王中華 徐茂琴 謝 利 張迪駿 周 君 何偉娜 陳麗萍 童茜茜 張春丹 蘇秀榕

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院 寧波 315100;3. 國(guó)家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 青島 266061)

高通量454焦磷酸測(cè)序, 是以DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)和皮升級(jí)(picolilter, 10–12liter)焦磷酸為基礎(chǔ)的測(cè)序方法(Margulieset al, 2005), 該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于土壤(Roeschet al, 2007)、海洋(Paleniket al, 2009)等環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中。擬桿菌門(mén)(Bacteroidete)是腸道中數(shù)量最大的革蘭氏陰性細(xì)菌, 在人和鼠的盲腸內(nèi)容物中擬桿菌屬占總細(xì)菌的20%—40% (Woodet al, 1998)。雖然擬桿菌可以從腸道中分離得到, 但是部分?jǐn)M桿菌是可以致病的, 而人們對(duì)與擬桿菌的認(rèn)識(shí)也是從致病性開(kāi)始(Wexler, 2012), 作為條件致病菌的擬桿菌, 當(dāng)其正常的微生態(tài)平衡被打破時(shí)可引發(fā)內(nèi)源性感染。隨著時(shí)間的發(fā)展和研究的深入, 人們逐漸發(fā)現(xiàn)擬桿菌和其它菌群與宿主之間微妙而又復(fù)雜的關(guān)系, 對(duì)宿主健康起著重要的作用(吳彥彬等, 2007),而在另一方面, 這類長(zhǎng)期被環(huán)境檢測(cè)和公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)所忽略的微生物逐漸為指示水體所受的糞源污染提供了一條新的途徑(Wadeet al, 2006)。而擬桿菌門(mén)還包括另外兩綱, 分別為黃桿菌綱(Flavobacteria)和鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)。黃桿菌綱主要存在于水生環(huán)境中, 也會(huì)在食物中存在, 多數(shù)黃桿菌綱細(xì)菌對(duì)人無(wú)害, 但腦膜膿毒性金黃桿菌(Chryseobacterium meningosepticum)可引起新生兒腦膜炎(Linet al,2010)。而鞘脂桿菌綱在海洋細(xì)菌中占有較大比例, 可以降解纖維素(Liet al, 2011)。

本文選取寧波沿海10個(gè)主要的陸源排污口, 分別對(duì)排污口處和距排污口50m以外的20個(gè)站位的水樣進(jìn)行分析。在454焦磷酸測(cè)序基礎(chǔ)上, 首先對(duì)各個(gè)站點(diǎn)總體情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 再根據(jù)不同采樣月份各站位擬桿菌門(mén), 包括擬桿菌綱、黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱檢出頻次的統(tǒng)計(jì), 分析擬桿菌門(mén)的分布概況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇寧波市10個(gè)陸源排污口, 分別為象山爵溪東塘排污口(S1)、象山水桶岱垃圾場(chǎng)滲透水排污口(S2)、象山石浦水產(chǎn)加工園區(qū)排污口(S3)、象山西周工業(yè)園區(qū)綜合排污口(S4)、象山墻頭綜合排污口(S5)、北侖三山排污口(S6)、寧海西店崔家綜合排污口(S7)、奉化市下陳排污口(S8)、寧海顏公河入海排污口(S9)和余姚黃家埠排污口(S10)(陳麗萍等, 2013)。將5 L的桶消毒后采集各占站點(diǎn)的水樣。樣品收集時(shí)間分別為2011年3月、5月、8月、10月。10個(gè)站點(diǎn)分別標(biāo)記為S1—S10, 采樣月份分別標(biāo)記為M3、M5、M8、M10, 排污口和排污口50m以外水樣分別標(biāo)記為–0和–50。樣品采集完畢后, 立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室, 用0.2 μm微濾膜對(duì)污水進(jìn)行過(guò)濾之后進(jìn)行DNA提取。

