香山黃櫨葉片內生細菌的分離與鑒定

左山1劉洋2周肖紅3沈悅1李哲1彭程1陳亮3程池2
（1. 北京市廣渠門中學，北京 100062；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100027；3. 北京市香山公園管理處，北京 100093）

通過微生物培養(yǎng)方法對北京香山黃櫨葉片內生細菌進行分離及篩選，共得到81株內生細菌，經形態(tài)學觀察、16S rDNA擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其歸為變形菌門（Proteobacteria）中的歐文氏菌屬（Erwinia）和志賀氏菌屬（Shigella）；厚壁菌門（Firmicutes）中的芽孢桿菌屬（Bacillus）、柯恩氏菌屬（Cohnella）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）；放線菌門（Actinobacteria）中的短小桿菌屬（Curtobacterium）。這是國內外首次利用培養(yǎng)方法針對黃櫨葉片內生細菌進行研究的報道。

黃櫨 葉 內生細菌 培養(yǎng)方法

植物內生細菌是指能定殖在健康植物組織內，并與植物建立和諧聯(lián)合關系的一類微生物，它們可以通過生物防治、植物促生和內生固氮等作用直接或者間接影響植物的生長發(fā)育，是植物維持自身健康生長與適應環(huán)境的重要因素之一［1］。目前認為，植物內生細菌與植物生長發(fā)育、抗病害能力、功效性成分產生以及生境生態(tài)平衡穩(wěn)定都具有重要作用，成為當前微生物生態(tài)學研究的一個熱點領域［1］。

黃櫨是優(yōu)良的秋季紅葉樹種，也是我國長江流域、華北、華中地區(qū)常見的荒山綠化樹種，具有生長強健及耐貧瘠等特性。黃櫨（Cotinus coggygriavar.cinerea）是構成香山紅葉景觀的主體樹種，香山

1 材料與方法

1.1 材料

黃櫨葉片于2013年7月采集自北京市香山公園，

具體位置為東經116.19°，北緯39.99°，海拔181 m。采集所得樣品于4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及試劑 LB及R2A成品培養(yǎng)基，購自北京陸橋公司；細菌基因組DNA提取試劑盒及PCR相關試劑購自TIANGEN公司；PCR引物由北京諾賽生物公司合成。

1.2.2 樣品表面滅菌 稱取1 g葉片樣品，并用無菌水沖洗，之后依次用70%乙醇，次氯酸鈉溶液（2.5%有效Cl-），70%乙醇浸泡3 min，5 min，30 s，再用無菌水淋洗6次，并于無菌條件下晾干；同時取最后一次淋洗水120 μL涂于LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)72 h，以檢測表面滅菌效果［3］。

1.2.3 內生細菌的分離與純化 采用劉琳等［4］方法進行。將表面滅菌處理的黃櫨葉片置于無菌研缽中研磨成粉末，然后依次用無菌水稀釋成濃度為10-1、10-2和10-3懸液。分別取200 μL涂布于R2A和LB平板上，每個處理3個平行。28℃培養(yǎng)2-3 d。根據(jù)菌落形態(tài)（大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度等），隨機挑取平板上具有差異的代表性菌落，純化后將其接種于斜面培養(yǎng)基，并4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 內生細菌的16S rDNA序列分析 采用細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取菌株基因組DNA作為PCR反應的模板。采用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3'） 和1 492R（5'-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3'）［5］對菌株16S rDNA片段進行PCR擴增。PCR反應體系（50 μL）：10×buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、引物27F（10 mmol/L）1 μL、引物1 492R（10 mmol/L）1 μL、Taq酶（5 U/L）0.25 μL、DNA模板3 μL、ddH2O補足至50 μL。PCR反應程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10min。1%瓊脂糖檢測凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.2.5 核糖體DNA擴增片段限制性內切酶分型（Amplifed ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA） 用HaeIII（TaKaRa）和Hin6I（TaKaRa）兩種內切酶對PCR產物進行酶切分型，兩種酶帶型完全一致則認為是同一種或同一類型的細菌［4］。酶切反應體系為 0.4 μL內切酶HaeIII（或Hin6I），1.5 μL酶切緩沖液，400 ng PCR產物，最后加滅菌水至15 μL。37℃ 酶切4 h，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，100 V電泳60 min。比較各菌株的酶切圖譜并歸類。

