李云霄 紀(jì) 霞 高俊杰 (青島市市立醫(yī)院 青島市常見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室哮喘病實(shí)驗(yàn)室，青島 266071)

哮喘和代謝綜合征均是威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，近年來哮喘合并代謝綜合征的發(fā)病也受到關(guān)注。瘦素(Leptin，LEP)和瘦素受體(Leptin receptor，LEPR)是肥胖相關(guān)的主要因素，LEP 作為一種多效應(yīng)性細(xì)胞因子在大量炎癥應(yīng)答中發(fā)揮作用，其功能主要通過LEPR 介導(dǎo)。本研究通過病例對(duì)照分析來研究LEP 基因-2548A/G 和LEPR 基因Glu223Arg 位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘和代謝綜合征易感性之間的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2012 年3 月～2013 年1 月在青島市市立醫(yī)院門診或住院的哮喘合并代謝綜合征病人(A+M)82 例，單純哮喘病人(AS)114 例，單純代謝綜合征病人(MS)100 例和健康對(duì)照(NC)48例，哮喘病人符合《GINA》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，代謝綜合征符合2005 國際糖尿病聯(lián)盟MS 全球共識(shí)定義，正常對(duì)照組近期無呼吸道及胃腸道感染史，無心、肝或腎病史，一級(jí)親屬中無2 型糖尿病、肥胖、高血壓、高脂血癥及其他代謝性疾病，各組間性別比率及年齡間比較均無差異(P ＞0.05)，一般情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA 制備 所有入選者過夜禁食12 h，次晨空腹抽取4 ml 外周靜脈血EDTA 抗凝，應(yīng)用美國Promega 公司DNA 提取試劑盒，從PBMC 中提取基因組DNA，定量后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 根據(jù)Genebank 中提供的基因組序列設(shè)計(jì)PCR 引物，瘦素上游引物序列:5'-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3'，下游引物序列:5'-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3'，瘦素受體上游引物序列:5'-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG-3'，下游引物序列:5'-AGCTAGCAAATATTT TTGTAAGCAATT-3'，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 DNA 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系25 μl，包括模板DNA 100 ng，上下游引物各1 μl，10 × 緩沖液2.5 μl，dNTPs 1 μmol/L，Taq DNA 聚合酶0.75 U，MgCl21.5 μl(25 mmol/L)，加雙蒸水至25 μl，試劑均有Fermentas 公司提供。應(yīng)用Labnet 全自動(dòng)PCR 擴(kuò)增儀，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃終末延伸8 min。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物驗(yàn)證 產(chǎn)物驗(yàn)證取PCR 產(chǎn)物5 μl經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后在培清JS-780A 全自動(dòng)凝膠成像分析儀下觀察結(jié)果并照相，出現(xiàn)相應(yīng)條帶則證明PCR 成功，可用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 限制性核酸內(nèi)切酶酶切(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) 酶切體系共20 μl，包括:LEP 用HhaⅠ(Fast)1 μl，LEPR 用Msp I(Fast)1 μl(內(nèi)切酶由Fermentas 公司提供)，F(xiàn)ast Buffer 2 μl，PCR 產(chǎn)物17 μl。酶切條件為:37℃，5 min。酶切產(chǎn)物置入3%瓊脂糖凝膠(EB 染色)，電壓100 V電泳60 min，與Marker(50 bp)對(duì)比，使用美國Biorad 凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切后的產(chǎn)物長度并拍照保存，見圖1、2。

1.2.6 基因多態(tài)性判斷 在瘦素基因5'端啟動(dòng)子區(qū)2 548 位核苷酸存在G-A 多態(tài)性，當(dāng)2 548 位為G等位基因時(shí)，存在限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，而當(dāng)此位為A 等位基因時(shí)，無限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。因此，當(dāng)瘦素基因型為GG 時(shí)，兩個(gè)等位基因均有切點(diǎn)，酶切產(chǎn)物電泳后有兩條帶(181、61 bp);當(dāng)基因型為AA 時(shí)，兩個(gè)等位基因均無酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物電泳后為一條帶(242 bp);當(dāng)基因型為AG 時(shí)，一個(gè)等位基因有酶切位點(diǎn)，另一個(gè)等位基因無酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物電泳后為三條帶(242、181 和6l bp)，因61 bp 很小，在酶切后電泳過程中易丟失。