1.2 總DNA提取及擴(kuò)增

利用水體細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek), 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA, 測(cè)定OD260/OD280在1.8—2.0, OD260/OD230高于1.7。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物, 其序列如下: P1:5’-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3’; P2: 5’-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3’。反應(yīng)體系如下: 10×buffer 2.5μL、25 mmol/L MgCl22.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL、10μmol/L 引物各 1.0μL, 1.0 U rTaq酶、模板DNA 1.0μL, 無(wú)菌超純水補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性4 min; 94°C變性45 s, 56°C退火45 s,72°C延伸1 min, 30個(gè)循環(huán); 72°C延伸 10 min。取23μL PCR產(chǎn)物, 加入5μL 10×loading buffer混勻,1%瓊脂糖凝膠電泳, –20°C冰箱保存?zhèn)溆?周君等,2012)。

1.3 測(cè)序與分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)合格后, 利用新一代高通量測(cè)序平臺(tái)454 GS FLX Titanium對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。利用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 454測(cè)序數(shù)據(jù)總體分析

通過(guò)454高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)20個(gè)站點(diǎn)4個(gè)檢測(cè)月份80個(gè)樣品進(jìn)行鑒定分析, 共成功鑒定24個(gè)門(mén),主要包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)和后壁菌門(mén)(Firmicutes)等(表1), 其中變形菌門(mén)在各個(gè)月份中一直為優(yōu)勢(shì)菌門(mén), 甚至在5月份達(dá)到了4個(gè)檢測(cè)月份中最高的65.29%。其次為擬桿菌門(mén), 其出現(xiàn)頻次百分比隨著月份的增加而遞增,與之變化趨勢(shì)相同的還有梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)。郭世奎等(2010)在利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法比較直腸癌患者與正常人的腸道中的擬桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacterium)和梭菌屬(Clostridium)時(shí), 發(fā)現(xiàn)直腸癌患者的腸道中的三種菌屬均高于正常人, 有共同上升的趨勢(shì), 呈現(xiàn)出致病性的高相關(guān)性。另外, 放線菌門(mén)(Actinobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、熱袍菌門(mén)(Thermotogae)和廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)等也呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì), 均為前三個(gè)月份遞增, 10月份下降的趨勢(shì)。

2.2 擬桿菌門(mén)及其綱的分布特點(diǎn)

經(jīng)過(guò)對(duì)454測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 擬桿菌門(mén)下共鑒定出3個(gè)綱(目), 分為為擬桿菌綱(目)、黃桿菌綱(目)和鞘脂桿菌綱(目), 擬桿菌目下共有3個(gè)科5個(gè)屬,黃桿菌目下共有2個(gè)科17個(gè)屬, 鞘脂桿菌目下共有4個(gè)科5個(gè)屬。

四個(gè)檢測(cè)月份各個(gè)排污口擬桿菌綱、黃桿菌綱與鞘脂桿菌綱的分布情況如圖1, 其中8月份細(xì)菌檢出頻次較其它三個(gè)檢測(cè)月份明顯減少, 推測(cè)可能和采樣時(shí)的水溫有關(guān), 四個(gè)檢測(cè)月份大部分站點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)屬為黃桿菌綱, Liu等(2013)對(duì)春天浮游植物暴發(fā)后的黃海海域進(jìn)行了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析, 結(jié)果顯示黃桿菌綱也是其優(yōu)勢(shì)菌種之一。其次為擬桿菌綱, 鞘脂桿菌綱出現(xiàn)較少, 但在某特定站點(diǎn)特定月份會(huì)出現(xiàn)反?，F(xiàn)象, 比如5號(hào)站點(diǎn)排污口50m處8月份時(shí),鞘脂桿菌綱出現(xiàn)的次數(shù)和黃桿菌綱基本相同, 而擬桿菌綱出現(xiàn)極少。

利用R For Windows 3.0 對(duì)各個(gè)排污口的擬桿菌門(mén)出現(xiàn)情況進(jìn)行聚類分析, 見(jiàn)圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較明顯時(shí)空變化, 10個(gè)站點(diǎn)擬桿菌門(mén)出現(xiàn)的情況大致可以分為兩類, 一類是S1、S3、S9、S5和S2站點(diǎn), 另一類是S4、S8、S7、S10和S6站點(diǎn)。其中S1與S3站點(diǎn)、S2與S5站和S4與S8站點(diǎn)相似

