呂雪峰 阿布力孜·阿布力米提 帕娜爾 陶衛(wèi)東 邢巍婷 采復(fù)拉 鄭文新

（農(nóng)業(yè)部種羊與羊毛羊絨質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，烏魯木齊 830000）

利用基因芯片技術(shù)鑒別山羊絨和綿羊絨

呂雪峰 阿布力孜·阿布力米提 帕娜爾 陶衛(wèi)東 邢巍婷 采復(fù)拉 鄭文新

（農(nóng)業(yè)部種羊與羊毛羊絨質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，烏魯木齊 830000）

為了建立山羊絨與綿羊絨的基因芯片鑒別方法，達(dá)到快速、高通量鑒別山羊絨與綿羊絨的目的，文章根據(jù)山羊和綿羊遺傳物質(zhì)的特異性，選擇線粒體基因組細(xì)胞色素b基因（cyt b）為目的基因，在cyt b基因通用引物區(qū)間設(shè)計(jì)出一對(duì)能鑒別綿羊絨與山羊絨的探針，經(jīng)過(guò)與含有不同比例綿羊源性的PCR產(chǎn)物雜交，結(jié)果顯示當(dāng)山羊源性成分中綿羊源性含量為3% 時(shí)，仍然可見雜交信號(hào)，說(shuō)明基因芯片鑒別毛絨的方法具有非常高的特異性，能夠定性的鑒別山羊絨和綿羊絨。

山羊絨 綿羊絨 線粒體DNA Cyt b基因 基因芯片

山羊絨是一種珍稀而昂貴的動(dòng)物纖維，其制品的品質(zhì)極高，而且非常舒適，深受消費(fèi)者青睞。為了追求利潤(rùn)，有些生產(chǎn)者將與山羊絨外觀相似的綿羊毛或其它纖維混入織物中，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益，因而準(zhǔn)確鑒別山羊絨與綿羊毛及其它動(dòng)物纖維顯得尤為重要。以前常用的鑒別方法主要有顯微鏡法［1］、溶液法［2，3］和光譜分析法［4，5］等，但由于山羊絨與綿羊毛同屬蛋白質(zhì)纖維，化學(xué)性質(zhì)差異不大，所以存在誤判率較高、操作復(fù)雜、主觀因素強(qiáng)等缺點(diǎn)［6］。特別是粗毛羊毛被中的底絨，又稱綿羊絨［7］，因其細(xì)度、光澤、鱗片都與山羊絨及其相似，故使用傳統(tǒng)的方法很難區(qū)別。綿羊和山羊?yàn)椴煌N的動(dòng)物，遺傳物質(zhì)的區(qū)別才是物種間根本差別，因此檢測(cè)DNA的種間差異性不失為鑒定毛絨的理想途徑［8］。

基因芯片具有高通量、自動(dòng)化、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛用于動(dòng)物源性成分檢測(cè)［9］、病原微生物、細(xì)菌檢測(cè)［10-12］、基因多態(tài)性［13-15］、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)［16］等領(lǐng)域。我國(guó)是毛絨生產(chǎn)大國(guó)，但毛絨摻雜檢測(cè)技術(shù)相對(duì)比較滯后，檢測(cè)手段單一，專業(yè)人員少，國(guó)內(nèi)也沒有成熟的毛絨鑒別技術(shù)來(lái)支撐毛絨市場(chǎng)以及進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫，因此急需一項(xiàng)新型檢測(cè)技術(shù)來(lái)彌補(bǔ)這方面的缺陷?；蛐酒夹g(shù)在高通量檢測(cè)方面有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。文章根據(jù)毛絨DNA的特點(diǎn)和基因芯片核酸分子雜交原理，在通用引物擴(kuò)增區(qū)間設(shè)計(jì)出一對(duì)能鑒別山羊和綿羊源性的探針，旨在建立能同時(shí)檢驗(yàn)山羊和綿羊源性的基因芯片方法，并確定檢驗(yàn)的最低限量。

