趙欣梅吳樹彪王亦學崔貴梅王曉清杜建中王小麗尚勇進孫毅，3

（1.山西大學生物工程學院，太原 030006；2.山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心，太原 030031；3.農業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，太原 030031）

花青素合成調控轉錄基因作為直觀標記的載體構建及其在玉米幼胚中的瞬時表達

趙欣梅1，2吳樹彪2王亦學2崔貴梅2王曉清2杜建中2王小麗1，2尚勇進2孫毅1，2，3

（1.山西大學生物工程學院，太原 030006；2.山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心，太原 030031；3.農業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，太原 030031）

采用花青素調控因子C1/Bperu分別與玉米胚特異性啟動子Glb1和組成型啟動子CaMV35S構建成植物轉化載體pGlb1CB和p35SCB，并利用基因槍轉化方法，將重組表達載體轉入玉米幼胚。顯微觀察結果證實，這兩個載體均能在玉米幼胚細胞中瞬時表達。用花青素作為標記基因不僅可以在一定程度上減少公眾對轉基因生物安全性方面的擔憂，而且可以幫助直觀地從轉化當代和后代種子中通過顏色標記篩選到轉化籽粒，從而可以大大簡化篩選程序，提高效率，節(jié)約檢測成本。

花青素 直觀標記 載體構建 瞬時表達 玉米幼胚

用［3］，故從轉基因植物營養(yǎng)角度和安全性的方面來考慮，用花青素作為標記對人和動物是有益無害的。因其在植物中的廣泛存在，對自然環(huán)境也是安全的。

近年來關于花青素的研究主要集中在其生物合成途徑，代謝調控及生物學功能方面。近年來花青素用于轉基因中標記基因的研究也有少數報道，在單子葉植物中，Doshi等［4，5］構建了花青素調控因子Bperu、C1與胚特異啟動子Ltp1的載體pLtp1CB并通過基因槍法轉入了小麥和小黑麥（小麥與黑麥的雜交麥）中，獲得了紫色胚的小麥和小黑麥轉化種子。Zale等［6］用Floral Dip方法將花青素調控基因Lc和C1作為轉化標記，在小麥上做了轉化試驗，Shen等［7］通過農桿菌介導法將花青素調控因子Bperu、C1與玉米胚特異啟動子globulin構建的載體導入玉米，獲得了紫色胚的玉米轉化種子，宮硤等［8］用花青素代謝調控基因Bi和C1作為報告基因，以epsp作為篩選標記基因，構建了植物表達載體 pBAC9009，用基因槍法獲得了紫色玉米植株。在雙子葉中， Kortstee等［9］用花青素作標記進行了蘋果，草莓和馬鈴薯的轉基因試驗。

組成型啟動子的活性高，在植物體的各組織中均有不同程度和持續(xù)的表達［8］。組織或器官特異型啟動子專一性較強，使得外源基因在特定條件下或植株某個組織中表達，可以增強外源基因的表達效果，并能減少植株負擔，對作物的農藝性狀影響也不明顯［10］。Glb1是一種控制玉米球蛋白合成的胚特異性表達的組織特異性啟動子，它的表達受ABA調節(jié)，在玉米胚部表達量高［11-13］。本研究擬在Doshi提供的載體上進行改造，用玉米球蛋白胚特異性啟動子Glb1代替原有大麥脂質轉移蛋白胚特異性啟動子Ltp1，構建適合于轉化玉米植株的載體pGlb1CB。此外，還利用CaMV35S代替Ltp1構建載體p35SCB，以期得到具有自主知識產權的轉化載體，為植物基因轉化研究奠定基礎，并可為其他的轉基因研究作參考。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米自交系鄭-58由山西省強盛種業(yè)公司提供；載體pLtp1CB由Doshi教授（Agriculture and Agri-Food Canada，Lethbridge Research Centre，Canada）提供（圖1），載體pGlb1G由Scott教授（Interdepartmental Genetics，Iowa State University，Iowa，USA）提供，載體p35SBt由本實驗室保存；pEasy-T載體、DH5α大腸桿菌、TaqDNA聚合酶購自Transgene公司；T4 DNA連接酶購自Thermo公司；DNA膠回收試劑盒、Sanprep柱式質粒小量抽提試劑盒購自上海生工，PCR引物由上海生工合成；DNA序列由Invitrogen公司測定；普通生化試劑購自艾德萊等公司。基因槍型號為PDS-1000/He（Bio-Rad）。