度最高, 從排污口類型來(lái)看, S1與S3站點(diǎn)均為工業(yè)性排污口, S4與S8排污口均為排污河, 故推測(cè)可能與排污口類型存在較大的聯(lián)系。而從采樣月份來(lái)看, 相關(guān)度最高的為8月份和10月份, 而3月份和5月份也存在一定的相關(guān)性, 這表明擬桿菌門(mén)的出現(xiàn)情況與季節(jié)也有一定的聯(lián)系, 但對(duì)于所有排污口而言, 菌群結(jié)構(gòu)在不同季節(jié)的變化比空間的不同所形成的差異更為顯著。Díez-Vives等(2014)通過(guò)對(duì)不同時(shí)間分布、不同空間分布的擬桿菌進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析, 也認(rèn)為不同的地點(diǎn)和不同的季節(jié)會(huì)導(dǎo)致擬桿菌群落結(jié)構(gòu)的變化。

表1 454測(cè)序結(jié)果總體情況分析Tab.1 Results of the pyrosequencing (454 Life Sciences)

圖1 不同檢測(cè)月份不同排污口擬桿菌綱、黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱分布情況Fig.1 The distribution statistics of Bacteroidetes, Flavobacteria and Sphingobacteria in different sewage outlets and months a. 3月; b. 5月; c. 8月; d. 10月

圖2 不同檢測(cè)月份不同排污口站位擬桿菌門(mén)數(shù)量聚類分析Fig.2 The cluster analysis on number of Bacteroidetes in different sewage outlets and months

將排污口和排污口50m處擬桿菌綱、鞘脂桿菌綱與黃桿菌綱出現(xiàn)的次數(shù)進(jìn)行整合, 針對(duì)不同類型排污口進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 如圖3所示。擬桿菌綱在2個(gè)排污口(S5和S7)呈現(xiàn)出隨著月份的推進(jìn)而大幅下降的趨勢(shì), 而在另外兩個(gè)排污口(S2和S3)呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì), 其余站點(diǎn)較上述四個(gè)站點(diǎn)變化幅度較為平緩, 各個(gè)月份變化波動(dòng)很小。傳統(tǒng)的指示菌逐漸暴露出與沙門(mén)氏菌等致病菌的相關(guān)性差、無(wú)法辨識(shí)糞源污染(Nobleet al, 2001), 擬桿菌以其在腸道內(nèi)數(shù)量的絕對(duì)優(yōu)勢(shì), 在受污染的水體中不能存活很長(zhǎng)時(shí)間(約1—2d)、并不能繁殖(Converseet al, 2009), 且通過(guò)16S rRNA基因序列的差異能夠分辨糞源的污染來(lái)源是人類還是畜類等特點(diǎn)(張薇薇等, 2010), 為指示水體所受的糞源感染提供了一種新的途徑(Wadeet al,2006)。從各個(gè)排污口看, S5象山墻頭綜合排污口在3月份糞源污染最嚴(yán)重, 隨著時(shí)間的推進(jìn), 糞源污染逐步減輕, 而S2象山水桶岙垃圾場(chǎng)滲透液排污口在5月份糞源污染較為嚴(yán)重。

而黃桿菌綱在不同類型的排污口中的變化幅度雖不同, 但是呈現(xiàn)出較為一致的變化趨勢(shì), 即大部分站點(diǎn)5月份的檢出頻次普遍高于3月份, 10月份的檢出頻次普遍高于8月份, 而8月份較5月份呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì), 推測(cè)可能和取樣時(shí)的水溫有一定關(guān)系。從排污口類型看, S2象山水桶岙垃圾場(chǎng)滲透液排污口作為市政排污口, 與其它9個(gè)排污口呈現(xiàn)出明顯的不同,黃桿菌綱出現(xiàn)次數(shù)很少, 推測(cè)可能與排污口污水中的成分有關(guān)。

