2, 室溫放置10min后15000r/min離心2min, 除去上清, 沉淀用70%乙醇洗兩次, 放置超凈臺內(nèi)吹干, 溶解于20μL TE溶液后于–20°C保存。

1.2.3 16S rRNA基因序列的擴增 采用細菌的16S rRNA基因序列通用引物27F (5′ AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 3′)和907R (5′ CCGTCAATTCCTTTR AGTTT 3′)對異養(yǎng)細菌的16S rRNA基因序列進行擴增。反應(yīng)體系和程序見表1和表2。

取3μL PCR產(chǎn)物跑電泳, 凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照保存, 條帶明亮單一的送上海立菲生物技術(shù)有限公司進行測序。

表1 PCR擴增反應(yīng)體系Tab.1 PCR amplification reactions

表2 反應(yīng)程序Tab.2 PCR reaction conditions

1.2.4 序列分析 把測序所得的序列在NCBI上與數(shù)據(jù)庫已有的細菌16S rRNA序列進行blast比對,挑選同源性大的細菌和4株異養(yǎng)細菌序列比對,Clustal X先建立aln文件, 然后用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 異養(yǎng)細菌的分離

從米氏凱倫藻中分離到了4株主要的藻際細菌,標為P1、P2、P3和P4(圖1), P1為淡黃色菌落, P2為黃綠色菌落, P3橙紅色, P4為淺黃色菌落, 這些細菌都可以在2216E培養(yǎng)基上快速生長。

圖1 P1、P2、P3和P4菌落Fig.1 P1, P2, P3 and P4 colonies

2.2 16S rRNA基因序列測序結(jié)果

PCR產(chǎn)物跑電泳后, 經(jīng)凝膠圖像觀察4株細菌的條帶都單一且明亮(圖2), 送上海立菲生物技術(shù)有限公司進行測序, P1序列為883bp, P2為836bp, P3為886bp, P4為814bp, 測序結(jié)果如圖3。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 Detection of PCR product

圖3 P1、P2、P3和P4序列Fig.3 P1, P2, P3 and P4 sequence

2.3 同源性分析

同源性是兩種核酸分子的核苷酸序列之間, 或兩種蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列之間相同的程度。將測得的4株米氏凱倫藻異養(yǎng)細菌16S rRNA序列在NCBI上所存在的序列比對后所得結(jié)果見表3。

根據(jù)序列比對結(jié)果, 4株細菌分別隸屬于4個屬,它們分別是Formosa、Erythrobacter、Shewanella和Marinobacter。16S rRNA序列同源性大于等于99%,可以確定為細菌種水平, 同源性小于99%可確定為細菌屬水平(Hentschelet al, 2001)。除了P1, P2、P3和P4與已知序列相似度都大于等于99%, 因此都可以確定到種的水平。

表3 米氏凱倫藻4株異養(yǎng)細菌16S rRNA基因序列比對Tab.3 16S rRNA sequence comparison of four strains of heterotrophic bacteria from K. mikimotoi

2.4 進化樹

對所測定的4株米氏凱倫藻異養(yǎng)細菌以及NCBI數(shù)據(jù)庫上與它們同源性最大的28株細菌16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 如圖4, 可以看出28株細菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中主要分成Formosa、Erythrobacter、Shewanella和Marinobacter四個分支,Formosa屬中存在黃桿菌科類的細菌, 與Bizionia屬的細菌親緣關(guān)系相近。從米氏藻異養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹上還可以看出, 同一種屬中的細菌也存在獨立的分支, 可能是由于深海細菌在物種進化中受到了深海壞境的影響所致(曾潤穎等, 2002; 喬洪金等, 2012)。

3 討論

3.1 菌種的鑒定

異養(yǎng)細菌對于微藻的生長繁殖, 代謝都起著非常重要的作用, 所以對海洋細菌的研究已越來越多,鑒定方法也越來越多, 以前傳統(tǒng)的表型和化學(xué)鑒定已遠遠不能滿足, 有些傳統(tǒng)的菌種鑒定是選用不同的代謝產(chǎn)物作為碳源, 以碳源作為鑒定的指標, 但是該方法前提條件是菌株要在37°C條件下正常生長, 一般來說, 海洋細菌最適生長溫度為10—25°C, 所以這種方法是不適用的, 而且細菌很多種屬之間生理生化特征都比較相似, 隨著分子生物學(xué)研究的深入,目前16S rRNA已經(jīng)成為細菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中最常用也是最有效的分子指標, 被廣泛地應(yīng)用于各種微生物的遺傳特性和分子差異的研究(曾潤穎等, 2002)。利用分子方法研究藻類附生細菌群落的組成, 是簡便、快速又有效的一種方法。相比于陸地微生物, 海洋微生物的分離培養(yǎng)會更加困難, 目前可以被分離培養(yǎng)的海洋微生物比例不到0.1%。由于海洋附生細菌和其宿主之間存在著非常特殊的相互依賴的關(guān)系,即競爭拮抗和相互促進關(guān)系, 所以藻際細菌很難分離, 或者離開這一藻際微環(huán)境, 分離的細菌難以培養(yǎng),而且人工培養(yǎng)的細菌也可能會發(fā)生一定的變化。

