李婷菲，葉斌

（1.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州510663；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520）

毛蚶水解產(chǎn)物抗氧化活性分析

李婷菲1，葉斌2，*

（1.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州510663；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520）

通過(guò)正交試驗(yàn)得到中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳水解條件，根據(jù)該條件制得毛蚶蛋白酶水解產(chǎn)物，檢測(cè)三種酶的DH值及分析各水解產(chǎn)物的氨基酚成分，通過(guò)水解產(chǎn)物對(duì)DPPH等自由基清除率和還原力的檢測(cè)，分析其抗氧化活性。結(jié)果表明：堿性蛋白酶水解能力最強(qiáng)，其酶解產(chǎn)物中擁有最多的可溶性肽，且體現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，是毛蚶抗氧化活性肽生產(chǎn)的最佳選擇。

毛蚶；水解產(chǎn)物；抗氧化；蛋白酶

隨著自由基生命科學(xué)研究的不斷進(jìn)展，能阻止自由基反應(yīng)傳播，終止自由基反應(yīng)的抗氧化劑研究已成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。其中，來(lái)自食物蛋白水解的抗氧化肽就是其中一類具有抑制生物大分子過(guò)氧化或清除體內(nèi)自由基產(chǎn)物的功能，減輕它們對(duì)機(jī)體的損傷的活性物質(zhì)。目前，鑒于陸生資源的日益匱乏，對(duì)抗氧化活性肽的研究也由以陸地蛋白資源為主轉(zhuǎn)為大力開發(fā)海洋抗氧化多肽。抗氧化多肽的活性，主要來(lái)自其分子量和結(jié)構(gòu)，而酶法水解已成為從海洋蛋白中釋放抗氧化多肽的一個(gè)有效途徑，有研究表明，許多海洋產(chǎn)物通過(guò)蛋白酶水解所得的活性肽，具有顯著的抗氧化活性，曾慶祝等[1]報(bào)道扇貝的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中分子量為9 ku的活性肽具有很強(qiáng)的羥自由基清除活性，其清除率SA為72.7%；扇貝的枯草桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物中分子量8 ku的活性肽對(duì)羥自由基的清除率可達(dá)73.6%。中國(guó)毛蝦的SM98011酶解液通過(guò)超濾得到分子量小于3 ku的超濾液，研究發(fā)現(xiàn)酶解液和該超濾液對(duì)·OH的抑制率分別為42.38%和67.95%[2]。

毛蚶，分布于西太平洋日本、朝鮮、中國(guó)沿岸，屬海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，是一種常見的食物和藥物資源。在中醫(yī)上，用于治療腫瘤、貧血和消炎已有幾百年的歷史。有研究證明，毛蚶的水解產(chǎn)物對(duì)被四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖小鼠具有降血糖活性，對(duì)高血脂癥實(shí)驗(yàn)小鼠模型有降血脂的作用[3]。王勇[4]等也從毛蚶中分離純化出有抗氧化活性成分的糖肽。

然而，關(guān)于毛蚶蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性研究尚未見報(bào)道，本文選擇了三種蛋白酶，以毛蚶為原料對(duì)蛋白水解條件進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定了水解產(chǎn)物的氨基酸含量和組成，并檢測(cè)了抗氧化活性，為毛蚶酶解產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛蚶產(chǎn)自山東青島；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶：廣西龐博生物工程有限公司；二苯代苦味胼基自由基（DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；DF-Ⅱ集熱型磁力加熱攪拌器：江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；pHS-25數(shù)顯酸：上海虹益儀器儀表有限公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；Heto-FD1.0-60E低壓冷凍干燥機(jī)：Heto-Helten公司；UV2450紫外分光光度計(jì)：Shimadzu公司；ICS-2500離子色譜分析儀：美國(guó)戴安公司。

1.2 方法

1.2.1 毛蚶蛋白酶解工藝過(guò)程

取清洗瀝干的毛蚶，按比例1∶1（g/mL）加入蒸餾水后，采用組織搗碎機(jī)12 000 r/min搗碎3min制備樣品勻漿。然后用0.25mol/LNaOH將勻漿調(diào)節(jié)到所需pH，按比例加入蛋白酶。酶解過(guò)程需維持反應(yīng)體系的溫度及pH恒定。反應(yīng)完畢后，將水解液加熱到90℃滅酶15min[5]，冷卻后4℃冷凍離心20min（15000 r/min），上清液冷凍干燥，保存?zhèn)溆?。同時(shí)取部分樣品勻漿，同樣條件下冷凍離心，收集上清液，即為毛蚶的可溶性蛋白粗品，冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 正交試驗(yàn)

3種蛋白酶選擇溫度、pH、酶用量和酶解時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)因素，采用了L9（34）正交表對(duì)中性蛋白酶，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解條件進(jìn)行了優(yōu)化。各因素和水平見表1。