1 材料與方法

1.1 材料

從綿羊和山羊體上剪下的毛絨，剪毛時(shí)盡量貼近皮膚。

PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Biometra公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）、基因芯片點(diǎn)樣儀、芯片掃描儀、雜交儀、芯片清洗儀（北京博奧生物芯片公司），其余為實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

Chelex-100（SIGMA公司）、蛋白酶K（Genviw公司）、TaqDNA 聚合酶、dNTPs、SSC、Denhardt’s液（上海生工生物公司）、Cy5-dCTP（Health Care公司）、醛基化基片及蓋片（北京博奧生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)選用了一對(duì)可擴(kuò)增綿羊和山羊線粒體基因cyt b的通用引物［3］，在引物的擴(kuò)增區(qū)間設(shè)計(jì)出數(shù)對(duì)探針，將這些探針序列用NCBI的 Blast進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證，最終選擇特異性較好的序列作為鑒別綿羊絨與山羊絨的基因探針，陽(yáng)性定位探針和陰性質(zhì)控探針見石豐運(yùn)報(bào)道［9］。引物和探針的合成、修飾由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，具體序列見表 1。

1.2.2 毛干DNA提取 改進(jìn)的chelex-100法：稱取毛發(fā)樣本10 mg左右，液氮研磨粉碎后置于2 mL離心管中。先后用無(wú)水乙醇，去離子水各浸泡30 min，每管中依次加入1720 μL 20% Chelex-100（SIGMA）、80 μL 1 mol/L DTT、200 μL 20 mg/mL 蛋 白 酶K，56℃溫浴5-6 h，劇烈振蕩30 s，100℃，8 min，使蛋白質(zhì)變性。振蕩30 s。12 000 r/min 離心15 min，取上清。

1.2.3 PCR產(chǎn)物制備 利用上述引物，分別對(duì)綿羊毛和山羊絨DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5 μL、Mg2+2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL、Cy5-dCTP 0.5 μL、正向引物和反向引物各1 μL（10 μmol/L）、DNA 模板（10 ng/μL）5 μL、Taq酶 1 μL（5 U/μL）、ddH2O 補(bǔ)足總體積到50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性45 s，55℃退火 45 s，72℃ 延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.2.4 芯片的制備 將合成的探針用 1×TE 溶解至終濃度為 40 μmol/L，與 50% DMSO 等體積混勻后作為探針點(diǎn)樣混合液，加入384 孔板中，空白對(duì)照為 50% DMSO，按預(yù)先設(shè)計(jì)的探針點(diǎn)陣點(diǎn)至基片上。將芯片點(diǎn)有探針的一面在65℃水合10 s兩次，自然晾干，紫外交聯(lián)5 min。將芯片在42℃預(yù)熱，0.5% SDS清洗10 min，然后用42℃預(yù)熱的去離子水清洗2 min，離心甩干，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 芯片雜交與清洗 將Cy5熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和雜交液（25%甲酰胺，3×SSC，5×Dehartdt液，0.2% SDS）等量混合，總體積為80 μL；將其轉(zhuǎn)移到PCR管中，在PCR儀上95℃熱變性5 min，冰浴驟冷5 min；將雜交混合液點(diǎn)到芯片后蓋上蓋玻片，放入雜交儀中，42℃雜交2 h。雜交完成后分別預(yù)熱洗液A（2×SSC，0.2% SDS）和洗液B（0.2% SDS）至42℃，洗液A洗兩次，各2 min；洗液B洗一次，2 min。

2 結(jié)果

2.1 毛絨DNA提取

分別剪下山羊絨和綿羊毛毛根部分毛樣，通過(guò)改進(jìn)的chelex-100法提取毛絨mtDNA作為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，通用引物能有效擴(kuò)增出山羊絨和綿羊毛cytb部分基因，大小在500 bp左右，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同。

圖 1 毛絨cytb基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 探針雜交特異性試驗(yàn)