在瘦素受體基因外顯子6 翻譯區(qū)第668 位核苷酸存在A-G 變異(即Gln223Arg 多態(tài)性)，當(dāng)668 位為A 等位基因時(shí)，存在限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，而當(dāng)此位為G 等位基因時(shí)，無限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。因此，當(dāng)瘦素基因型為AA 時(shí)，兩個(gè)等位基因均有切點(diǎn)，酶切產(chǎn)物電泳后有兩條帶(293、128 bp);當(dāng)基因型為GG 時(shí)，兩個(gè)等位基因均無酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物電泳后為一條帶(421 bp);當(dāng)基因型為AG 時(shí)，一個(gè)等位基因有酶切位點(diǎn)，另一個(gè)等位基因無酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物電泳后為三條帶(421、293 和128 bp)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算各組瘦素基因-2548A/G、瘦素受體基因Gln223Arg 位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率，并確認(rèn)其是否符合Hardy Weinberg 平衡，各組基因型頻率及等位基因頻率比較用χ2檢驗(yàn)。以上數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 各組間性別、年齡比較均無差異(P ＞0.05)，而對(duì)于BMI、SBP、DBP、TG、TC、LDLC、FPG、HDL-C，代謝綜合征和哮喘合并代謝綜合征組與正常對(duì)照組和哮喘組相比有顯著差異(P 均＜0.05)，見表1。

2.2 遺傳平衡檢驗(yàn) 對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，都來自同一群體。

2.3 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受體基因Gln223Arg位點(diǎn)多態(tài)性的頻率分布 在96 例正常成人中，瘦素基因-2548A/G 的AA 及AG +GG 基因型頻率分別為0.625和0.375，A 及G 的等位基因頻率分別為0.792 和0.208。瘦素受體基因Gln223Arg 的GG 和AG+AA 基因型頻率分別為0.792 和0.208，G 及A 的等位基因頻率分別為0.896 和0.104，見表2。

表1 各組臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(±s)Tab.1 Clinical and laboratory parameters of each group(±s)

表1 各組臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(±s)Tab.1 Clinical and laboratory parameters of each group(±s)

Note:M.F.Female;A+M.Asthma-combined Metabolic syndrome;AS.Asthma;MS.Metabolic syndrome;NC.Normal control;BMI.Body mass index;SBP.Systolic blood pressure;1 mmHg=0.133 kPa;DBP.Diastolic blood pressure;TG.Triglyceride;TC.Total cholesterol;HDL-C.High-density lipoprotein-cholesterol;LDL-C.Low-density lipoprotein-cholesterol;FPG.Fast insulin;1):vs CN group，P ＜0.05;2):vs asthma group P ＜0.05.

表2 各組瘦素基因G2548A 和瘦素受體基因Gln223Arg 基因型和等位基因分布頻率(%)Tab.2 Frequency distribution of leptin gene promoter region G2548A and LEPR Gln223Arg genotypes and alleles in every groups(%)

表3 各組瘦素-G2548A 和瘦素受體Gln223Arg 基因型及等位基因兩兩比較Tab.3 Comparison of LEP-G2548A genotype and allele and LEPR Gln223Arg genotype and allele between each group

圖1 瘦素基因-G2548A 位點(diǎn)PCR-RFLP 圖譜Fig.1 PCR-RFLP patterns of leptin gene -G2548A

圖2 瘦素基因Gln223Arg 位點(diǎn)PCR-RFLP 圖譜Fig.2 PCR-RFLP patterns of LEPR gene Gln223Arg

2.4 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受體基因Gln223Arg 位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘和代謝綜合征的關(guān)系

2.4.1 瘦素基因-2548A/G 位點(diǎn)多態(tài)性 各組之間瘦素基因-2548A/G 位點(diǎn)基因頻率比較見表2。MS和A+M 組AA 基因型頻率與NC 相比顯著升高(P=0.047 和0.038)，AS 與NC 無差異，其余各組間也無差異。繼而對(duì)哮喘進(jìn)行嚴(yán)重程度分組后發(fā)現(xiàn)，輕度AS 與NC 無差別，但中重度AS 的AA 基因型頻率與NC 相比顯著升高(P=0.019 和0.036)，見表2、3。

