劉 鑫 魏 軍 楊芝紅 周林林 鄭錫銘 徐廣賢 (寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院，銀川 750004)

強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)，是一種主要侵蝕脊柱累及骶髂關(guān)節(jié)的慢性炎癥性疾病。炎癥可以累積滑膜關(guān)節(jié)、軟骨關(guān)節(jié)、肌腱以及韌帶附著于骨的部位，屬于血清陰性脊柱關(guān)節(jié)炎。其有較高的致畸性和致殘性。其發(fā)病機制目前尚不明確，有報道其與遺傳、免疫以及細(xì)菌感染等因素有關(guān)。目前的診斷主要依賴于臨床癥狀及影像學(xué)資料。而臨床上，一些病程短，病情較輕的患者可能不能夠得到及時診斷。HLA-B27 在AS 病因和發(fā)病機制中起到一定作用，但其也受到一些因素的影響。目前有研究表明，miR-16、miR-221 和let-7i 在AS 患者T 細(xì)胞中表達量增高［1］微小RNA(microRNA)是一種存在于多種生物體內(nèi)可以調(diào)控基因表達的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長約19～25 個核苷酸［2］。microRNA 是一類內(nèi)源性的小片段非編碼RNA，主要作用于轉(zhuǎn)錄后水平，通過抑制mRNA 的翻譯來參與調(diào)控機體細(xì)胞的增殖、分化、代謝、凋亡等一系列生物學(xué)活動［3］?，F(xiàn)階段關(guān)于microRNA 的研究已證明，microRNA 在免疫調(diào)節(jié)階段發(fā)揮重要作用［4］，其與炎癥、信號通路傳導(dǎo)也有密切關(guān)系，miRNAs 在冠狀動脈疾病、癌癥、自身免疫性疾病患者的血液中差異性的表達［5，6］。miRNAs 對基因調(diào)控具有高度特異性，miRNAs 的表達異常能夠預(yù)示著與疾病有關(guān)的調(diào)控過程發(fā)生異常。通過近年來的研究，許多疾病的miRNA 表達譜得到證實，由于疾病中存在這些特異性的miRNAs，人們提出miRNAs 可能會作為一種新型的特異性診斷標(biāo)志物［7］。我們通過生物信息學(xué)分析強直性脊柱炎與microRNAs 的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-17、miR-106、miR-181、miR-495 和miR-30 可靶向調(diào)控HLA-B、IL-1、TLR-4、HLA-B、DVL、GSK/3β等與強直性脊柱炎發(fā)病相關(guān)的基因(如圖1)，因此我們推測microRNA 可能通過靶向調(diào)控這些基因來參與調(diào)控強直性脊柱炎的發(fā)生發(fā)展，本研究以AS 患者外周血單個核細(xì)胞為研究對象，探求miR-17、miR-106、miR-181、miR-495 和miR-30 表達水平，為強直性脊柱炎發(fā)病機制和臨床診斷中新的標(biāo)志物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 臨床樣本為寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院自2012 年10 月至2013 年10 月收治的門診病人61例，其中男性34 例，女性27 例。年齡14～78 歲，平均(33.06±13.96)歲。AS 患者的診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1987 年修改的AS 紐約標(biāo)準(zhǔn)，且均為HLA-B27 陽性患者。此外，隨機選取31 例同一時期本院體檢的健康者，作為本研究的對照組，其中男性12 例，女性19 例，年齡為20～64 歲，平均(31.22±11.93)歲。選取的研究對象均排除自身免疫性疾病和重要器官系統(tǒng)疾病。以上樣本的收集均獲得患者同意及醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 主要材料與試劑 Ficoll 分離液(Sigma 公司);RNAiso for Small RNA(TaKaRa 公司，大連);T1 Cloning Kit 試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Top Green qPCR SuperMix(北京全式金公司);質(zhì)粒小提試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司);引物合成與DNA 測序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成。

圖1 利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測出與AS 相關(guān)的miRNAsFig.1 miRNAs associated with AS predicted by using of bioinformatics software

表1 所用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物Tab.1 List of primer sequences used for reverse transcription