基因芯片雜交及掃描結(jié)果顯示，兩條探針與目的產(chǎn)物有較好的雜交信號(hào)，綿羊毛和山羊絨PCR產(chǎn)物均可與芯片內(nèi)相應(yīng)的探針進(jìn)行雜交，而與其它的探針無(wú)特異性交叉反應(yīng)，陽(yáng)性質(zhì)控探針及陰性質(zhì)控探針雜交信號(hào)正常，表明這兩條探針有很好的特異性，探針點(diǎn)樣和雜交結(jié)果分別見圖2和圖3。

圖2 探針點(diǎn)樣矩陣圖

圖 3 基因探針特異性雜交結(jié)果圖

2.3 芯片最低檢測(cè)限量試驗(yàn)

分別以在山羊源性PCR產(chǎn)物中摻入50%、10%、3%、1% 比例的綿羊源性產(chǎn)物，然后與綿羊源性探針雜交。根據(jù)芯片雜交掃描分析后的圖像，得出能檢測(cè)出綿羊源性最小摻入量，這也間接的反應(yīng)出混合毛絨樣品中的山羊絨和綿羊絨的檢出限量。試驗(yàn)結(jié)果（圖4，圖5）表明，該芯片能夠檢出到3%的綿羊絨摻雜量。

圖4 基因芯片點(diǎn)樣矩陣圖

圖5 不同比例綿羊源性成分與芯片雜交信號(hào)圖

3 討論

動(dòng)物毛纖維中 DNA 含量極其微量，核 DNA 主要存在于毛囊部位，毛干中幾乎沒有核 DNA，僅含有微量 mtDNA，且取材部位隨著與毛囊距離的增加而呈減少趨勢(shì)［17］，另外，毛干外層的角質(zhì)蛋白對(duì)酸、堿和很多化學(xué)物質(zhì)都具有較好的抗性，裂解非常困難，所以毛絨DNA提取一直非常困難。有關(guān)動(dòng)物毛絨DNA提取方法有一些報(bào)道，如PCR緩沖液法、SDS-蛋白酶K法，試劑盒法等都容易從毛囊部位提取DNA［6］，提取毛干DNA比較成功的方法有chelex-100法、堿裂解法和 QIAamp@DNA Investigator試劑盒法，從安全性和價(jià)格上考慮，chelex-100法仍是毛絨DNA提取的首選。無(wú)論何種方法，關(guān)鍵是消化毛干外層的角質(zhì)層，液氮研磨毛干，chelex -100結(jié)合蛋白酶K有助于增加蛋白酶K與毛絨的接觸面積，破壞毛干保護(hù)層，從而提高DNA的抽提效率。

線粒體DNA是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，所有組織細(xì)胞中均含有大量的線粒體，mtDNA 主要以編碼序列構(gòu)成，種內(nèi)的異質(zhì)基因很少［18］，而在不同的物種間具有高度的變異性［19］。山羊、綿羊都屬于?？粕窖騺喛?，說(shuō)明它們之間存在著很近的親緣關(guān)系［20］。 而Cyt b基因是線粒體自身編碼的為數(shù)不多的蛋白質(zhì)之一，其進(jìn)化速度適中，進(jìn)化模式清楚，加上能用一些通用引物擴(kuò)增，是鑒別親緣關(guān)系較近品種的理想工具之一［21-23］。

