李古月 劉佳鑫 才 謙

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110000；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600

平胃散中蒼術(shù)素在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

李古月1，2劉佳鑫1，2才 謙3

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110000；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600

目的研究平胃散中蒼術(shù)素在大鼠血漿及組織中分布特征。方法建立大鼠血漿中蒼術(shù)素的HPLC測(cè)定方法，考查大鼠口服平胃散混懸液0.17，0.33，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12，24 h后血藥濃度變化和2，3，8 h后大鼠體內(nèi)組織分布情況，采用DAS 2.0數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果大鼠口服平胃散混懸液后，蒼術(shù)素在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間Tmax為2.5 h，最大濃度Cmax為1.765 mg/L，半衰期t1/2z為5.723 h，AUC 11.789 mg/L·h，且在6 h左右時(shí)第2次達(dá)峰，出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。大鼠口服平胃散混懸液后2，3，8 h的藥物組織分布由高到低的順序大致是胃>小腸、脾>肝、肺、心>腎、大腸。結(jié)論該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確，可用于大鼠血漿中蒼術(shù)素濃度的測(cè)定。

平胃散；蒼術(shù)素；藥代動(dòng)力學(xué)；組織分布；高效液相色譜

平胃散出自宋代《太平惠民和劑局方》。由炙蒼術(shù)、姜厚樸、陳皮、甘草四味藥組成，具有燥濕健脾，行氣和胃之效。主治濕困脾胃證[1]。大凡脾胃病變，只要屬于所謂脾胃濕滯，都可用它或加味而治，所以古人稱(chēng)它是“治脾圣藥”。君藥蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)A-tractylodes lancea（Thunb.）DC.或北蒼術(shù)Atractylodes Chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖，春、秋二季采挖，除去泥沙，曬干，撞去須根。蒼術(shù)味辛、苦，性溫、歸脾、胃、肝經(jīng)，具有燥濕健脾，祛風(fēng)散寒，明目的功效[2]。蒼術(shù)有效成分為倍半萜類(lèi)和聚乙烯炔類(lèi)，前者主要為β-桉葉醇，而后者主要為蒼術(shù)素[3]，并多以蒼術(shù)素作為定量指標(biāo)。以往對(duì)蒼術(shù)素的藥代動(dòng)力學(xué)研究?jī)H局限在單味藥上，因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法[4]，以大黃素甲醚為內(nèi)標(biāo)，研究復(fù)方中蒼術(shù)素的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布的變化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；HC-2062高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；XK96-B快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司）；KH-300P型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；島津LC-10A高效液相色譜儀（SPD-10Avp、LC-10ATp、N3000色譜工作站）。

1.2 藥材和藥品試劑

蒼術(shù)（麩炒）、厚樸（姜炙）、陳皮、甘草（炙）均購(gòu)自北京同仁堂大藥房大連分店，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室李峰教授鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部規(guī)定。蒼術(shù)素（批號(hào)：17-2001；上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心）；大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201013，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；氯化鈉注射液（黑龍江科倫制藥有限公司，批號(hào)：B12120408-1）；乙腈（色譜純，瑞典歐森巴克化學(xué)公司）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠，體重180～220 g，雌雄兼用，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動(dòng)物房溫度維持在18～25℃。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥液的配制

取麩炒蒼術(shù)24 g，厚樸18 g，陳皮12 g，甘草6 g，四種藥材混合粉碎（過(guò)60目篩），將混合藥材粉末置于具1 L塞圓底燒瓶中，加入900 mL 95%乙醇密封浸泡48 h，超聲1 h，靜置1 h，再超聲1 h，取出，放至室溫后抽真空濾過(guò)，濾液經(jīng)減壓旋蒸濃縮至干，將干膏用水充分溶解混勻成濃度為含生藥2 g/mL藥液，冷藏避光保存以備用。