1.3 方法

1.3.1 樣本的收集、單個核細(xì)胞分離及Small RNA的提取 收集空腹靜脈血5 ml，放置于EDTA 抗凝管中，采取Ficoll 分離液，利用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，向提取的單個核細(xì)胞中加入1 ml RNAiso 試劑充分裂解細(xì)胞，按照RNAiso for Small RNA 試劑盒說明書提取Small RNA，最后加入50 μl的RNase-free 水溶解沉淀。

1.3.2 cDNA 的合成 取2 μl 已提取的Small RNA，使用特異性莖環(huán)引物(見表1)，參照全式金公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA 合成，反轉(zhuǎn)錄條件為42℃30 min，85℃5 min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 以cDNA 為模板，特異性上游引物(見表2)，通用下游引物(5'-3':CTCAACTGGTGTCGTGGA)。進行PCR 擴增，2.5%瓊脂糖電泳，將正確的回收片段與T 載體連接，參照全式金T載體構(gòu)建說明書。構(gòu)建好的T 載體，經(jīng)測序成功后，按照10 倍稀釋法，進行倍比稀釋，各取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒2 μl 作為模板，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 miRNAs 表達量的檢測 使用qTOWER2.0實時定量PCR 儀，反應(yīng)體系采用全式金Top Green q PCR SuperMix 說明提供的反應(yīng)體系:Top Green q PCR SuperMix 10 μl，PCR 上下游引物各0.4 μl，模板2 μl，加ddH2O 至20 μl。反應(yīng)條件為:94℃30 s 1 循環(huán);94℃5 s，60℃15 s，72℃10 s 40 循環(huán);實驗設(shè)置3 個平行復(fù)孔，取平均值。并以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量法進行qPCR 定量分析，以人U6 作為內(nèi)參，上游序列為:CTCGCTTCGGCAGCAC;下游序列為:AACGCTTCACGAATTTGCGT。

表2 所用Real-time PCR 檢測引物Tab.2 List of primers used for q RT-PCR

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)分析采用±s 表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05 即表示存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 miRNAs Real-time PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 PBMC 中提取的small RNA，使用RT-PCR 技術(shù)對miR-17、miR-181、miR-106、mir-30 及mir-495 特異性擴增后，產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，獲得65 bp 左右的目的條帶。使用miR-17、miR-181、miR-106、miR-3 及miR-495T 載體質(zhì)粒，進行Real-time PCR 擴增，并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.99(圖2)，可用于后續(xù)檢測。

2.2 miR-17、miR-181、miR-106、miR-30、miR-495 Real-time PCR 結(jié)果 分別對100 例臨床樣本中的miR-17、miR-181、miR-106、miR-30、miR-495 的表達量進行Real-time PCR 檢測，檢測結(jié)果表明與正常人相比，在強直性脊柱炎患者外周血中表達上調(diào)的有miR-106(P ＞0.05)與miR-30(P ＞0.05);表達下調(diào)的有miR-181(P ＜0.05)、miR-495(P ＜0.05)和miR-17(P ＞0.05)，其中miR-181 和miR-495 有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 miRNAs 的標(biāo)準(zhǔn)曲線及92 例外周血樣本miRNAs 的表達量散點圖Fig.2 Standard curve of miRNAs and miRNAs expression of 92 cases of peripheral blood samples

表3 miR-17、miR-106、miR-181、miR-495、miR-30 熒光定量PCR 結(jié)果(±s，n=92)Tab.3 List of miR-17，miR-106，miR-181 expression profile determined by miR-17，miR-106 and miR-181(±s，n=92)

表3 miR-17、miR-106、miR-181、miR-495、miR-30 熒光定量PCR 結(jié)果(±s，n=92)Tab.3 List of miR-17，miR-106，miR-181 expression profile determined by miR-17，miR-106 and miR-181(±s，n=92)

Note:1)P ＜0.05.

