酵母雙雜交及其衍生系統(tǒng)

黃欣媛1范紅波2
（1.湖北工程學院特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，孝感 432000；2.湖北職業(yè)技術學院，孝感 432000）

酵母雙雜交系統(tǒng)是一種研究蛋白質相互作用的分子生物學方法，過去20多年里，大量衍生系統(tǒng)的出現使得這套雙雜交技術體系更加完善和高效，成為研究蛋白質-配體相互作用的重要技術手段，廣泛應用于功能基因組學、蛋白質組學、病理學等研究領域。對酵母雙雜交及其衍生系統(tǒng)的基本原理和應用進展進行綜述。

酵母雙雜交系統(tǒng) 蛋白質相互作用 雙雜交技術體系

生物大分子間的相互作用是有機體細胞活動的基礎，在蛋白質層面上揭示生命活動本質是現代生物學的一個主要目標。1989年誕生的酵母雙雜交（Yeast two-hybrid，Y2H）系統(tǒng)以及隨后出現的各種衍生系統(tǒng)是研究蛋白質之間以及蛋白質和RNA、小分子化合物之間相互作用的最重要的工具，已成功揭示了大量的蛋白相互作用，在細胞信號轉導、蛋白質組學、病理學、藥物研發(fā)等方面有著廣泛應用［1］。本文對Y2H系統(tǒng)的基本原理、衍生系統(tǒng)和應用進展等方面進行介紹。

1 酵母雙雜交系統(tǒng)的原理

酵母GAL4轉錄因子由兩個可以分開的結構域組成：DNA結合域（DNA binding domain，BD）負責結合基因的上游激活序列，將轉錄激活域（Transcriptional activation domain，AD）募集到啟動子區(qū)域從而激活基因的轉錄。兩者分開時不能激活基因轉錄，只有BD和AD通過一定方式在空間上足夠靠近，才能發(fā)揮完整的GAL4轉錄因子活性。基于此特點，Fields和Song［2］設想以一對能相互作用的蛋白質為橋梁，將空間上分開的BD和AD彼此拉近，從而重建出具有活性的轉錄因子，以此創(chuàng)立了Y2H系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，將BD和AD基因分別和誘餌蛋白（Bait）和獵物蛋白（Prey）基因構建成融合蛋白表達載體，使其在酵母中共表達出BDBait和AD-Prey，借助Bait和Prey的物理性相互作用使BD和AD相互靠近而產生具有功能的轉錄因子，進而激活1個或多個報告基因（如lacZ、HIS3和URA3等）的轉錄。

2 酵母雙雜交系統(tǒng)的衍生系統(tǒng)

Y2H系統(tǒng)是在酵母菌這種真核細胞環(huán)境中研究

蛋白相互作用的一種技術，具有操作簡便、無需繁瑣的蛋白純化操作、可以檢測較弱的相互作用等優(yōu)點［3］。但是也存在假陽性率較高（檢測到的相互作用有20%-50%在真正生理環(huán)境下并不發(fā)生［4］）、技術靈敏度較低（一次檢測只能涵蓋5%-20%的真正相互作用［5］）等缺陷。針對此，很多學者不斷改進試驗設計和操作技術，開發(fā)出許多衍生系統(tǒng)，提高了傳統(tǒng)Y2H系統(tǒng)的靈敏度和特異性，極大地擴展了Y2H系統(tǒng)的應用范圍。

2.1 篩選模式的多元化

在Vidal等［6］建立的反向雙雜交系統(tǒng)（Reverse two-hybrid system）中，使用URA3作為報告基因，其表達產物對酵母菌具有毒性，使其不能生長。當Bait和Prey沒有相互作用或互相解離時，毒性報告基因不表達，菌株能正常生長。這種反向篩選（負篩選）法可鑒定出阻斷蛋白間相互作用的因子，在研究蛋白質重要結構域和作用位點以及影響蛋白質結合或解離的因素等方面發(fā)揮重要作用［7］。

