李秀娟 柴曉杰 陶曉迎 趙歡 叢玉婷

（大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，大連 116023）

鹽藻小G蛋白DsRab的原核表達(dá)及純化

李秀娟 柴曉杰 陶曉迎 趙歡 叢玉婷

（大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，大連 116023）

前期對鹽藻小G蛋白基因DsRab研究表明，在鹽脅迫誘導(dǎo)下該基因轉(zhuǎn)錄水平明顯提高。為進(jìn)一步研究該蛋白在鹽藻耐鹽機(jī)制中的作用，PCR擴(kuò)增DsRab的開放閱讀框（ORF），并將其克隆至帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGS-21a，得到重組表達(dá)載體pGS-21a-DsRab。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，利用GST-SefinoseTMKit進(jìn)行純化，用SDS-PAGE和Western blot鑒定。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pGS-21a-DsRab，SDS-PAGE結(jié)果顯示得到的蛋白與預(yù)期分子量相符，并且純度較高；Western blot檢測結(jié)果初步證明該融合蛋白為GST-DsRab。

鹽藻 DsRab GST 原核表達(dá) 純化

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina，以下簡稱鹽藻）的細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，具有很強(qiáng)的抗鹽能力，可以生長在5.0 mol/L NaCl培養(yǎng)液中，而且其培養(yǎng)條件也很簡單。因此，鹽藻是研究植物耐鹽分子機(jī)制的重要模式生物［1，2］。研究表明當(dāng)鹽藻在高鹽環(huán)境脅迫下，體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成和降解以及能量代謝等多種代謝途徑會發(fā)生很大程度的改變［2-4］，其中耐鹽作用主要是依靠鹽藻中Na+/H+泵和大量合成兼容性溶質(zhì)甘油，但應(yīng)答鹽脅迫的調(diào)控過程還少有報道。從信號傳導(dǎo)方面開展對鹽藻抗鹽生理調(diào)節(jié)過程的研究，有助于全面了解鹽藻耐鹽機(jī)制［3］。

小G蛋白（Small GTP-binding proteins）分子量一般在20-30 kD之間，以單體形式普遍存在于真核生物中，通過激活態(tài)（結(jié)合GTP）與非激活態(tài)（結(jié)合GDP）的轉(zhuǎn)變來行使分子開關(guān)作用，參與重要的細(xì)胞生理活動，包括信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、囊泡轉(zhuǎn)運、細(xì)胞骨架重組等［10，13］。Rab蛋白是小G蛋白家族（Ras、Rho、Rab、Arf/Sar和Ran 5個亞家族）中最大的亞家族，近年來在酵母、果蠅、擬南芥、煙草、水稻等真核生物中發(fā)現(xiàn)的Rab蛋白遍布于胞內(nèi)

的各個膜區(qū)室［5，9］，在胞吞和胞吐作用中，不同的Rab蛋白定位于特定的細(xì)胞器膜上，參與膜泡的形成、定向轉(zhuǎn)運、錨定鏈接等過程［6，8］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多與植物的抗逆性有關(guān)的Rab蛋白，其表達(dá)量會受到鹽脅迫、低溫、干旱等逆境條件的影響［4，7］。因此，深入了解Rab蛋白功能及進(jìn)一步研究植物抗逆性相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)具有重要科學(xué)意義。

本實驗室已從鹽藻細(xì)胞中成功克隆出新的Rab蛋白基因DsRab（GenBank Accession No.JN989548），并用實時熒光定量PCR方法研究了DsRab基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況，證明DsRab是一個鹽誘導(dǎo)上調(diào)基因［4］。本試驗構(gòu)建重組表達(dá)載體pGS-21a-DsRab，通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件使DsRab蛋白在上清中的表達(dá)量增加，利用GST-SefinoseTMKit純化，獲得純度較高的可溶性融合蛋白，為制備抗體以及進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平上研究該蛋白在鹽藻耐鹽性機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌（E.coli）菌株DH5α、E.coliBL21（DE3）、質(zhì)粒pGS-21a由本室保存；pMD18-T Simple Vector購自TaKaRa公司。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶、Taq酶、IPTG、X-gal、T4連接酶購自TaKaRa，硝酸纖維素膜、Anti-GST Antibody、HRP-IgG、沉淀型單組分TMB底物溶液購自TIANGEN，GST-SefinoseTMKit（BSP032-7），Prestained Protein Molecular Weight Marker購自生工生物工程（上海）有限公司，凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)DsRab基因cDNA全長序列（GenBank Accession No.JN989548）設(shè)計引物并加入酶切位點，上游引物（含EcoR I 酶切位點）P1：5'-CGGAATTCATGAACCCAGAGTACGACTACC -3'，下游引物（含SalI酶切位點）P2：5'-GTCGACCTAGCAGCAGGTGGAGCGG-3'。以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，P1，P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個 循環(huán)；72℃延伸9 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，回收目的片段，連接到pMD18-T simple載體上（T-A克?。瑯?gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-DsRab，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，在Amp抗性平板上篩選陽性單克隆。用EcoR I、SalI雙酶切目的片段和pGS-21a質(zhì)粒，用T4連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pGS-21a-DsRab，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，篩選陽性單克隆，交由大連寶生物公司測序，以驗證讀碼框的正確性。