1.2.6 細菌16S rDNA序列測定與同源性比對 經ARDRA 初步分型，選取代表菌株進行16S rDNA 全長片段進行擴增（引物及方法同上）。PCR擴增產物約1.5 kb，采用ABI 3730型DNA測序儀測序，將序列信息提交至NCBI，并將測序得到的結果在EzTaxon server 2.1進行比對［6］，確定與已知序列的同源關系。

2 結果

2.1 黃櫨葉片內生細菌分離及基因組DNA提取

通過傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)，共獲得黃櫨葉片內生細菌81株。利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取黃櫨葉片內生細菌基因組DNA，1%凝膠電泳結果（圖1）顯示總DNA大小約為23 kb。

圖1 部分黃櫨葉片內生細菌的基因組DNA

2.2 黃櫨葉片內生細菌16S rDNA PCR擴增及ARDRA 分型

采用細菌通用引物27F和1492R對黃櫨葉片內生細菌16S rDNA 進行PCR擴增，得到長度約1 500 bp的擴增片段，圖2為部分細菌的16S rDNA PCR產物電泳圖譜。將擴增的 PCR 產物用HaeIII和Hin6I兩種內切酶進行酶切分型（ARDRA分型），將兩個酶切圖譜類型完全相同的細菌劃分為一個操作分類

單元（Operational taxonomy unit，OTU）（圖3）。每種OTU選定1-2個代表菌株再次進行16S rDNA PCR擴增以備用測序。

圖2 部分黃櫨內生細菌的16S rDNA片段擴增結果

圖3 部分黃櫨內生細菌的ARDRA酶切分型結果

2.3 黃櫨葉片內生細菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

黃櫨葉片內生細菌的16S rDNA序列比對及其群落多樣性分析結果如表1所示。經16S rDNA序列比對及其系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4），內生細菌群落共包含11個OTU，分屬變形菌門（Proteobacteria）中的歐文氏菌屬（Erwinia）和志賀氏菌屬（Shigella）；厚壁菌門（Firmicutes）中的芽孢桿菌屬（Bacillus）、柯恩氏菌屬（Cohnella）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）；放線菌門（Actinobacteria）中的短小桿菌屬（Curtobacterium）。在所分離的得到的81株內生細菌中，厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢菌門；芽孢桿菌屬（Bacillus）及葡萄球菌屬（Staphylococcus）為優(yōu)勢菌屬，豐度分別為53.09%和30.86%。其中，R-54所代表的OTU為該黃櫨葉片內生細菌群落中的第一優(yōu)勢種群；L-20所代表的OTU為該黃櫨葉片內生細菌群落中的第二優(yōu)勢種群（表1）。

表1 黃櫨葉片內生細菌多樣性統(tǒng)計

3 討論

植物內生細菌［7-11］存在于植物的根、莖、葉、花果實及種子中［12，13］，其中不乏一些能夠對植物生長和健康起到直接或者間接促進作用的細菌種類，已有很多關于這些有益內生細菌生態(tài)功能的報道，其中對植物的直接促生作用主要包括生物固氮［14，15］、分泌和誘導產生植物生長調節(jié)物質［16，17］、改善植物對礦物質的利用率［18］及改變宿主植物對霜凍等有害環(huán)境條件的敏感性等［19，20］。對植物具有間接促生作用有益內生細菌的生態(tài)功能主要是植物內生細菌的生防作用，到目前為止已從眾多植物體中分離得到了具有良好抑制效果的植物內生細菌［12，15，21，22］。

本研究自北京香山紅葉景觀的主體樹種—黃櫨葉片中分離培養(yǎng)得到7個內生細菌菌屬，其中以芽孢桿菌屬（Bacillus）最為優(yōu)勢，該屬中許多細菌種類是常見的植物促生細菌［23］。本研究分離得到的菌株L-21所對應的最近緣菌種Bacillus aryabhattai是拮抗煙草黑脛?。≒hytophthora parasiticavar.nicotianae）的生防菌［24］；R-15所對應的最近緣菌種蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）是目前世界上產量最大、使用最廣的生物殺蟲劑，對鱗翅目、鞘翅