圖1 載體pLtp1CB結構示意圖

1.2 方法

1.2.1 啟動子功能驗證 載體pGlb1G和pLtp1CB的基因槍瞬時表達檢測 對載體pGlb1G的啟動子Glb1測序并比對發(fā)現在470 bp處缺失了一個堿基T，為了證明缺失堿基是否會影響啟動子功能，對該載體進行基因槍瞬時表達檢測。同時對載體pLtp1CB也進行了驗證。取授粉后20 d左右的玉米優(yōu)良自交系鄭-58果穗，經20%的次氯酸鈉表面消毒20 min后挑取其幼胚接種到MS培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，然后將其轉移到高滲MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)4 h后用基因槍轟擊。純化好的 pGlb1G和pLtp1CB載體調整濃度為3 μg/μL，制備基因槍微彈，并以不含任何質粒其余均相同的微彈處理作為空白對照，轟擊幼胚。

馮一余顧不得聽他們廢話，拿了鑰匙就發(fā)動汽車，那女的正沖著樓上嚷呢，一聽到發(fā)動聲，立刻噤了聲，一回身以迅雷不及掩耳之勢，往車頭上一撲，喊，你開，你開！也不怕車頭上的灰塵臟了她的睡衣。

1.2.2 Glb1和CaMV35S基因啟動子的克隆 根據GenBank中玉米球蛋白基因Glb1的序列（EF0649-79）設計合成兩對引物，在第一對引物的上游引物5'端加入BamH I酶切位點，下游引物5'端加入AgeI酶切位點（下劃線部分）：Glb1/fw1：5'-GGATCCTA-

TTAGTCGTTAGCTTCTTTAAT-3'，Glb1/rv1：5'-ACCGGTGGGTTGGC-TGTATGCAGAACTAA-3'；在第二對引物的上游引物5'端加入XbaI的酶切位點，下游引物5'端加入Spe1的酶切位點（下劃線部分）：Glb2/fw2：5'-TCTAGATATTAGTCGTTAGCTTCTTTAAT-3'，Glb2/rv2：5'-ACTAGTGGGTTGGCTGTATGCAGAACTAA-3'。采用堿裂解法提取質粒pGlb1G，以該質粒為模板PCR擴增Glb1序列，瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收并純化后連接到pEasy-T載體上。獲得重組質粒進行篩選并測序，利用NCBI對測序結果進行同源性比對。同理克隆CaMV35S基因的啟動子序列，合成的兩對引物分別為35S1/fw1：5'-GGATCCCTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAG-3'，35S1/rv1：5'-ACCGGTGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAG-3'；35S2/fw2：5'-TCTAGACTCGAGAGAGAT AGATTTGTAGAG-3'，35S2/rv2：5'-ACTAGTGAATCGGCCA ACGCGCGGGGAGAG-3'。

1.2.3 直觀表達載體的構建 ①用BamH I和AgeI雙酶切質粒pLtp1CB和pEasy-T-Glb1，酶切結果得到Glb1片段和含有Bperu/C1的載體大片段，用T4連接酶進行連接，得到Glb1和Bperu/C1、Ltp1基因融合的載體pGlb1Ltp1CB（表1）。接著采用熱激法將該載體轉入DH5α大腸桿菌中，用Glb1/fw1和Glb1/rv1進行菌落PCR，提取質粒并酶切驗證和測序以驗證連入片段的序列是否正確。至此，在原始的載體pLtp1CB上，有一個Ltp1啟動子被置換成了Glb1。②用XbaI和SpeI雙酶切質粒pGlb1Ltp1CB和pEasy-T-Glb2， 將 酶 切pEasy-T-Glb2得 到 的Glb2的片段和酶切質粒pGlb1Ltp1CB得到的含有Bperu/C1基因的大片段，用T4連接酶進行連接，得到Glb1和Bperu/C1基因融合的載體。同樣采用熱激法將該載體轉入DH5α大腸桿菌中，用引物Glb2F和BperuR（5'-CCACGGAGTGGAGATCTTA-3'）菌落PCR檢測，將條帶大小正確的菌斑搖菌提取質粒酶切并測序驗證。從而構建成了胚特異表達的載體pGlb1CB（圖2-A）。③同上述①和②中采用的方法，構建組成型表達載體p35SCB（圖2-B）。

