張小強，陳雪峰

（1.咸陽師范學(xué)院體育系，陜西咸陽712000；2.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021）

明膠抗氧化肽的分離、純化及其清除羥自由基活性的研究

張小強1，2，陳雪峰2

（1.咸陽師范學(xué)院體育系，陜西咸陽712000；2.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021）

為制備具有抗氧化活性的明膠肽，本實驗采用不同的酶水解明膠，并對酶解產(chǎn)物采用超濾技術(shù)分離，利用分光光度法檢測超濾后所得多肽組分對羥基自由基（·OH）的清除能力；進一步對抗氧化活性較強的組分利用葡聚糖SephadexC-25陽離子交換色譜、SephadexG-50凝膠過濾色譜和C18反向高效液相色譜進行分離、純化，并對其各組分清除·OH活性進行了研究，最后對所得洗脫組分中具有最強清除自由基活性的多肽組分的分析氨基酸組成，結(jié)果顯示：組分中甘氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸含量較高的肽具有較好的抗氧化活性，·OH清除率達到55.37%。

明膠抗氧化肽；羥自由基；抗氧化活性；純化

明膠是一種來自于膠原的非均勻肽類混合物，蛋白質(zhì)含量高達80%以上，高純度、低熱量的營養(yǎng)物質(zhì)。富含甘氨酸（37.38%）和脯氨酸（15.47%），非極性氨基酸含量合計占69.23%[1]，可廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，明膠活性肽比其它蛋白源肽具有更高的抗氧化活性和抗疲勞功效[2-6]。但是，這些研究只是對明膠酶解物進行了抗氧化活性的測定，并未對酶解產(chǎn)物進行分離、純化和氨基酸組成分析。本實驗采用不同酶水解明膠后對酶解產(chǎn)物進行超濾、葡聚糖Sephadex G-25凝膠柱層析等分離、純化，并對其各組分清除·OH活性進行了研究，對抗氧化活性最佳的肽段進行氨基酸組成分析，以期從分子量分布和氨基酸組成上對其抗氧化活性進行構(gòu)效研究，期望對明膠活性肽在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用提供一些實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級明膠：山東淄博寶恩生物科技有限公司饋贈；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶（Wolsen）；木瓜蛋白酶：北京奧博星生物科技有限公司；SP-Sephadex C-25陽離子交換樹脂和Sephadex G-50凝膠：購自Amersham Pharmacia公司。

Minimate TFFsystem型超濾機：英國PALL公司；Dionex高效液相色譜儀（配P680液相色譜泵，UVD170U檢測器，autoscience TMAT-330柱溫箱，Chromeleon6.0 software色譜工作站）：美國戴安公司；BS-224型電子天平（精度0.000 1 g）：德國Sartorius公司；835-50型氨基酸自動分析儀：日本日立制作所；PHS-3C型臺式PH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；可見紫外分光光度計Spectrum 752型：上海光譜儀器有限公司；高速離心機J-25I型：美國BECKMAN公司；LGJ-10型真空冷凍干燥機：鞏義予華實驗儀器有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 明膠肽的酶法制備

依據(jù)相關(guān)文獻[7-11]、酶結(jié)構(gòu)特點和pH分類，用緩沖液在80℃溶解明膠，然后在酶最適活力下水解明膠，具體工藝如表1，水解完成后80℃加熱15min滅酶，水解液用10%TCA除蛋白，高速冷凍離心機離心、過濾，澄清后取上清液備用。

表1 不同酶解明膠工藝條件Table1 Enzymatic gelatin process conditions

1.2.2 對羥自由基的清除能力測定

羥基自由基（OH·）是己知的機體內(nèi)存在壽命較長，對健康危害較大，氧化性最強的自由基，幾乎可以和所有大分子成分發(fā)生反應(yīng)。機體產(chǎn)生途徑和方式較多，除Fenton、Haberweiss反應(yīng)外，H2O2也可變?yōu)镺H·。體外檢測，能產(chǎn)生OH·的體系有Fenton反應(yīng)體系、還原性谷胱甘肽-H2O2體系、煙酰胺嘌呤磷酸二核甘酸-H2O2體系、鄰菲羅琳-抗壞血酸-H2O2體系、抗壞血酸-Cu2+體系等。1997年，金鳴等建立了以D536變化測定OH·氧化作用的比色測定方法。該方法主要依據(jù)OH·使鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+，使鄰二氮菲-Fe2+在536 nm處的最大吸收峰消失，根據(jù)536nm處吸光度變化判斷受試物清除OH·的活性，評估其抗氧化能力。

清除率I（%）=（A樣-A損）/（A未損-A損）×100

損傷管：取0.5mL 1mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液加入1mL 0.15mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）和0.5mL去離子水。充分混勻后加入0.5mL 0.75mmol/L的FeSO4，混勻后再加入0.5mL 0.01%（v/v）的H2O2，37℃水浴60min后在536 nm下測其吸光值A(chǔ)損。未損傷管：以0.5mL的去離子水代替H2O2重復(fù)上述操作，在536nm測其吸光值A(chǔ)未損。樣品管：以0.5mL的樣品取代等體積的去離子水重復(fù)上述操作，在536 nm測其吸光值A(chǔ)樣。清除率越大抗氧化活性越強。