研究蛋白質-DNA相互作用的酵母單雜交系統(tǒng)（Yeast one-hybrid system）［8］的原理在于：Prey蛋白可直接與DNA相結合，使得與Prey融合的AD激活報告基因的表達，而無需BD-Bait蛋白參與，故被命名為“單”雜交系統(tǒng)，它為轉錄因子的分離鑒定研究提供了有效方法［9］。

某些蛋白質的相互作用需要第三個分子如小分子配體、RNA等來介導，三雜交系統(tǒng)（Three-hybrid system）［10］就是研究這些第三分子的技術。第三分子通過對Bait或Prey蛋白進行修飾，或誘導其構象發(fā)生改變，從而使兩者產生相互作用，進而激活報告基因表達。

雙誘餌酵母雙雜交系統(tǒng)（Dual bait yeast twohybrid system）［11］在同一酵母細胞中轉入一個ADPrey和兩個不同的BD-Bait，如果一個Bait與Prey之間有相互作用，則可激活該Bait對應的報告基因的表達，兩個Bait都可以和Prey作用的話就會激活所有報告基因。它的優(yōu)點是僅一次實驗就能同時進行兩次獨立篩選，并可比較出這兩對蛋白結合能力的差異。該系統(tǒng)被成功地應用于研究靶蛋白上的作用位點，以及藥物對蛋白互作的破壞作用［12］。

2.2 報告基因的改進

多個報告基因的引入有利于提高Y2H技術的靈敏度和選擇性，如廣泛應用的PJ69-4A酵母菌株［13］包含HIS3、ADE2和lacZ三個報告基因。Shaffer等［14］以此酵母菌為基礎，改造成BAPJ69-4A菌株，加入URA3作為第4個報告基因，使得基于該菌株的Y2H既可用于正篩選，也可用于負篩選。

lacZ報告基因的轉錄主要靠定性或定量的β-半乳糖苷酶活性分析來檢測，需要使用發(fā)色底物X-Gal，而熒光蛋白作為報告蛋白的優(yōu)點在于不需要添加額外的底物，可以通過流式細胞術直接檢測并分離出陽性細胞，無需繁瑣的選擇性培養(yǎng)基篩選操作。如Chen等［15］將酵母加強綠色熒光蛋白（Yeast enhanced green fluorescent protein，yEGFP）基因、Damon等［16］將加強黃色熒光蛋白（Enhanced yellow fluorescent protein，eYFP）基因作為報告基因引入Y2H系統(tǒng)，可用熒光顯微鏡觀察報告蛋白的表達，并可方便地應用流式細胞儀來鑒定篩選蛋白質相互作用［17］。

2.3 載體構建策略的改進

在表達載體構建上的一些改進措施可以降低Y2H系統(tǒng)的假陽性和假陰性率。傳統(tǒng)Y2H系統(tǒng)中構建的融合表達載體是將Bait或Prey蛋白與BD或AD的N端融合，Stellberger等［18］設計了兩個新載體：pGBKCg和pGADCg，分別用于將BD的C端和Bait，以及AD的C端和Prey蛋白融合。在Y2H篩選中，將這兩個載體和已有的兩種N端融合載體聯(lián)用，可形成4種不同的Bait-Prey作用組合，即NN、NC、CC和CN。經過對水痘帶狀皰疹病毒的70種蛋白質組合成的約4 900個候選作用配對進行測試發(fā)現，綜合使用4種載體組合所篩選到相互作用是傳統(tǒng)Y2H使用單一NN組合的兩倍，顯著降低了假陰性率。此外，各組合得到的相互作用結果還可以互相印證，進一步削減了假陽性率［19］。

2.4 宿主系統(tǒng)的擴展

細菌雙雜交和哺乳動物雙雜交的出現將Y2H的宿主由酵母細胞擴展到細菌和哺乳動物細胞內。細菌雙雜交系統(tǒng)（Bacteria two-hybrid system）由Karimova等［20］設計，利用腺苷酸環(huán)化酶缺陷型大