2.2 樣品的采集及處理

隨機(jī)選取SD大鼠6只，禁食、自由飲水，24 h后，采用單次給藥法，眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，然后灌胃給平胃散混懸液（50 g/kg）。分別于給藥后0.17，0.33，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12，24 h自眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，置于用肝素預(yù)處理過(guò)的1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，分離血漿，精密量取血漿樣品200μL，加入50μL大黃素甲醚內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，再加入600μL乙腈沉淀蛋白，渦旋90 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液，加入600μL氯仿，渦旋90 s，靜置40 min，保留氯仿層，40℃空氣流下吹干，加100μL甲醇復(fù)溶，取20μL進(jìn)樣。

組織分布試驗(yàn)中，將SD大鼠20只，隨機(jī)分成4組，每組5只。實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水?？瞻捉M于給藥前處死，其余3組灌胃給予平胃散混懸液（50 g/kg），于2，3，8 h后處死，解剖采集心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸。用生理鹽水沖洗組織表面的血液和內(nèi)容物，用濾紙吸干水分，精密稱(chēng)取各組織樣品0.2 g，加入1 mL生理鹽水，勻漿處理。10 000 r/min離心5 min，取上清液200μL。加入25μL大黃素甲醚內(nèi)標(biāo)溶液，再加入600μL乙腈沉淀蛋白，渦旋90 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液，加入600μL氯仿，渦旋90 s，靜置40 min，保留氯仿層，40℃空氣流下吹干，加100μL甲醇復(fù)溶，取20μL進(jìn)樣。

2.3 色譜條件

色譜柱：Promosil-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（76∶24），流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

在上述色譜條件下，空白血漿（A），空白血漿加蒼術(shù)素和內(nèi)標(biāo)大黃素甲醚（B），大鼠血漿樣品加內(nèi)標(biāo)大黃素甲醚（C）等HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。流動(dòng)相對(duì)蒼術(shù)素與內(nèi)標(biāo)大黃素甲醚的色譜峰得到良好分離，且不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

2.4 方法學(xué)考察

分別精密稱(chēng)取蒼術(shù)素和大黃素甲醚對(duì)照品適量，甲醇配成質(zhì)量濃度分別為5.00×10-4mg/L和6.90×10-5mg/L的儲(chǔ)備液。精密量取200μL大鼠空白血漿6份，加入蒼術(shù)素對(duì)照儲(chǔ)備液，配成含蒼術(shù)素分別為4.97，2.49，0.99，0.50，0.25，0.05mg/L的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿質(zhì)控樣品，按血漿樣品處理方法操作后測(cè)定峰面積。以對(duì)蒼術(shù)素的濃度（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)蒼術(shù)素與大黃素甲醚內(nèi)標(biāo)峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，結(jié)果表明，蒼術(shù)素在0.057～4.970 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.6013X-0.0004，r=0.9981。制備蒼術(shù)素濃度為0.05，0.99，4.97 mg/L的質(zhì)控樣品的回收率分別為（87.53±1.75）%，（84.24±1.73）%，（87.65±2.73）%。日內(nèi)精密度分別為（98.86±2.86）%，（98.54±1.74）%，（97.80±1.85）%，日間精密度（98.6±3.25）%，（98.6± 1.56）%，（97.9±4.12）%。在1 h（室溫）、24 h（室溫）、30 d（-20℃）條件下樣品濃度的RSD值在3.7%～4.0%之間，符合生物樣品分析方法的規(guī)定，樣品在上述四個(gè)條件下均穩(wěn)定可測(cè)。