1.2.3 酶解液水解度（DH）的測(cè)定

水解過(guò)程中采用pH-stat法測(cè)定和控制水解過(guò)程，在水解過(guò)程中不斷加NaOH以保持反應(yīng)體系pH恒定。水解度（DH）根據(jù)消耗的堿量進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)下式計(jì)算DH[6-7]：

式中：B為滴定所消耗的堿體積，mL；Nb為堿液濃度，（mol/L）；Mp為水解反應(yīng)中蛋白質(zhì)總量，g；α為α－氨基的平均解離常數(shù)[8]；htot為底物蛋白質(zhì)中的肽鍵總數(shù)（mmol/克蛋白質(zhì)），取8.0[9]。

1.2.4 抗氧化活性研究

1.2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

將待測(cè)樣品配制成20mg/mL的溶液，分別取7份不同體積的樣品，用反滲透水稀釋成2mL，備用。采用Shimada[10]所用的方法檢測(cè)，同時(shí)做空白對(duì)照。樣品對(duì)DPPH的清除率計(jì)算公示如下：

式中：S為樣品加DPPH的吸光度；C為蒸餾水加DPPH的吸光度；SB為樣品加蒸餾水的吸光度；CB為蒸餾水加蒸餾水的吸光度。

1.2.4.2 對(duì)H2O2的清除作用[11]

精密稱取7份不同重量的待測(cè)樣品，用0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH7.4）定容至5mL后，取3.4mL上述溶液，加入0.6mL 4mol/LH2O2溶液，放置10min后，混合液在230 nm下測(cè)定吸光值，以不加樣品的H2O2溶液作對(duì)照。每個(gè)濃度做3個(gè)平行。對(duì)H2O2的清除率計(jì)算公式如式1。其中，S為樣品加H2O2的吸光度；C為蒸餾水加H2O2的吸光度；SB為樣品加蒸餾水的吸光度；CB為蒸餾水加蒸餾水的吸光度。

1.2.4.3 還原力測(cè)定

精密稱取7份不同重量的待測(cè)樣品，根據(jù)Oyaizu[12]所報(bào)道的方法測(cè)定。每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

1.2.5 氨基酸含量測(cè)定

采用離子色譜分析儀分析蛋白酶水解產(chǎn)物的氨基酸種類及含量，根據(jù)文獻(xiàn)介紹方法[2-13]，對(duì)總氨基酸測(cè)定樣品和游離氨基酸測(cè)定樣品進(jìn)行前處理。分析條件為色譜柱：Amino PACPA10，2×250mm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：25μL；流速：0.25mL/min；流動(dòng)相：A.去離子水；B.0.25mol/LNaOH；C.NaAC。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種蛋白酶酶解毛蚶條件的優(yōu)化

選擇溫度、pH、酶用量和酶解時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)因素，以酶解液水解度（DH）為指標(biāo)，采用正交表L9（34）對(duì)3種蛋白酶水解毛蚶蛋白的條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，其中N、A、P分別代表中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，水解度是3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。（P＜0.05）

根據(jù)上表可知，中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳水解溫度為40、45和55℃，水解時(shí)間是5、4和6 h，E/S值是6.0%、5.0%和5.0%，pH為7.5、9.0和6.5。我們根據(jù)此最佳水解條件，對(duì)樣品進(jìn)行處理，并對(duì)3種蛋白酶的水解產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

2.2 最佳水解條件下水解度（DH）的分析

3種蛋白酶按最佳條件對(duì)毛蚶進(jìn)行酶解，并計(jì)算得出各個(gè)時(shí)間段的DH值。同時(shí)不加入外源蛋白酶進(jìn)行對(duì)照，研究毛蚶的內(nèi)源酶在水解過(guò)程中的作用。結(jié)果如圖1所示。水解度是三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

表1 3種蛋白酶的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table1 Results and analysis of orthogonal experiment of three proteases

圖1 3種蛋白酶和內(nèi)源酶水解過(guò)程中的水解度曲線Fig.1 The curve of DH during the enzyme hydrolysis of three protease and endogenous enzyme

3種蛋白酶水解過(guò)程中的水解度曲線與報(bào)道過(guò)的水解度曲線相符合[14]，堿性蛋白酶在水解過(guò)程中DH值一直高于其他兩種蛋白酶，可見其水解能力優(yōu)于其他兩種蛋白酶。在3種反應(yīng)溫度下，毛蚶內(nèi)源酶的水解度曲線沒(méi)有明顯的區(qū)別，且數(shù)值都小于2，可見內(nèi)源酶對(duì)毛蚶蛋白的酶解作用相當(dāng)弱，可以忽略不計(jì)。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性[15]

本文比較了中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分別作用于毛蚶所得的產(chǎn)物的清除DPPH自由基的能力，其中抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。清除率為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值（P＜0.05）。結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解產(chǎn)物及毛蚶對(duì)DPPH自由基的清除作用比較Fig.2 The comparison of Scavenging effect on DPPH free radical of different concentrations of A.subcrenata.and its hydrolysates

由結(jié)果可以看出，毛蚶及其酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基都具有一定的清除能力，且其清除作用與濃度相關(guān)，其中，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的上升趨勢(shì)較為明顯。