基因芯片檢測(cè)的關(guān)鍵之一在于設(shè)計(jì)出特異性探針，探針的特異性和引物的通用性是成功建立基因芯片檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵［24-26］。由于山羊和綿羊mtDNA基因組的相似度達(dá)到了90%，在通用引物的擴(kuò)增區(qū)間設(shè)計(jì)特異性探針，具有一定困難。本研究所用的通用引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為500 bp，山羊和綿羊的相似度達(dá)到了96%，探針的設(shè)計(jì)除了使用軟件外，還需手動(dòng)增減堿基，然后用 NCBI的blast驗(yàn)證特異性，最后經(jīng)試驗(yàn)雜交驗(yàn)證才能最終確定出特異性強(qiáng)的探針。芯片檢測(cè)過(guò)程中的各項(xiàng)條件也是影響檢測(cè)結(jié)果的因素，合適的反應(yīng)條件可以降低雜交背景、提高雜交特異性，嚴(yán)格控制溫度和試劑的離子強(qiáng)度是避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的先決條件，在雜交過(guò)程中，溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性，還會(huì)影響檢測(cè)信號(hào)的特異性。相反，提高溫度或降低離子強(qiáng)度會(huì)增加雜交的嚴(yán)格性。研究發(fā)現(xiàn)雜交溫度應(yīng)在42℃為宜，雜交時(shí)間2 h 即可，與雜交12 h 相比無(wú)顯著差異。

目前，國(guó)內(nèi)用于羊絨羊毛鑒別依然采用傳統(tǒng)常規(guī)的國(guó)標(biāo)方法［27］，而分子鑒別手段有 SNP 分型檢測(cè)和 DNA 分析。SNP 操作復(fù)雜、所需時(shí)間長(zhǎng)、步驟分散、易出錯(cuò)、價(jià)格昂貴、專業(yè)要求高、難以實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)等。而 DNA 分析常常是通過(guò)PCR法來(lái)實(shí)現(xiàn)，對(duì)通過(guò) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳完成檢測(cè)，必要時(shí)需進(jìn)行酶切鑒定［28，29］或測(cè)序鑒定?；蛐酒瑱z測(cè)最大的優(yōu)點(diǎn)在于高通量，對(duì)于從事毛絨檢測(cè)的機(jī)構(gòu)來(lái)說(shuō)是非常必要的，因?yàn)槊q檢測(cè)機(jī)構(gòu)和進(jìn)出口檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)常常面臨成百上千的樣品，利用基因芯片進(jìn)行檢測(cè)，可同時(shí)并行檢測(cè)大批量的樣品，大大地縮短了檢測(cè)的時(shí)間，節(jié)約了人力，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。石豐運(yùn)［9］等利用 mtDNA 16S rRNA 基因?yàn)槟繕?biāo)基因，在通用引物擴(kuò)增區(qū)間設(shè)計(jì)了16條特異性基因芯片檢測(cè)探針對(duì)16種動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)，體現(xiàn)出了基因芯片客觀、準(zhǔn)確、高通量的優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)山羊絨和綿羊絨DNA提取和基因芯片鑒別方法的研究，初步建立了一種快捷、特異、靈敏且穩(wěn)定地鑒別綿羊絨和山羊絨的基因芯片方法，可以應(yīng)用于山羊絨與綿羊絨的定性判斷。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Identification of Cashmere and Sheep down by Microarray Technology

Lü Xuefeng Abliz Ablimit Pa Naer Tao Weidong Xing Weiting Cai Fula Zheng Wenxin
（Department of Agriculture-Breeding Sheep and Wool and Cashmere Quality Supervision Test Center，Urumqi 830000）

This study is to explore the method for identification of cashmere and sheep down by gene chip, thereby enabling rapid, highthroughput identification of cashmere and sheep down. According to the specificity of the genetic material of cashmere and sheep down, cyt b was selected as the target gene, a pair of probes that can identify cashmere and sheep down was designed in the universal primers interval of cyt b gene. Then PCR products of different proportions derived from sheep were hybridized with probe. Results showed that in goat derived PCR products, when content of PCR products derived from sheep was 3%, hybridization signal was still visible. It indicates that the gene chip method can be used to qualitatively identify the cashmere and sheep down, and has a very high specificity.

Cashmere Sheep down Mitochondria DNA Cyt b gene Gene chip

2013-10-07

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)

呂雪峰，男，中級(jí)，研究方向：動(dòng)物遺傳育種；E-mail：lxf00700@163.com

鄭文新，男，研究員，研究方向：絨山羊育種與毛絨標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制技術(shù)；E-mail：zwx2020@126.com