腸桿菌中Bait和Prey蛋白的相互作用，重建腺苷酸環(huán)化酶催化功能，引起cAMP的合成，進一步活化cAMP/CAP依賴型啟動子，激活報告基因轉錄進而引發(fā)信號轉導級聯(lián)反應。該系統(tǒng)最大優(yōu)點是細菌的轉化效率比酵母更高，可綜合性分析更大更復雜的蛋白互作網絡，因而得到了廣泛應用［21］。如Kim等［22］利用細菌雙雜交篩選出人CPI-17蛋白的14個作用蛋白，其中橋粒斑珠蛋白可能參與CPI-17介導的內皮細胞骨架重組。經Battesti等［23］改良的細菌雙雜交系統(tǒng)可適用于研究帶標簽的重組蛋白，而且可方便地將其基因轉移到帶有6-His、鈣調蛋白結合肽或pBAD標簽的載體上，更利于蛋白質的親和純化。

酵母屬低等真核生物，對蛋白質的翻譯后修飾水平有限，某些蛋白質在酵母中不能被糖基化、磷酸化或不能正確折疊。哺乳動物雙雜交系統(tǒng)（Mammalian two-hybrid system，M2H）可適用于檢測相互作用依賴于翻譯后修飾的蛋白質［24，25］。其基本原理和Y2H系統(tǒng)類似，借由Bait和Prey在哺乳動物細胞中相互作用而激活報告基因的表達。哺乳動物雙雜交系統(tǒng)內容豐富，各方法采用的表達載體、宿主細胞以及報告基因等種類各異，如MAPPIT系 統(tǒng)（Mammalian protein-protein interaction trap system）［26］利用的是哺乳動物細胞中由蛋白相互作用引起的STAT轉錄因子的激活；trM2H系統(tǒng)（Tetracycline repressor-based mammalian two-hybrid system）［27，28］利用HEK293細胞中四環(huán)素阻遏蛋白因為Bait-Prey相互作用而形成二聚體，再和四環(huán)素操縱基因結合，進而激活報告基因GFP（綠色熒光蛋白）表達。哺乳動物雙雜交系統(tǒng)目前仍在不斷完善和發(fā)展中，廣泛應用于多種哺乳動物蛋白互作研究［29］。如Guo等［30］利用M2H系統(tǒng)發(fā)現了p300蛋白的Ser12以及CBP蛋白的Ser92磷酸化位點分別是調節(jié)二者和β-catenin之間相互作用的重要位點。

2.5 核外雙雜交系統(tǒng)

傳統(tǒng)Y2H檢測的相互作用發(fā)生在酵母細胞核中，而SOS募集系統(tǒng)（SOS recruitment system）［31］、分裂泛素系統(tǒng)（Split ubiquitin system）［32］以及分裂TEV蛋白酶系統(tǒng)（Split TEV protease system）［33］等核外雙雜交系統(tǒng)把相互作用場所轉移到了細胞核外。SOS募集系統(tǒng)利用待測蛋白的相互作用，將SOS蛋白從胞漿中募集到細胞膜上，激活RAS信號通路，使得溫度敏感型宿主酵母菌株可以在37℃生長。該系統(tǒng)可用于研究膜蛋白以及在胞漿中行使功能的蛋白質，如研究擬南芥PEPINO/PASTICCINO2蛋白的膜定位［34］，水皰性口炎病毒核衣殼蛋白在HeLa細胞胞漿中的互作蛋白［35］等。

分裂泛素系統(tǒng)［32］將整合在膜上的Bait與泛素的C半段以及一個轉錄因子構建成融合蛋白，Prey融合于泛素的N半段，Bait和Prey二者的互作將重建出完整泛素分子，使其被胞漿的泛素降解酶識別并切割，釋放出和泛素C半段融合的轉錄因子，進而激活報告基因表達。該系統(tǒng)具有高度的適用性，在研究多種生物的膜蛋白互作中發(fā)揮重要作用［36］，如Harty等［37］用該系統(tǒng)分析了內質網膜上蛋白易位通道蛋白Sec61和Ssh1蛋白的相互作用。