圖2 植物轉化載體pGlb1CB結構（A）及p35SCB結構（B）示意圖

表1 本研究中用到的質粒及其基因組成

1.2.4 表達載體的基因槍瞬時表達 同1.2.3中所述的方法，將純化好的質粒pGlb1CB、p35SCB、pLtp-1CB和Puc18濃度調整為3 μg/μL，用作制備基因槍微彈，轟擊幼胚并觀察，其中pGlb1CB和p35SCB為待檢測載體，pLtp1CB為陽性對照，pUC18空載體為陰性對照，并設立了不含任何質粒其余均相同的微彈作為空白對照。

2 結果

2.1 啟動子功能驗證

用載體pGlb1G和pLtp1CB制作的微彈轟擊玉米幼胚，接受轟擊的玉米幼胚在暗室25℃過夜培養(yǎng)，然后轉移到MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)在25℃光照下培養(yǎng)24 h后觀察結果。通過熒光顯微鏡觀察，用pGlb1G制作的微彈轟擊的玉米幼胚，在玉米幼胚中彈的部位呈現綠色熒光（圖3-A），在正常顯微鏡下觀察發(fā)現以pLtp1CB制作微彈轟擊的玉米幼胚，在玉米幼

胚中彈的部位呈現紫紅色（圖3-B），而空白對照既不呈現綠色熒光也未表現紫色（圖3-C）。試驗表明載體pGlb1G和pLtp1CB均能正常表達，可以進行下一步構建。

圖3 載體pGlb1G及載體pLtp1CB基因槍瞬時表達

2.2 Glb1和CaMV35S基因啟動子的克隆

分別對質粒pGlb1G和p35SBt進行PCR擴增，得到兩個同樣490 bp大小的片段Glb1、Glb2（圖4）和兩個同樣845 bp大小的片段35S1、35S2（圖5）。將擴增片段分別連接到pEasy-T載體上，并用熱激法轉入大腸桿菌中。對獲得菌落進行PCR檢測，從PCR檢測結果陽性的菌落中提取質粒，并進行雙酶切鑒定。各選10個酶切大小正確的菌落測序并在NCBI上對測序結果進行比對發(fā)現，Glb1和Glb2的片段在470 bp處缺失了一個堿基T，而35S1和35S2在85 bp處多了堿基G，在462 bp和463 bp處缺失了堿基A和T。因此，需進行啟動子功能驗證，結果證明缺失或增加的堿基不在啟動子的關鍵部位，不影響目的基因的正常表達，可以進行下一步構建。

圖4 Glb1及Glb2 PCR擴增片段

圖5 35S1及35S2 PCR擴增片段

2.3 表達載體pGlb1CB和p35SCB的構建

經雙酶切重組質粒pEasy-T-Glb1，雙酶切質粒pLtp1CB得到的含有Bperu/C1基因的大片段，經連接、轉化和酶切驗證，構建得到中間載體pGlb1Ltp-1CB；再雙酶切質粒pEasy-T-Glb2，與雙酶切質粒pGlb1Ltp1CB得到的含有Bperu/C1基因的大片段，經連接、轉化和酶切驗證，構建得到表達載體pGlb-1CB。同理，獲得了另一個表達載體p35SCB（圖6）。

圖6 重組質粒雙酶切驗證圖

2.4 表達載體的基因槍轉化瞬時表達

瞬時表達系統(tǒng)可以短暫而高水平地表達目的基因。將pGlb1CB載體（圖7-A）和p35SCB載體（圖7-B）轉入玉米幼胚的瞬時表達試驗表明，

在48 h后該載體能夠正常表達，使部分玉米幼胚著彈部位細胞變成紫色。陽性對照也表達紫色（圖7-C），陰性對照（圖7-D）和空白對照（圖7-E）不表達紫色。

圖7 表達載體的基因槍轉化瞬時表達

3 討論

試驗結果顯示，Glb1、Glb2擴增片段在470 bp處缺失了一個堿基T后，仍可以調控花青素的表達，表明缺失堿基未影響啟動子的功能。同理，CaMV-35S堿基序列缺失或增加均未影響啟動子功能。個別堿基缺失后該啟動子功能驗證的觀察還未見報道，本研究的驗證說明構建的啟動子具有正常的胚特異性表達功能。然而，該啟動子其它位點個別堿基的缺失對其功能影響的程度還有待進一步研究。