2.4.2 瘦素受體Gln223Arg 位點(diǎn)多態(tài)性 各組之間瘦素受體基因Gln223Arg 位點(diǎn)基因頻率比較見表2。MS 的AG+AA 基因型與NC 和AS 相比顯著升高(P=0.037 和0)，A+M 的AG+AA 基因型和AS相比有升高趨勢(shì)(P=0.059)，沒有發(fā)現(xiàn)AS 與NC間的差異，對(duì)AS 嚴(yán)重程度分組后也沒有發(fā)現(xiàn)與NC的差異，見表2、3。

2.5 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受體基因Gln-223Arg 位點(diǎn)等位基因與哮喘和代謝綜合征的關(guān)系

2.5.1 瘦素基因-2548A/G 位點(diǎn)多態(tài)性 MS 和A+M 的A 等位基因頻率與NC 相比顯著升高(P=0.046 和0.044)，在對(duì)哮喘進(jìn)一步嚴(yán)重程度分組后發(fā)現(xiàn)，中重度AS 的A 等位基因頻率與NC 相比也升高(P=0.028 和0.041)，見表2、3。

2.5.2 瘦素受體基因Gln223Arg 位點(diǎn)多態(tài)性 MS的A 等位基因頻率與NC 和AS 相比有顯著差異(P=0.023 和0)，A +M 的A 等位基因頻率與AS相比也有顯著差異(P=0.032)，在對(duì)哮喘嚴(yán)重程度分組后未發(fā)現(xiàn)與正常組有差異，見表2、3。

3 討論

瘦素為脂肪組織分泌的激素，通過與瘦素受體(LEPR)結(jié)合，發(fā)揮抑制食欲、減少熱量攝取和脂肪堆積及提高機(jī)體代謝率的功能。有學(xué)者［1］已經(jīng)越來越認(rèn)識(shí)到瘦素在代謝疾病中的重要作用，并提出了“瘦素抵抗”學(xué)說。瘦素也被認(rèn)為可以獨(dú)立預(yù)報(bào)哮喘的發(fā)病和炎癥［2］。有報(bào)道指出瘦素上調(diào)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)CD4+T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖吞噬作用以及單核細(xì)胞的增殖［2-7］，不同程度地增加TH1 細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的產(chǎn)生，減少TH2 細(xì)胞因子(IL-5、IL-4、IL-10)的產(chǎn)生，增加氣道平滑肌血管內(nèi)皮生長因子的釋放［8］，這些與肥胖或哮喘有關(guān)。瘦素受體屬于Ⅰ類細(xì)胞因子家族，基因位于1 號(hào)染色體，由20 個(gè)外顯子和19 個(gè)內(nèi)含子組成。瘦素與受體結(jié)合后，可使受體形成二聚體并磷酸化，通過多種信號(hào)途徑發(fā)揮效應(yīng)。瘦素受體激活JAK-STAT3 通路、致敏反應(yīng)細(xì)胞激酶、細(xì)胞因子信號(hào)肽-3 抑制劑(SOCS-3)和COX［9］。人類氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)瘦素受體，瘦素通過調(diào)節(jié)瘦素受體亞型來抑制血管平滑肌細(xì)胞的增長［10］。