3.2 4株米氏凱倫藻異養(yǎng)細菌

P1細菌與Formosa核苷酸序列同源性達到了100%, 但與其最接近的種相似度只有95%, 所以P1只能確定到屬的水平, 其中與黃桿菌屬(Flavobacterium)序列相似度達99%, 黃桿菌屬是新建的一個菌屬, 為革蘭氏陰性菌, 分布于土壤、淡水和海洋中, 有研究表明, 黃桿菌屬能誘導(dǎo)孔石莼形態(tài)發(fā)生變化(Nakanishiet al, 1996), Fukami等(1992)還發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬具有溶藻活性; P2細菌與赤細菌屬(Erythrobacter)序列相似性達到了100%, 同時與其最接近的種E. piscidermidis序列相似度也達100%, 赤細菌屬是一類光合細菌,具有營養(yǎng)、凈化水體等作用(李筠等, 2006)。張春丹等(2011)在對瓶裝泥螺和蟹糊細菌多樣性研究中篩選到了一株E. piscidermidis細菌。芳烴赤細菌(E.aromatiphilus)能降解原油, 清理海洋中石油的污染(譚田豐, 2006); P3與希瓦氏菌屬(Shewanella)序列相似性達到99%, 且和S. putrefaciensHac411菌株序列相似度也達到99%, 希瓦氏菌屬通?？梢詮暮Ｔ?、貝類、魚的表面分離到, 有些希瓦氏菌可以引起魚的腐敗, 微生物膜中的希瓦氏菌對滸苔屬游孢子的生殖具有促進作用(Pratixaet al, 2003)。劉杰等(2009)從暴發(fā)的滸苔上分離到了2株希瓦氏菌屬。王彪等(2010)從廈門白城海域的潮間帶表面沉積物中篩選到一株具有電催化活性的菌株Shewanellasp. S2, 具有產(chǎn)電活性; P4細菌與海桿狀菌屬(Marinobacter)序列相似性達到了99%, 與其最接近的種——除烴海桿菌(M.hydrocarbonoclasticus)相似度也達到了99%, 海桿菌,革蘭氏陰性, 可以利用多糖類和有機酸類的碳源, 且對氨芐青霉素、氧哌嗪青霉素等多種抗生素敏感, 李倩等(2011)從黃海沉積物中分離到了一株Marinobactersp. PY97S, 它能降解多種多環(huán)芳烴和烷烴的海洋石油, 具有應(yīng)用到溢油污染海洋環(huán)境生物修復(fù)的潛力。由于低蛋白酶具有溫度低、熱敏感等特點,是一類非常重要的工業(yè)用酶, 林念煒等(2004)從南極海域沉積物中篩選到的一株Marinobactersp. R2就具有產(chǎn)低溫蛋白酶的功能。高玉光(2011)在研究油田采油功能菌時, 從北海分離到了除烴海桿菌, 具有石油烴降解功能。

藻際細菌是在藻際環(huán)境里形成的具有一定功能和結(jié)構(gòu)的, 并與藻類有相互作用的微生物群落。它們對微藻的繁殖、生長、死亡、孢囊形成都有著極為重要的作用。藻際細菌群落多樣性受細菌總體數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)、種群優(yōu)勢度和均勻度等方面的影響, 當群落多樣性變化顯著時, 可伴隨水質(zhì)的變壞與病害的發(fā)生(鄧剛等, 2005; 馮勝等, 2010), 從而影響微藻的生長。目前對于藻菌關(guān)系的研究有助于人們在此基礎(chǔ)上找到一種調(diào)控赤潮藻生長的方法, 以期將這種方法運用到赤潮的生物防治過程中。

王 彪, 黃杰勛, 章曉波等, 2010. 一株海洋產(chǎn)電菌Shewanellasp. S2的篩選和產(chǎn)電分析. 微生物學(xué)通報,37(3): 342—348

王 新, 周立紅, 鄭天凌等, 2007. 塔瑪亞歷山大藻藻際細菌溶藻過程. 生態(tài)學(xué)報, 27(7): 2864—2871

鄧 剛, 呂軍儀, 林 強, 2005. 大海馬育苗池水華發(fā)生期間細菌動態(tài)及相關(guān)理化參數(shù). 中國水產(chǎn)科學(xué), 12(4): 477—482