由Wehr等開發(fā)的分裂煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）蛋白酶系統(tǒng)［33］利用蛋白互作重建TEV蛋白酶活性，裂解作為報告蛋白的熒光或發(fā)光蛋白原，使其發(fā)光進而被檢測到。該系統(tǒng)適用于檢測哺乳動物細胞胞漿和細胞膜上的蛋白相互作用［38，39］。Gray等［40］用該系統(tǒng)研究了人腎上皮細胞中凋亡相關的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-3、-6和-7的功能，結果顯示三者都被短暫地激活，但是只有caspase-3或-7能夠誘導凋亡的發(fā)生。

2.6 定量分析技術

Y2H技術的優(yōu)點之一就是可以對相互作用強度進行定量/半定量檢測，主要原理是檢測報告基因的激活程度。目前主要的定量方法有β半乳糖苷酶（lacZ基因編碼產物）活性分析［41］，酵母菌生長曲線分析（利用HIS3基因產物影響酵母在SDHis培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)）［42，43］，熒光報告蛋白熒光強度檢測［15］等。這些方法均檢測的是報告基因轉錄后被翻譯而成的蛋白質產物的數量，由于一些mRNA/蛋白穩(wěn)定性以及翻譯活性是可變的，檢測蛋白質水平不一定能真實反映出基于報告基因轉錄活性的mRNA水平。因此Maier等［44］利用實時定量PCR（QT-PCR）法對Y2H系統(tǒng)中報告基因轉錄成的mRNA表達水平進行定量檢測，經驗證比傳統(tǒng)Y2H

的靈敏度更高，部分解決自激活（單獨的Bait融合蛋白激活報告基因轉錄）和假陰性問題，可用于檢測普通Y2H系統(tǒng)不適用的蛋白相互作用。

2.7 有關試驗操作方法的改進和探討

在試驗操作方法上做一些改進可以提高Y2H的篩選效率。提高酵母轉化率會提升雜交信號的強度，更加有利于篩選。Lin等［45］改進了酵母的醋酸鋰電轉化法，使用標準濃度5倍的轉化試劑，即0.5 mol/L的LiAc、50 mmol/L Tris-HCl和5 mmol/L EDTA（pH 7.5），對Y2H常用的3種酵母菌株進行電轉化試驗，結果使轉化率顯著提升到1.84×106轉化子/μg DNA。

不同實驗室由于使用不同的雙雜交系統(tǒng)，或不同載體、菌株和報告基因，造成各自結果之間差異很大［46］。Liu等［47］的研究表明，培養(yǎng)基的不同配制方法和酵母氮源的來源不同也會影響信號的強度，以及結果是否呈現為陽性或陰性，因而認為更換培養(yǎng)基配方可能會減少各獨立試驗之間的信號差異，研究報告中培養(yǎng)基配制方法必須詳細描述以利于不同試驗結果的準確對比和進行重復研究。

在大規(guī)模的Y2H矩陣篩選操作方面，為使結果更加嚴謹，Worseck等［48］提出以下要求：（1）載體上使用很弱的啟動子，使Bait和Prey融合蛋白極低水平表達，即用Western Blot檢測酵母總蛋白裂解液也不能夠檢出；（2）使用最嚴謹的報告基因（如HIS3），即使是長期培養(yǎng)后，報告基因也不能在沒有Prey-Bait相互作用時激活；（3）為檢測較弱的相互作用，試驗操作中必須使用新鮮的酵母菌，并進行重復試驗。

3 酵母雙雜交的應用

Y2H及其衍生系統(tǒng)的應用范圍廣泛，由最初的研究蛋白質之間相互作用擴展到研究蛋白質和DNA、RNA以及其他小分子等配體間的相互作用。在細胞信號轉導、免疫學、病理學以及蛋白質組學等領域發(fā)揮重要作用。