1.2.2 融合蛋白的原核表達(dá) 將測序鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒pGS-21a-DsRab轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），挑取陽性單克隆，接種于5 mL含氨芐青霉素（50 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。次日，按1%的比例接種到5 mL新的LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素50 mg/L）中，37℃振蕩培養(yǎng)到菌液OD600=0.6-0.8時，試驗組加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，對照組不加IPTG，37℃誘導(dǎo)6 h。離心收集菌體，用0.01 mol/L PBS緩沖液懸浮，冰上超聲波破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min，分離上清與沉淀，加上樣緩沖液，對上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 按1.2.2相同方式過夜培養(yǎng)的菌液，1%的比例轉(zhuǎn)接到新的LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素50 mg/L）中，37℃振蕩培養(yǎng)到菌液OD600=0.6-0.8時，進(jìn)行分組培養(yǎng)：IPTG終濃度梯度為0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mmol/L；誘導(dǎo)溫度梯度為25、28、30、35和37℃；培養(yǎng)6 h。離心收集細(xì)菌，0.01 mol/L PBS緩沖液懸浮，冰上超聲波破碎，離心取上清，用SDS-PAGE檢測。

1.2.4 重組蛋白的純化 優(yōu)化表達(dá)條件下，將過夜培養(yǎng)的菌液按1%的比例接種于100 mL的LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50 mg/L）中，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.6-0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，28℃振蕩培養(yǎng)6 h。4℃、8 000 r/min離心3 min，收集細(xì)菌，用20 mL 0.01 mol/L PBS緩沖液懸浮，冰上超聲波破碎，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清并用0.45 μm濾膜抽濾。用GSTSefinoseTMKit純化，SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 Western blotting檢測 純化后的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜（200 mA，2 h），用5%牛血清白蛋白4℃封閉過夜，加入一抗Anti-GST Antibody（1∶2 000），37℃孵育1 h，0.01

mmol/L PBST洗滌3次，每次5 min，然后加入二抗HRP-IgG（1∶200），37℃孵育1 h，0.01 mmol/L PBST洗滌3次，每次5 min，然后加入沉淀型單組分TMB底物溶液顯色。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一條600 bp左右的條帶（圖1-A），與預(yù)期片段大小一致。EcoR I、SalI雙酶切重組質(zhì)粒pGS-21a-DsRab，結(jié)果（圖1-B）表明目的片段已與pGS-21a質(zhì)粒正確連接，重組質(zhì)?？梢杂糜跍y序。測序結(jié)果表明擴(kuò)增片段與DsRab基因開放閱讀框完全一致，讀碼框正確，原核表達(dá)載體pGS-21a-DsRab構(gòu)建成功。

圖1 鹽藻DsRab基因PCR產(chǎn)物（A）及重組質(zhì)粒pGS-21a-DsRab雙酶切（B）凝膠電泳

2.2 融合蛋白的原核表達(dá)

對照組表達(dá)菌（含有空載體pGS-21a）誘導(dǎo)后，在35 kD左右有一條表達(dá)增強(qiáng)的標(biāo)簽蛋白條帶，含有重組質(zhì)粒的表達(dá)菌誘導(dǎo)后在57 kD左右有一條明顯表達(dá)增強(qiáng)的條帶，此條帶在對照組沒有出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果相符（融合蛋白包括預(yù)計分子量為22 kD的DsRab蛋白和35 kD的標(biāo)簽蛋白）（圖 2-A）。結(jié)果還顯示，上清和沉淀均可見清晰的目的蛋白條帶，表明目的蛋白為部分可溶性表達(dá)。

2.3 融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)劑IPTG的濃度在0.1-1.0 mmol/L范圍內(nèi)，融合蛋白的表達(dá)量沒有太大變化（圖2-B）。在25、28、30、35和37℃ 5個誘導(dǎo)溫度下，融合蛋白的表達(dá)量比較，在28℃誘導(dǎo)時，融合蛋白的表達(dá)量最大（圖2-C）。在最優(yōu)條件下，融合蛋白的可溶性表達(dá)量顯著增加（圖2-D）。

圖2 pGS-21a-DsRab在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析

2.4 重組蛋白的純化及鑒定

純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，在57 kD左右有單一蛋白條帶，表明融合蛋白被有效純化（圖3-A）。Western blotting檢測（圖3-B）顯示，融合蛋白能與抗GST單克隆抗體特異性結(jié)合，具有良好的免疫學(xué)活性，表明融合蛋白在E.coliBL21（DE3）中成功表達(dá)。