3.1 瘦素基因-2548A/G 我們的研究顯示，MS 和A+M 的AA 基因型頻率顯著升高(P=0.047、0.038)，A 等位基因頻率升高(P=0.046、0.044)，有研究表明，瘦素基因-2548A/G 多態(tài)性與原發(fā)性高尿酸血癥(HUM)密切相關(guān)，A 等位基因可能是HUM 發(fā)病的遺傳易感因素，冠心病病人-2548 位點(diǎn)A 等位基因的頻率高于健康人［10，11］，這與我們的研究結(jié)果相似。Szczepankiewicz［12］在哮喘研究中發(fā)現(xiàn)，瘦素基因-2548 位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘相關(guān)，哮喘病人AA 基因型和A 等位基因顯著高于正常組，GG 基因型是正常者的保護(hù)基因。也有研究表明哮喘組瘦素基因-2548 位點(diǎn)A 等位基因頻率明顯高于健康對(duì)照組［13］。雖然我們的研究沒有發(fā)現(xiàn)哮喘患者瘦素基因-2548 位點(diǎn)AA 基因型或A 等位基因與正常人不同，但在進(jìn)行哮喘嚴(yán)重程度分組后發(fā)現(xiàn)，中重度哮喘AA 基因型和A 等位基因頻率比正常組升高(P=0.019 和0.036)，從結(jié)果可以推論:瘦素基因-2548 位點(diǎn)多態(tài)性可能是代謝綜合征的致病因素，也可能與哮喘的嚴(yán)重性相關(guān)，參與中重度哮喘發(fā)病，這可能是兩種疾病存在關(guān)系的基因基礎(chǔ)，但其具體致病機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.2 瘦素受體Gln223Arg 1996 年NC sidine等［14］首次報(bào)道，LEPR 基 因Gln223Arg 存在變異。LEPR 基因Gln223Arg 變異與肥胖、2 型糖尿病、高血壓、血脂紊亂等密切相關(guān)，且A 等位基因攜帶者發(fā)生代謝紊亂更加嚴(yán)重，發(fā)生MS 的風(fēng)險(xiǎn)更高。Chagnon［15］在魁北克人群中的研究提示GIn223Arg 多態(tài)性與體質(zhì)量指數(shù)、皮褶厚度和體內(nèi)脂肪含量等有關(guān)，Guizar-Mendoza 等［16］發(fā)現(xiàn)GIn223Arg 位點(diǎn)多態(tài)性與心臟交感神經(jīng)活性、體脂百分比等有關(guān)。而Heo［17］未發(fā)現(xiàn)瘦素受體基因GIn223Arg 多態(tài)性與體質(zhì)量指數(shù)或腰圍相關(guān)。在我國的研究中，陳海翎［18］等發(fā)現(xiàn)攜帶A 等位基因者發(fā)生MS 的風(fēng)險(xiǎn)是G 等位基因的3.302倍。我們的研究發(fā)現(xiàn)，MS 比NC 的AG +AA 基因型比例高(P=0.037)，A 等位基因比例也高(P=0.023)，這與之前學(xué)者的研究是一致的。Szczepankiewicz［12］的 研 究 中 并 沒 有 發(fā) 現(xiàn)Gln223Arg位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘有關(guān)，而且至今沒有研究證明此基因多態(tài)性是否與漢族人哮喘有關(guān)。我們的研究也沒有發(fā)現(xiàn)Gln223Arg 的多態(tài)性與哮喘有關(guān)，但我們發(fā)現(xiàn):MS 比AS 的AG+AA 基因型頻率顯著升高(P=0)，A 等位基因也顯著升高(P=0)，而A +M 與NC 相比A 等位基因頻率沒有差異，卻與AS 有顯著差異(P=0.032)。這提示，A 等位基因可能有對(duì)抗哮喘發(fā)病的傾向性作用，但卻是MS 的致病基因，當(dāng)AS 合并MS 時(shí)，兩個(gè)相反作用會(huì)中和一部分，便沒有表現(xiàn)出A+M與NC 的差異，但A 等位基因是否為哮喘的保護(hù)基因還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。這也證明，AS 和MS可能只是兩種疾病的共病狀態(tài)，不存在LEPR 基因方面的共同致病作用，但因?yàn)橹皼]有類似的報(bào)道，我們的結(jié)果也沒有比較。在對(duì)哮喘進(jìn)行分級(jí)后也沒有發(fā)現(xiàn)與LEPR 基因的相關(guān)性，說明LEPR 基因?qū)ο瓏?yán)重程度并沒有作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)瘦素基因-2548A/G 和瘦素受體基因Gln223Arg 位點(diǎn)多態(tài)性均與哮喘和代謝綜合征有一定的相關(guān)性，瘦素基因-2548 A/G 中A 等位基因可能是代謝綜合征的致病基因，而且可能導(dǎo)致嚴(yán)重的哮喘表型;瘦素受體基因Gln223Arg A 等位基因可能是代謝綜合征的致病基因，卻沒有發(fā)現(xiàn)其與哮喘的相關(guān)性，同時(shí)，從這兩個(gè)基因的角度來看，代謝綜合征與哮喘可能是兩種疾病的共病狀態(tài)，之間不存在相對(duì)應(yīng)的致病關(guān)系。通過檢測(cè)基因型，可以篩查哮喘和代謝綜合征的易患人群及判斷哮喘的嚴(yán)重程度，對(duì)及早發(fā)現(xiàn)和及時(shí)預(yù)防有重要意義。

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