目、雙翅目、膜翅目和同翅目等昆蟲，以及動植物線蟲、蜱螨等節(jié)肢動物都有特異性的毒殺活性，而對非目標生物具有較高的安全性，因此在國內外植物保護相關領域的科研與實踐中備受人們關注［25］。此外，菌株R-22所對應的最近緣菌種解木聚糖類芽孢桿菌（Paenibacillus xylanilyticus）對由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）所引起的棉花黃萎病具有明顯的拮抗作用，可用于棉花黃萎病的生物防治［26］。類芽孢桿菌屬中不乏具有生防促生作用的細菌種類，宋未等（2007）自水稻根際分離得到多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）WY110，該菌對水稻的三種主要病原菌——稻瘟病、水稻紋枯病及水稻白葉枯病均具有很高的體外特異性拮抗活性，且拮抗譜較寬，并兼具固氮活性及生產生長素作用，在溫室實驗中表現(xiàn)較好的植株防病效果，普遍達到50%以上，具有良好的研究與應用價值［27］。宋順華等［28］經研究發(fā)現(xiàn)多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）WY110對西瓜枯萎病亦有良好的防治作用。本課題組新近自諾尼（Morinda citrifoliaL.）植物中分離獲得類芽孢桿菌CICC 10580，其對小麥根腐病、稻瘟病菌及棉花黃萎病等多種病原真菌具有明顯的拮抗作用（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。

圖4 鄰接法（N-J）構建黃櫨葉片內生細菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

由此可見，香山黃櫨葉片內生細菌群落中存在有益細菌資源。因此，利用多種培養(yǎng)條件進一步分離篩選其內生細菌，以獲得種類更為豐富的內生菌資源，為進一步研究其中的有益功能菌種與黃櫨植物的生長健康及其景觀效果之間的相關性奠定了微生物資源基礎。

4 結論

國內外首次利用微生物培養(yǎng)方法分離篩選黃櫨葉片的內生細菌，分屬變形菌門中的歐文氏菌屬和志賀氏菌屬，厚壁菌門中的芽孢桿菌屬、柯恩氏菌屬、類芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，放線菌門中的短小桿菌屬，其中包含植物生防促生細菌種類。

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（責任編輯 狄艷紅）

Isolation and Identification of Endophytic Bacteria in Leaf from Xiangshan Smoke Tree（ Cotinus coggygria var. cinerea）

Zuo Shan1Liu Yang2Zhou Xiaohong3Shen Yue1Li Zhe1Peng Cheng1Chen Liang3Cheng Chi2
（1. Beijing Guang Qumen Middle School，Beijing 100062；2. China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027；3. Beijing Xiangshan Park Management Office，Beijing 100093）

The endophytic bacteria in leaf of Xiangshan smoke tree were isolated, screened and identified by the microbial culturedependent method combing with morphological observation, 16S rDNA amplification and phylogenetic analysis, indicated that the total 81 strains from the leaves were clustered into 7 genus：Erwinia and Shigella, Bacillus, Cohnella, Paenibacillus and Staphylococcus, and Curtobacterium belonging to Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria, respectively. This is the first report about investigation on the endophytic bacteria in leaf of Xiangshan smoke tree using culture-dependent method.

Smoke tree Leaf Endophytic bacteria Culture-dependent method公園面積約160 hm2，黃櫨數(shù)量約10萬余株，主要分布于香山馬蹄形山坳的西南部［2］。近年來，香山紅葉的培育和病害防治引起廣泛關注。本項目首次以香山黃櫨葉片為研究對象，采用微生物培養(yǎng)方法和分子生物學技術對其內生細菌群落結構多樣性進行分析，為進一步研究這些內生細菌菌種的生物學功能，以及香山紅葉植物的生長健康與病害防治奠定微生物資源基礎。

2013-09-04

北京市青少年科學探索專項資金項目，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金（博士基金）項目（2012KJFZ-BS-01）

左山，女，碩士，研究方向：植物微生物生態(tài)學，E-mail：zuoshanwork@163.com；劉洋同為本文第一作者

程池，男，教授級高工，博士生導師，研究方向：微生物學；E-mail：cheng100027@163.com