3.1 篩選已知蛋白質在cDNA文庫中的相互作用對象應用Y2H系統(tǒng)篩選cDNA文庫中和已知蛋白有相互作用的蛋白質已經成為研究已知蛋白新功能主要途徑。主要操作流程為：以已知蛋白作為Bait，在指定的cDNA文庫中篩選出有報告基因激活的陽性酵母克隆，從中分離純化出Prey載體，測定其DNA序列，在GeneBank中獲取該序列信息，即可獲知Prey蛋白的相關信息。Yoon等［49］用Y2H系統(tǒng)篩選出擬南芥中赤霉素受體GID1直接作用的信號轉導蛋白DELLA，以及一種抑制這種相互作用的化合物：TSPC（3-（2-thienylsulfonyl）pyrazine-2-carbonitrile），該研究對于研究植物中赤霉素信號通路具有重要意義。Kim等［50］為研究黑腹果蠅中刺激轉錄延伸的關鍵因子Cyclin T/CDK9異源二聚體的組裝方式，利用大規(guī)模Y2H篩選法鑒定出該復合物的溫度敏感型變異體，表明兩者結合的關鍵在兩者作用界面的α2和α3螺旋上，該突變體通過影響Cyclin T的構象直接或間接干擾Cyclin T和CDK9的結合。

3.2 繪制蛋白質相互作用網絡圖譜

機體內蛋白質之間的復雜的相互作用網絡是相互作用物組（Interactome）的一個重要組成部分，對該網絡作圖也是蛋白質組學的重要研究內容。目前開發(fā)出的一些高通量Y2H方法，可以對多達數千的候選蛋白進行篩選，是繪制蛋白質相互作用網絡圖譜的重要手段。在這一技術的輔助下，一些模式生物的蛋白互作組草圖相繼被繪制，如：酵母［51，52］、黑腹果蠅［53］、人類［54，55］及秀麗新桿線蟲［56］等?，F今對蛋白互作組圖譜的描繪越來越精細，如對胞內核心信號通路——MAPK信號通路所涉及的蛋白互作網絡進行分析，對于更好地揭示細胞信號轉導機制具有重要意義。Bandyopadhyay等［57］用Y2H篩選出人MAPK相關蛋白和其他胞內蛋白之間的2 269對相互作用，對其進行作圖，經分析發(fā)現其中641對互作在酵母中也存在，這種保守性證明這些作用對在信號網絡中起核心作用。Singh等［58］也對水稻的MAPK互作組進行了系統(tǒng)性的圖譜繪制，找出了MAPK的74個非冗余作用對象，對這些蛋白進行基因本體分類分析發(fā)現其歸屬于34種功能類別，提示MAPK參與多種重要生理功能。

3.3 研究疾病作用原理

利用Y2H系統(tǒng)研究一些疾病相關蛋白的作用靶標可以為更好地揭示疾病的發(fā)病機制提供思路。Chen等［59］發(fā)現被SARS病毒侵染的宿主細胞中，

病毒的解螺旋酶可以和Ddx5（Asp-Glu-Ala-Asp box polypeptide 5）蛋白結合，抑制Ddx5的表達可以抑制SARS病毒的復制，提示Ddx5在SARS病毒-宿主相互作用中起重要作用。Silva等［60］利用Y2H系統(tǒng)篩選出登革熱病毒糖蛋白NS1在人肝臟中的一個新作用蛋白C1q，后續(xù)試驗表明，NS1和C1q的作用在補體系統(tǒng)和登革熱病毒感染病理進程中起重要作用。