蒼術(shù)素在組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍分別是：Y心=1.471X-0.0858（r=0.9911），線性范圍為0.0996～9.9600 mg/L，Y肝=2.4062X-0.050（r=0.9942），線性范圍為0.0996～9.9600 mg/L，Y脾=1.8398X-0.0936（r=0.9972），線性范圍為0.0996～9.9600 mg/L，Y肺=2.1673X-0.1376（r=0.9938），線性范圍為0.0996～9.9600 mg/L，Y腎= 2.3735X-0.0684（r=0.9913），線性范圍為0.0996～9.9600 mg/L，Y大腸=1.7886X-0.1082（r=0.9931），線性范圍為0.0996～9.9600 mg/L，Y小腸=1.9305X-0.1358（r=0.9956），線性范圍為0.0996～9.9600 mg/L，Y胃= 2.0599X+0.0363（r=0.9948）。本試驗(yàn)方法測(cè)定組織的日內(nèi)精密度和日間精密度均RSD小于5%，準(zhǔn)確度在85.0%～96.8%之間，在蒼術(shù)素濃度為0.0996，0.996，9.96μg/mL的質(zhì)控樣品的回收率在82.3%～91.7%之間，RSD值在1.3%～4.3%之間，在1 h（室溫）、24 h（室溫）、30 d（-20℃）條件下組織樣品濃度的RSD值均小于5%，均符合生物樣品分析方法的規(guī)定，表明方法的可行性。

圖1 樣品HPLC色譜圖

2.5 結(jié)果

大鼠血漿中蒼術(shù)素的C-t曲線見(jiàn)圖2，數(shù)據(jù)用DAS 2.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行擬合處理，口服給藥后的藥物吸收符合非房室模型，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。大鼠口服平胃散混懸液后，蒼術(shù)素在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間Tmax為（2.5±0.5）h，最大濃度Cmax為1.764 mg/L，半衰期t1/2z為（5.723±1.316）h。

圖2 蒼術(shù)素在口服平胃散大鼠血漿中平均藥-時(shí)曲線（n=6）

大鼠各組織中蒼術(shù)素在2，3，8 h各組織分布見(jiàn)圖3。由結(jié)果可知，大鼠灌胃平胃散混懸液2 h時(shí)組織中蒼術(shù)素含量從高到低順序是：胃＞小腸＞脾＞肺＞大腸＞心＞腎＞肝，3 h時(shí)組織中蒼術(shù)素含量從高到低順序是：胃＞小腸＞脾＞肺＞心＞肝＞腎＞大腸，8 h時(shí)組織中蒼術(shù)素含量從高到低順序是：脾＞大腸＞胃＞小腸＞肝＞心＞肺＞腎。

3 討論

平胃散作為治療濕困脾胃證的中藥復(fù)方的基礎(chǔ)，在臨床廣泛應(yīng)用，目前相關(guān)報(bào)道多為臨床和藥效學(xué)應(yīng)用研究，未有相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究報(bào)道[5-8]。蒼術(shù)素屬聚乙烯炔類(lèi)成分，為君藥蒼術(shù)的特征性成分，也是活性成分之一。有相關(guān)研究表明蒼術(shù)素具有抗炎、利膽，防止胃損傷等作用[9-12]，故選用蒼術(shù)素為測(cè)定指標(biāo)，而蒼術(shù)素醇、蒼術(shù)素等聚乙烯炔類(lèi)成分不穩(wěn)定，在光照條件下易發(fā)生空間構(gòu)型變化，生成異構(gòu)體[13]，所以在整個(gè)實(shí)驗(yàn)和貯存過(guò)程中，要盡量避光處理。在沉淀蛋白的溶劑選擇過(guò)程中，分別考察了3倍勻漿體積的甲醇和乙腈，結(jié)果用乙腈沉淀蛋白較完全，而且對(duì)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)及待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定均無(wú)干擾，故最終選擇乙腈沉蛋白法。

表1 蒼術(shù)素在口服平胃散大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)（x±s，n=6）