根據(jù)線性方程，我們可得出堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除作用的EC50值最低，即其清除作用最強(qiáng)，且優(yōu)于報(bào)道過(guò)的牡蠣酶解產(chǎn)物的清除活性[16]。

2.3.2 H2O2的清除作用

如圖3所示，毛蚶在酶解前就具有較強(qiáng)的H2O2清除作用，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解對(duì)其清除H2O2的活性有所提高，但值得一提的是，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的活性反而低于毛蚶的活性，這表明中性蛋白酶的酶解作用使得毛蚶本身所具有的一些活性蛋白或多肽結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而失活。

圖3 酶解產(chǎn)物及毛蚶對(duì)H2O2的清除作用比較Fig.3 The comparison of Scavenging effect on H2O2of different concentrations of A.subcrenata.and its hydrolysates

2.3.3 還原力

還原力為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值（P＜0.05）。由圖4可看出，所測(cè)樣品與吸光度之間同樣存在劑量效應(yīng)關(guān)系。酶解產(chǎn)物與毛蚶相比其還原力有所提高，3種酶解產(chǎn)物的還原力相似，與前兩種氧化活性測(cè)試結(jié)果不同的是，中性蛋白酶解產(chǎn)物的還原力優(yōu)于其他兩種酶解產(chǎn)物。這說(shuō)明酶解產(chǎn)物中清除DPPH自由基、清除H2O2和起還原作用的成分各不相同。酶解產(chǎn)物含有大量多肽，活性多肽的種類和含量也相應(yīng)提高，樣品的某一種抗氧化活性測(cè)試結(jié)果不理想，不代表不具有抗氧化功能，應(yīng)測(cè)試多種體系，有利于開發(fā)酶解產(chǎn)物的多種活性。

圖4 酶解產(chǎn)物及毛蚶還原力的比較Fig.4 Reducing power of different amounts of A.subcrenata.and its hydrolysates

2.3.4 酶解產(chǎn)物的氨基酸分析

本實(shí)驗(yàn)采用了高效離子交換色譜－積分脈沖安培法對(duì)毛蚶及水解產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸種類及含量的測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

三種酶解產(chǎn)物的氨基酸種類相似，主要有氨基酸，甘氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺。其中，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物有更多的可溶性肽，這與Gbogouri[18]的報(bào)道結(jié)果一致，即DH越高，水解物的溶解性越佳。從表2可見，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物游離氨基酸含量不少，但肽含量也相當(dāng)高，說(shuō)明堿性蛋白酶對(duì)毛蚶同時(shí)起著端基酶和內(nèi)切酶的作用，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物富含游離氨基酸，但肽的數(shù)量較少，這意味著對(duì)于毛蚶來(lái)說(shuō)，中性蛋白酶更適用于其氨基酸的生產(chǎn)，而不是活性肽。

實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)抗氧化活性成分為肽[19]，這些活性成分在體內(nèi)和腸道中的比大分子成分更容易被吸收，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，如表2所示，堿性蛋白酶解產(chǎn)物有較多的肽，抗氧化活性也較明顯，因此我們可以認(rèn)為，相比其他兩種蛋白酶，堿性蛋白酶適用于毛蚶抗氧化活性肽的生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本文選擇了3種酶（中性蛋白酶，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶）用于毛蚶的水解研究，通過(guò)正交試驗(yàn)，得到最佳酶解條件。3種酶解產(chǎn)物都具有較強(qiáng)的還原能力以及清除DPPH自由基和過(guò)氧化氫的活性，其中，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物中擁有最多的可溶性肽，且體現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，因此，我們認(rèn)為堿性蛋白酶是生產(chǎn)毛蚶抗氧化活性肽的最佳選擇，這為進(jìn)一步研究毛蚶抗氧化組分，并為其在營(yíng)養(yǎng)保健品和藥物的研制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Investigation of Antioxidant Activities of Hydrolysates from Arca subcrenata Lischke

LI Ting-fei1，YE Bin2，*
（1.Guangdong Food and Drug Vocational-technical School，Guangzhou 510663，Guangdong，China；2.Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，Guangdong，China）

An orthogonal design was used to optimize hydrolysis conditions of three proteases， and the hydrolysis experiments were conducted under the optimal conditions of three enzymes. We get DH values and the amino acid compositions of the hydrolysates. Antioxidative activities of hydrolysates were assayed by measuring the reducing power， scavenging activities against DPPH free radical and hydrogen peroxide. The results showed that hydrolysates prepared with Alcalase had an excellent solubility， the highest DH and antioxidant activity， which was the optimal enzyme for A. subcrenata to produce the active ingredients.

Arca subcrenata Lischke；hydrolysates；antioxidant activity；protease

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.010

2013-10-03

李婷菲（1982—），女（漢），講師，主管藥師，碩士研究生，研究方向：海洋藥物開發(fā)。

*通信作者：葉斌（1980—），男，碩士研究生。