在癌癥機理研究方面，Lopez-Mateo等［61］利用Y2H篩選出抑癌蛋白p53的一個作用蛋白：轉錄因子CREBZF。CREBZF的表達可增強p53的轉錄活性，保護HCT116細胞免受紫外線誘導的細胞死亡，還使得細胞對5-氟尿嘧啶這種能活化p53的抗癌化學治療藥物敏感，提示CREBZF對p53的抑癌活性起正調作用，是一個重要的癌癥調節(jié)因子。

3.4 篩選藥物作用靶點以及新藥開發(fā)

Y2H及其衍生系統(tǒng)在藥物研究方面有著非常廣泛的應用，如篩選和驗證藥物的作用靶點、研究藥物對蛋白互作的調控作用、篩選和設計新藥等［62］。在研究抗體性藥物的作用位點方面，Vielemeyer等［63］報道了以Y2H技術為基礎的一種高效的方法：以單鏈抗體（scFv）作為Bait，篩選高復雜度的cDNA文庫，對得到的cDNA片段進行多重比對可獲知其上的選擇性相互作用域（SID）信息，從而高效地定位抗體靶標蛋白上的表位區(qū)域。他們篩選到AA2和ROF7這兩種scFv的專一性作用靶標：小GTP酶Rab6和Rab1。這種結合具有構象特異性，只有當靶標蛋白包含整個SID核心區(qū)域才能夠被篩選到。由此可見，該方法具有很高的特異性。也可將已知蛋白作為Bait，篩選與之結合的scFv。如Ding等［64］成功篩選出3種與人IL-8特異性結合的scFv。

在抗病毒藥物開發(fā)方面，Urano等［65］利用SOS募集系統(tǒng)從20 000個候選的小分子中篩選出抑制人免疫缺陷病毒（HIV）Gag蛋白裝配的化合物BMMP（2-（benzothiazol-2-ylmethy-lthio）-4-methylpyrimidine），若以BMMP為基礎，可設計開發(fā)出新的抗HIV病毒藥物。

4 結語

Y2H是試驗技術發(fā)展和酵母遺傳學相結合的產物，其原理在于通過一對蛋白的相互作用將轉錄因子活性進行重建，這種自我重組裝/功能重建的概念催生了一大批相關的衍生技術，揭示了細胞中大量復雜的生物大分子互作網絡，為進一步解碼這些作用網絡的功能提供基礎［66］。這些相關的改進包括：設計新的篩選方案、改進載體和菌株、使用酵母以外的生物作為宿主、反向篩選法、分析蛋白質和DNA、RNA或其他配體相互作用、檢測胞漿或細胞膜上蛋白互作、開發(fā)其他的可以被分裂拆開的報告蛋白（如泛素、熒光蛋白、熒光素酶和腺苷酸環(huán)化酶等）等。Y2H及其衍生系統(tǒng)共同組成一套內容豐富的“雙雜交”技術體系，是研究生物大分子相互作用的重要手段。Y2H系統(tǒng)創(chuàng)始人Fields展望了這一技術體系的前景［66］：隨著試驗技術的進步和研究者的不斷努力，以及生物分子優(yōu)良的工具屬性被深入揭示，雙雜交這一技術體系會不斷向前發(fā)展，內涵會更加豐富，應用平臺會更加廣闊。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Yeast Two-Hybrid System and Its Several Derived Systems

Huang Xinyuan1Fan Hongbo2
（1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables，Hubei Engineering University，Xiaogan 432000；2.Hubei Polytechnic Institute，Xiaogan 432000）

The Yeast two-hybrid（Y2H）system is a molecular biology approach to detect protein-protein interactions. A diverse series of technologies derived from it have emerged in the past 20 years, which makes this two-hybrid methodology system more complete and efficient. They have been among the most important and powerful tools to study ptotein-ligand interactions that widely used in functional genomics, proteomics and pathology study. This article provides an overview on the basic principles and application progress of Y2H system and some derived techniques.

Yeast two-hybrid（Y2H）system Protein-protein interaction Two-hybrid methodology system

2013-08-03

特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室開放基金項目（2013K04）

黃欣媛，女，博士，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：huangxycn@gmail.com