不同植物的種子特異性啟動子存在種間表達特異性及穩(wěn)定性的問題［14］，如蠶豆USP基因啟動子可以驅動報告基因在轉基因擬南芥種子中特異性表達，但在轉基因豌豆中，該啟動子會驅動報告基因在花藥、花粉和種皮中都表達［15］；外源啟動子在種子特異性啟動子的表達強度有時也會發(fā)生改變，如棉花的α-球蛋白啟動子在轉基因擬南芥和煙草中驅動GUS的表達活性只是在棉花中表達量的16.7%和1%［16］，說明在轉基因研究中，利用植物本身的種子特異性啟動子比較好。因而本試驗用了Glb1代替Ltp1，為下一步轉化玉米做準備。

載體pGlb1CB 可以使轉基因玉米的當代和后代胚表現紫色而不影響植株的其它性狀，適合作標記基因。載體p35SCB 以組成型強啟動子CaMV35S啟動花青素表達，可以大大提高植物本身及果實中花青素的含量，改良植物品質；提高人和動物的攝入量，或者將玉米秸稈做成飼料喂養(yǎng)動物，對動物也存在諸多益處。因而，研究者可以根據試驗需要及不同的研究目的選擇合適的載體。

將以上載體pGlb1CB和p35SCB用于植物轉基因研究，在轉化植株的當代和后代中可以通過肉眼直接觀察到籽粒顏色變化的轉化籽粒，從而大大提高檢測效率，節(jié)省檢測成本。這類標記的廣泛使用將對植物轉基因研究具有重要意義。

4 結論

本研究分別將玉米胚特異性啟動子Glb1和組成型啟動子CaMV35S與花青素調控因子C1/Bperu構建成了植物轉化載體pGlb1CB和p35SCB，在玉米幼胚中的基因槍瞬時表達檢測結果顯示，玉米幼胚中彈部位細胞產生紫色，說明載體pGlb1CB和p35SCB均能在植物細胞中正常表達。

致謝

感謝F. Eudes教授（Agriculture and Agri-Food Canada, Lethbridge Research Centre, Canada）提供pLtp1CB載體和M. P. Scott教授（Interdepartmental Genetics，Iowa State University，Iowa，USA）提供pGlb1G載體。感謝山西省農業(yè)科學院旱作農業(yè)研究中心張明義研究員和張艷琴副研究員為我們的瞬時表達實驗提供技術支持。

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（責任編輯 馬鑫）

The Vector Construction of Anthocyanins as a Visual Marker Gene and Its Transient Expression in Maize Immature Embryos

Zhao Xinmei1，2Wu Shubiao2Wang Yixue2Cui Guimei2Wang Xiaoqing2Du Jianzhong2Wang Xiaoli1，2Shang Yongjin2Sun Yi1，2，3
（1. Biological Engineering Institute，Shanxi University，Taiyuan 030006；2. Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031；3. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031）

Anthocyanin regulatory factor C1/Bperu genes are constructed respectively with a maize embryo specific promoter GLB1 and a constitutive promoter CaMV35S into plant transformation vectors pGlb1CB and p35SCB, and the recombinant expression vectors were introduced into maize embryos by particle bombardment. Microscopic observation confirmed that the two vectors were actively expressed in maize immature embryo cells. The use of anthocyanins as a marker gene not only could reduce the safety concerns from the public over GMO substantially, but could also be used as a visual indicator for the selection of transgenic plants, which could greatly simplify the screening procedures, improve the efficiency and reduce the costs.

Anthocyanins Visual marker Vector construction Transient expression Maize immature embryo

2013-10-11

國家轉基因生物新品種培育重大專項（2013ZX08003-001），國家自然科學基金項目（31240081），山西省科技攻關項目（20110311009），山西省財政支農項目（2011NYGX-05）

趙欣梅，女，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：zxm880329@126.com

孫毅，男，博士，研究方向：植物基因工程和分子生物學研究；E-mail：sunyi692003@163.com