圖3 蒼術(shù)素在口服平胃散大鼠各組織分布（x±s，n=5）

本實(shí)驗(yàn)擬選用蒽醌類(lèi)化合物大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等為內(nèi)標(biāo)，分別按血漿樣品處理方法操作及測(cè)定，結(jié)果大黃素的保留時(shí)間為10.3 min，易被相鄰的峰干擾，而大黃酚極性較小，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，故最終選用無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，與待測(cè)成分分離度良好，保留時(shí)間適中的大黃素甲醚為內(nèi)標(biāo)化合物。

本實(shí)驗(yàn)曾分別以50%、80%、95%乙醇作為藥物提取溶劑，采用相同的提取方法并定容到含生藥量0.2 g/mL的藥液，采用反相高效液相色譜法，測(cè)定各溶液中蒼術(shù)素的含量，結(jié)果其濃度以95%的乙醇液提取蒼術(shù)素含量最高，故選用95%乙醇為提取溶劑。

藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，口服給藥后的藥物吸收符合非房室模型，由藥時(shí)曲線可以看出，蒼術(shù)素在6 h左右時(shí)第2次達(dá)峰，出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。推測(cè)原因可能是由于蒼術(shù)素在大鼠體內(nèi)的吸收存在肝腸循環(huán)。大鼠組織分布測(cè)定結(jié)果表明，蒼術(shù)素在心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃等組織中均有分布，說(shuō)明蒼術(shù)素在大鼠體內(nèi)分布比較廣泛，在口服給藥后2 h時(shí)，胃和小腸中蒼術(shù)素含量很高，說(shuō)明其為蒼術(shù)素的主要吸收器官，經(jīng)血液循環(huán)系統(tǒng)分布到其他各器官，說(shuō)明此時(shí)主要進(jìn)行吸收和分布過(guò)程；3 h時(shí)蒼術(shù)素在小腸和胃中含量降低，除大腸外其他組織中蒼術(shù)素含量均有上升，說(shuō)明此時(shí)主要進(jìn)行分布過(guò)程，8 h時(shí)，蒼術(shù)素在大腸中含量明顯上升，在脾、肺、腎等組織中含量下降，推測(cè)此時(shí)主要進(jìn)行排泄過(guò)程。但在肝和心組織中含量無(wú)下降趨勢(shì)，說(shuō)明部分蒼術(shù)素在肝中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。

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Determination of Atractylodin of Pingwei Powder in rat plasma by HPLC-UV method and their application to a pharmacokinetic and a tissue distribution study

LI Guyue1,2LIU Jiaxin1,2CAI Qian3
1.The First Hospital of China Medical University,Liaoning Province,Shenyang 110000,China;2.Pharmacy College of China Medical University,Liaoning Province,Shenyang 110000,China;3.Pharmacy College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Dalian 116600,China

ObjectiveTo study the blood concentration and tissue distribution of Atractylodin after oral administration of Pingwei Powder to rats.MethodsThe determination methods of Atractylodin in Pingwei Powder in rat plasma was established by HPLC,the blood concentration of Atractylodin after oral administration of Pingwei Powder at 0.17,0.33, 0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12,24 h and tissue distribution in rats at 2,3,8 h were examined,the data was dealt with DAS 2.0 data processing software to calculate the pharmacokinetics parameters.ResultsAfter oral administration of Pingwei Powder,the Tmaxwas 2.5 h,Cmaxwas 1.765 mg/L,t1/2zwas 5.723 h,AUC was 11.789 mg/L·h.The second peak was appeared at 6 h.After oral administration of Pingwei Powder,Atractylodin was quickly distributed to main organs with the concentration difference,stomach>small intestine,spleen>liver,lung,heart>kidney,large intestine.ConclusionThis paper has developed a simple,specific,and rapid method of RP-HPLC with UV detection to determine Atractylodin of Pingwei Powder in ratplasma.

Pingwei Powder;Atractylodin;Pharmacokinetics;Tissuces distribution;HPLC

R285

A

1673-7210（2014）03（b）-0019-04

2013-10-12本文編輯：衛(wèi)軻）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81202919）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)20110700 712）。