3 討論

強直性脊柱炎(AS)是以骶髂關(guān)節(jié)及脊柱附著點炎癥為主要臨床癥狀的疾病。屬風(fēng)濕病范疇，是一種全身慢性炎性疾病，目前該病的發(fā)病機制尚不明確，目前研究發(fā)現(xiàn)與機體免疫功能異常密切相關(guān)，而T 細(xì)胞的免疫功能異常更是得到了廣泛的關(guān)注［8］。Li 等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-181 在較成熟的T 細(xì)胞中，特別是CD4+CD8+T 細(xì)胞中表達增高，而miR-181 表達下降能夠降低細(xì)胞對抗原的敏感度。miR-181 在T 細(xì)胞發(fā)揮作用過程中起到重要作用，miR-181 表達水平的改變可能引起自身免疫性疾病的發(fā)生。在小兒系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞中通過qRT-PCR 檢測miR-181 的表達水平，發(fā)現(xiàn)其較對照組表達下調(diào)，且引起其靶基因PCAF 的表達量增高［10］。我們通過qRT-PCR 檢測HLA-B27 陽性的強直性脊柱炎患者外周血PBMC 中miR-181 的表達量，發(fā)現(xiàn)較正常對照組顯著下調(diào)(P ＜0.05)。在人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，miR-495 通過靶向Sox9 抑制軟骨分化過程［11］。miR-495 在腫瘤中的作用也已有廣泛的報道，其可以靶向MTA3，在非小細(xì)胞肺癌中起到調(diào)節(jié)增殖和凋亡的作用［12］。我們的實驗結(jié)果表明，miR-495 的表達量存在著顯著的下調(diào)(P ＜0.05)，而其廣泛的下調(diào)可能與疾病的免疫功能異常，炎癥反應(yīng)等存在著密切的關(guān)系。對于在強直性脊柱炎成骨細(xì)胞形成過程中起到重要作用的 Wnt/β-catenin 通 路，通 過 Targetscan、microrna.org 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-495 可以靶向該通路的DVL 和GSK/3β 等多個蛋白;miR-181、miR-495還可以同時靶向TLR-4、HLA-B 等與AS 發(fā)病相關(guān)基因。

與正常人相比在強直性脊柱炎患者外周血中miR-181 和miR-495 的表達量存在差異，它們可以靶向調(diào)控TLR-4、HLA-B、DVL 和GSK/3β 等基因，這些靶向作用與AS 的發(fā)病機制之間的關(guān)系尚需要后期的實驗進一步驗證，這一發(fā)現(xiàn)可能為強直性脊柱炎發(fā)病機制的研究提供新的思路，成為臨床診斷中新的標(biāo)志物。

［1］Zhao H，Shen J，Medico L，et al.A pilot study of circulating miRNAs as potential biomarkers of early stage Breast cancer［J］.PLoS One，2010，5(10):1-12.

［2］Tang G，Tang X，Mendu V，et al.The art of microRNA:various strate-gies leading to gene silencing via an ancient pathway［J］.Biochim Bio-phys Acta，2008，1779:655-662.

［3］Bushati N，Cohen SM.microRNA Functions［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2007，23(1):175-205.

［4］Gracias DT，Katsikis PD.MicroRNAs:key components of immune regulation［J］.Adv Exp Med Biol，2011，780:15-26.

［5］Fichtlscherer S，De Rosa S，F(xiàn)ox H，et al.Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease［J］.Circ Res，2010，107(5):677-684.

［6］Illei GG，Tackey E，Lapteva L，et al.Biomarkers in systemic lupus erythematosus.I.General overview of biomarkers and their applicability［J］.Arthritis Rheum，2004，50(6):1709-1720.

［7］Lai NS，Yu HC，Chen HC，et al.Aberrant expression of microRNAs in T cells from patients with ankylosing spondylitis contributes to the immunopathogenesis［J］.Arthritis Rheum，2013，173(1):47-57.

［8］Curotto de，Lafaille MA，Lafaille JJ.CD4 (+)regulatory T cells in autoimmunity and allergy［J］.Curr Opin Immunol，2002，14:771-778.

［9］Li QJ，Chau J，Ebert PJ，et al.miR-181a is an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection［J］.Science，2004，303(5654);83-86.

［10］延佳佳，朱曉明.MicroRNA-181a 研究進展［J］.Chin J Clinicians (Electronic Edition)，2013，7(12):5449-5451.

［11］Lee S，Yoon DS，Paik S.MicroRNA-495 inhibits chondrogenic differentiation in human mesenchymal stem cells by targeting sox9［J］.Stem Cells Dev，2014，23(15):1798-1808.

［12］Chu H，Chen X，Wang H，et al.MiR-495 regulates proliferation and migrationin NSCLC by targeting MTA3［J］.Tumour Biol，2014，35(4):3487-3494.