與黃桿菌綱和擬桿菌綱不同, 鞘脂桿菌綱出現(xiàn)頻次較低, 且不同月份之間變化的幅度并沒(méi)有之前兩種菌的大, 次數(shù)最多的只有S4象山西周工業(yè)園區(qū)綜合排污口在5月份的381次。由于鞘脂桿菌綱屬于寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌, 分離和純化十分困難, 和振花等(2011)將北極海水樣品放置于連續(xù)透析培養(yǎng)裝置中, 4°C培養(yǎng)3個(gè)月之后, 以0.22μm硝酸纖維膜過(guò)濾至富集,再將濾膜置于寡營(yíng)養(yǎng)瓊脂上2°C培養(yǎng)4月, 獲得可培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌。454高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn), 克服了環(huán)境中大多數(shù)微生物“存活但不能培養(yǎng)”(viable but nonculturable, VBNC)的特點(diǎn)(段曌等, 2012), 使得大規(guī)模的環(huán)境基因組研究相繼展開(kāi), 大量的新的微生物種群和新的基因得以發(fā)現(xiàn), 體現(xiàn)了454高通量測(cè)序較傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)研究方法的優(yōu)勢(shì)。

2.3 普雷沃菌屬及黃桿菌屬分布特點(diǎn)

圖3 不同類型排污口擬桿菌綱、鞘脂桿菌綱和黃桿菌綱在不同檢測(cè)檢測(cè)月份出現(xiàn)情況Fig.3 Appearance of Bacteroidetes, Sphingobacteria and Flavobacteria in different types of sewage outlets during the four months

圖4 10個(gè)站點(diǎn)4個(gè)檢測(cè)月份普雷沃菌屬和黃桿菌屬檢出情況Fig.4 The appearance of Prevotella and Flavobacterium in the 10 sites during the four months

對(duì)454測(cè)序結(jié)果的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 普雷沃菌屬(Prevotellasp.)則為擬桿菌科內(nèi)除擬桿菌屬外的優(yōu)勢(shì)屬, 而黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)為黃桿菌科內(nèi)的優(yōu)勢(shì)屬。對(duì)10個(gè)站點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(圖4), S2、S3、S4與S7站點(diǎn)普雷沃菌屬出現(xiàn)頻次相對(duì)其余站點(diǎn)較高,其中S7站點(diǎn)在3月份更是高達(dá)824次, 這可能與排污口的類型有極大的聯(lián)系。普雷沃菌屬是近年來(lái)從類桿菌屬中分出的一個(gè)新菌屬, 主要集聚于正常人體的口腔、女性生殖道等部位, 組成這些部位的正常菌群僅次于脆弱類桿菌。它是臨床上較常見(jiàn)的一種條件致病菌, 可引起這些部位的內(nèi)源性感染, 女性生殖道及口腔感染多見(jiàn), 與結(jié)締組織的分解有關(guān)(Purusheet al, 2010)。

與普雷沃菌屬相比, 黃桿菌屬出現(xiàn)的頻次明顯較高, S6站點(diǎn)在10月的出現(xiàn)頻次將近1800次。黃桿菌屬在大部分站點(diǎn)的5月與8月的樣品中檢出頻次會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于3月與10月。柱狀黃桿菌(Flabobacterium columnare)主要危害魚(yú)類的鰓組織, 也可引起體表潰亂, 是細(xì)菌性爛鰓病的主要病原(黃冠軍等, 2012),同時(shí)廣泛存在于自然界及醫(yī)院環(huán)境中, 主要引起早產(chǎn)兒及新生兒的腦膜炎, 成人則可發(fā)生敗血癥及心內(nèi)膜炎、傷口感染、肺部感染等, 是醫(yī)院感染病原菌之一(張德忠等, 2009)。

3 結(jié)論

本研究利用454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)寧波沿海2個(gè)重點(diǎn)排污口、8個(gè)一般排污口的20個(gè)站位4個(gè)檢測(cè)月份的水樣進(jìn)行分析, 共成功鑒定24個(gè)菌門(mén), 在整個(gè)454高通量測(cè)序結(jié)果的背景下, 著重對(duì)擬桿菌門(mén)及其綱、具有代表性的普雷沃菌屬及黃桿菌屬的分布特點(diǎn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析, 體現(xiàn)了454測(cè)序高通量的特點(diǎn),另外通過(guò)454測(cè)序檢測(cè)到了極難培養(yǎng)的寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌鞘脂桿菌, 也說(shuō)明了454測(cè)序較傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)研究方法的優(yōu)勢(shì)。

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