馮 勝, 李定龍, 秦伯強, 2010. 太湖水華過程中微生物群落的動態(tài)變化. 寧波大學(xué)學(xué)報, 23(1): 7—12

喬洪金, 劉相全, 馬晶晶等, 2012. 5株海洋微藻伴生細菌的分離鑒定與功能分析. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 40(29): 14421—14424

劉 杰, 王曉姍, 王能飛等, 2009. 青島近海滸苔粘附著細菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究. 科學(xué)技術(shù)與工程, 9(8): 2042—2046

李 倩, 崔志松, 趙愛芬等, 2011. 一株石油烴降解菌新種Marinobactersp. PY97S的鑒定. 微生物學(xué)報, 51(5): 648—655

李 筠, 周宏霞, 劉佳琳等, 2006. 青島近岸特征環(huán)境中海洋異養(yǎng)細菌的分布規(guī)律及其分子鑒定. 中國海洋大學(xué)學(xué)報,36(6): 965—970

李福東, 張 誠, 鄒景忠, 1996. 細菌在浮游植物生長過程中的作用. 海洋科學(xué), (6): 30—34

張 俊, 楊宇峰, 龔映雪等, 2010. 中肋骨條藻與鏈狀斯氏藻藻際細菌溶藻效應(yīng)研究. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 30(6): 1271—1279

張春丹, 陳 燕, 全晶晶等, 2011. 瓶裝泥螺和蟹糊中細菌多樣性研究. 食品科學(xué), 32(1): 185—188

林 偉, 陳 騳, 劉秀云, 2000. 海洋微藻除菌及除菌與自然帶菌微藻生長特點比較. 海洋與湖沼, 31(6): 647—652

林 偉, 陳 騳, 劉秀云, 2001. 海洋微藻培育系統(tǒng)抗弧菌作用機理. 海洋與湖沼, 32(1): 7—14

林念煒, 張 銳, 趙 晶等, 2004. 南極產(chǎn)低溫蛋白酶菌株Marinobactersp. R2的發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)研究. 廈門大學(xué)學(xué)報, 43(6): 865—869

趙 銳, 王 紅, 張曉華等, 2013. 青島海區(qū)4種大型海藻可培養(yǎng)附生細菌多樣性研究. 中國海洋大學(xué)學(xué)報, 43(3):44—49

高玉光, 2011. 油田采油功能菌的研究. 荊州: 長江大學(xué)碩士學(xué)位論文, 16—17

曾潤穎, 趙 晶, 2002. 深海細菌的分子鑒定分類. 微生物學(xué)通報, 29(6): 12—16

譚田豐, 2006. 海洋石油降解菌的分離鑒定及其在海洋石油污染物修復(fù)中的應(yīng)用研究. 廈門: 廈門大學(xué)碩士學(xué)位論文,37—47

戴 欣, 陳月琴, 周 惠等, 2000. 海洋細菌的分子鑒定分類.中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 39(1): 68—71

Adachi M, Kanno T, Matsubara T, 1974. Promotion of cyst formation in the toxic dinoflagellateAlexandrium(Dinophyceae) by natural bacterial assemblages from Hiroshima Bay, Japan. Journal of Phycology, 10: 245—252

Fukami K, Yuzawa A, Nishijima Tet al, 1992. Isolation and properties of a bacterium inhibiting the growth ofGymnodinium nagasakiense. Nippon Suisan Gakkaishi, 58(6): 1073—1077

Haines K C, Guillard R R L, 1974. Growth of vitamin B12-requiring marine diatoms with vitamin B12-producing marine bacteria. Journal of Phycology, 10: 245—252

Hentschel U, Schmid M, Wagner M, 2001. Isolation and phylogenetic analysis of bacteria with antimicrobial activities from the mediterranean spongesAplysina aerophobaandAplysina cavernicola. FEMS Microbiology Ecology, 35: 305—312

Maruyama A, Maeda M, Simidu U, 1986. Occurrence of plant hormone (cytokinin)-producing bacteria in the sea. Journal of Applied Bacteriology, 61: 569—574

Mayali X, Doucette G J, 2002. Microbial community interactions and population dynamics of an algicidal bacterium activeKarenia breas(Dinophyceae). Harmful Algae, 1: 277—293

Mouget J, Dakhama A, Lavoie M C, 1995. Algal growth enhancement by bacteria: Is consumption of photosynthetic oxygen involved?. FEMS Microbiology Ecology, 18(1): 35—43

Nakanishi K, Nishijima M, Masamichi Net al, 1996. Bacteria that induce morphogenesis inUlva pertusa(Chlorophyta)grown under axenic conditions. Journal of Phycology, 32(3):479—482

Pratixa P, Callow M E, Ian Jet al, 2003. Specificity in the settlement-modifying response of bacterial biofilms towards zoospores of the marine algaEnteromorpha. Environmental Microbiology, 5(5): 338—349