3 討論

高鹽環(huán)境下，植物對鹽脅迫的應(yīng)答是非常復(fù)雜的過程，涉及一系列與抗逆性相關(guān)的信號傳導(dǎo)過程［6，7］。研究表明Rab蛋白作為一種分子開關(guān)蛋白，分布于胞內(nèi)所有的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不同的Rab蛋白與相應(yīng)的上游調(diào)控因子和下游效應(yīng)因子相互作用，參與了胞內(nèi)幾乎所有的膜運輸過程［12，14］。近來大量研究報道證實有些Rab蛋白與植物的高鹽適應(yīng)性有關(guān)。

Mazel等［6］將擬南芥AtRab7在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，加速了轉(zhuǎn)基因植物根、葉和原生質(zhì)體中的胞吞作用，對鹽和滲透脅迫的耐受性提高。O’Mahony 等在牧草（Sporobolus stapfianus）中發(fā)現(xiàn)的sRab2可能涉及由植物ABA參與的耐旱信號的傳導(dǎo)［13，16］。水稻在冷凍、干旱及生長激素ABA存在的條件下，OsRab7基因的mRNA含量呈現(xiàn)不同的趨勢［16］；高鹽脅迫下，普通冰草Rab5B、煙草PgRab7、花生AhRab7基因的表達(dá)量都有增加［7，15，16］。

圖3 重組蛋白的純化（A）及Western blot鑒定（B）

在高度耐鹽的模式生物鹽藻中，有關(guān)DsRab蛋白的研究鮮有報道。本實驗室已經(jīng)克隆得到鹽藻新基因DsRab，并初步證明該基因與鹽藻耐鹽性有關(guān)［4］，為進(jìn)一步研究DsRab蛋白在鹽藻抗鹽應(yīng)答中的作用，獲得高純度的可溶性的DsRab蛋白是非常重要的。本試驗中融合蛋白的表達(dá)選用經(jīng)典的大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞的上清和沉淀中均有存在，說明融合蛋白以可溶性及包涵體形式表達(dá)。為了獲得大量的可溶性蛋白，對誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度兩個表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。其中誘導(dǎo)劑IPTG在0.1-1.0 mmol/L范圍內(nèi)，融合蛋白表達(dá)量相差不大，為盡可能減少包涵體形式的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)劑的濃度越小越好。試驗中的5個誘導(dǎo)溫度比較，28℃時蛋白的表達(dá)量最大。所以確定的最優(yōu)表達(dá)條件是0.1 mmol/L IPTG，28℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。

本試驗中純化的可溶性DsRab蛋白可以用于篩選與該蛋白可能發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步了解DsRab上下游的作用因子。為深入研究鹽藻DsRab蛋白在抗鹽方面的作用，也可以在轉(zhuǎn)基因的植物中過量表達(dá)該蛋白，檢測轉(zhuǎn)基因植物的高鹽適應(yīng)性。這些結(jié)果，不僅為下一步制備抗體并進(jìn)一步研究DsRab蛋白在鹽藻耐鹽機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)，而且為該類蛋白在植物抗逆中的作用提供了新的信息。

4 結(jié)論

成功的構(gòu)建了鹽藻DsRab蛋白的原核表達(dá)載體pGS-21a-DsRab，并在大腸桿菌E.coliBL21（DE3）表達(dá)體系中成功表達(dá)，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后，純化上清蛋白，獲得了純度較高的可溶性融合蛋白。Western blot初步證明該融合蛋白就是帶有GST標(biāo)簽的DsRab蛋白。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Prokaryotic Expression and Purification of DsRab from Dunaliella salina

Li Xiujuan Chai Xiaojie Tao Xiaoying Zhao Huan Cong Yuting
（Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea，Ministry of Agriculture / Key Laboratory of Marine Bio-resoursce Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023）

Previous studies indicated that the DsRab transcript could be increased by salt stress. In order to study the functions of DsRab in salinity tolerance, the open reading frame（ORF）of DsRab gene was obtained through PCR. The target fragment was cloned in pGS-21a, and the recombinant plasmid pGS-21a-DsRab was transformed into E. coli BL21（DE3）. The recombinant protein was induced with IPTG. Then the prokaryotic expression condition was optiminzed to harvested more supernatant recombinant protein. The products were purified by GST-SefinoseTMKit, and identified by SDS-PAGE and Western blot. The results showed that the recombinant expression vector pGS-21a-DsRab was constructed successfully, the molecular weight of the recombinant protein was in the expected line. Western blot analysis showed that the recombinant protein can be identified specifically by the anti-GST antibody.

Dunaliella salina DsRab GST Prokaryotic expression Purification

2013-10-28

國家自然科學(xué)基金項目（30972240），遼寧省教育廳科技研究項目（2008T023）

李秀娟，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物學(xué)；E-mail：lixiujuan113@yeah.net

柴曉杰，女，博士，教授，研究方向：海洋生物分子生物學(xué)；E-mail：cxj63@126.com