1.2.3 明膠抗氧化肽穩(wěn)定性的測定

活性肽體內(nèi)外生理活性往往存在差異，為了檢驗胃腸道消化酶對制備的明膠肽抗氧化活性的影響，采用體外模擬消化過程分析活性肽在機體的穩(wěn)定性，參考朱振寶的研究方法[12]用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)酶解物溶液的pH在2.4，按照5%的濃度加入胃蛋白酶，在37℃條件水浴下攪拌器輔助反應(yīng)3 h，80℃滅酶15min。隨后調(diào)節(jié)pH在8.2，加入5%的胰蛋白酶，37℃水浴條件下攪拌器輔助反應(yīng)3 h，80℃滅酶15min，用HCl和NaOH將酶解液調(diào)節(jié)至pH 7.0，冷卻至室溫，離心取上清液測定其羥自由基清除率，并與模擬前的抗氧化活性比較，檢測明膠肽的穩(wěn)定性。

1.2.4 明膠抗氧化肽的超濾分離

參考劉成梅[13]和朱夕波[14]的研究技術(shù)，在處理壓力為30Psi，膜滲透通量為8.0LHM，滲透增量為0.10g/min，膜效能為3.0g/m2·min的超率操作條件下，分別用＜10K，10 K～20 K，20 K～50 K，50 K～100 K，＞100 K的超濾膜分離制備酶解液濃度為2%的明膠酶解液，并檢測不同組分的OH·清除率。

1.2.5 明膠抗氧化肽的色譜分離與純化

在超率篩選的基礎(chǔ)上，取明膠酶解產(chǎn)物用pH4.0、20mmol的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋到相同pH后先進行SephadexG-25柱層析，色譜條件：親和層析柱（1.0 cm×20 cm），先用0.45μm微孔濾膜過濾明膠酶解液，再用0.02mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）進行充分平衡。自動上樣，上樣濃度為15mg/mL，上樣量200μL，待未結(jié)合多肽洗脫后，分別用NaCl濃度為0.01、0.05、0.1mol/L和0.5mol/L的0.02mol/L、pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液進行梯度洗脫。流速為1.5mL/min，收集出現(xiàn)活性肽峰的洗脫液，每管10min，225 nm檢測，并分析不同組分清除OH·活性。進一步將親和層析篩選的明膠酶解物樣品溶解在少量的雙蒸水中，進行Sephadex G-75柱層析，色譜條件：凝膠色譜柱Sephadex G-50（1.6 cm×100 cm），先用去離子水平衡。自動上樣后再用去離子水進行洗脫，直至所有肽被洗脫出來。進樣濃度為5mg/mL，進樣量10μL，流速為0.5mL/min，分別收集生理活性肽洗脫峰，每管20min，225 nm檢測，并測定其OH·清除率。最后將凝膠層析制備的樣品采用RP-HPLC進行進一步分離、純化檢測，色譜條件：C18反相色譜柱（4.6mm×250mm），檢測波長225 nm，流動相：A液，0.1%TFA；B液，0.1%TFA+100%CH3CN，利用體積分數(shù)為5%～100%的乙腈進行梯度洗脫，流速1.0mL/min。

1.2.6 氨基酸組分分析

經(jīng)上述分離、純化制備的抗氧化活性肽組分，用6mol/L的HCl在115℃下完全水解24 h。將水解液全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸干，用0.1mol/L的HCl溶解并調(diào)節(jié)氨基酸濃度在0.4 nmol/L～10 nmol/L。采用氨酸酸自動分析儀進行氨基酸組成分析。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 明膠不同酶解物清除OH·功效和穩(wěn)定性的比較

明膠活性肽的最終功效必須經(jīng)過人體試用才能實現(xiàn)真正的應(yīng)用。目前的研究表明，生理活性肽在體外和體內(nèi)、動物實驗和人體間表現(xiàn)出不同的活性。體內(nèi)和體外的活性差異主要表現(xiàn)在兩方面：一是在體外有很高的活性，但在體內(nèi)卻功效一般。原因可能是生理活性肽經(jīng)口服后，被消化道存在的酶進一步降解，導(dǎo)致多肽結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或者胃腸道的pH、溫度、其他物質(zhì)的存在等不利于其活性的發(fā)揮，從而使生理功效降低；另一種情況是體外活性很低的肽進入機體后表現(xiàn)出很強的活性，可能的原因是活性肽被攝入體內(nèi)后經(jīng)胃腸道的消化酶進一步將服用的活性肽降解成了功效更顯著的短肽，也可能是胃腸道的環(huán)境更適合其活性的發(fā)揮，也可能其特殊的從鏈結(jié)構(gòu)自我保護不容易再被進一步水解等?？傊瑸榱藱z測活性肽在體內(nèi)功效的穩(wěn)定性，實驗室經(jīng)常采用通過體外模擬腸胃道系統(tǒng)消化過程的方法分析，由于胃蛋臼酶、胰酶復(fù)合酶水解模式最接近人體自然生理消化過程，所以采用此模式檢測制備的抗氧化明膠多肽在體內(nèi)消化的穩(wěn)定性。

利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解明膠制備的活性肽對OH·清除率初試分別為：93%、71%、73%、61%。模擬體內(nèi)消化后上述酶解物OH·清除率分別為91.88%、43.57%、35.14%、29.29%。由此可知，經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬體內(nèi)消化后的明膠抗氧化多肽清除活性，中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解明膠產(chǎn)物都有所下降，存在統(tǒng)計學(xué)差異，而清除·OH的活性比較穩(wěn)定，因此確定采用胰蛋白酶水解明膠，利用·OH清除率分析其抗氧化活性。

2.2 明膠抗氧化肽超濾分離不同組分OH·清除率的結(jié)果與分析

國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，明膠肽具有抗氧化活性，而且抗氧化能力強弱與活性肽分子量大小有關(guān)。明膠酶解物是多種肽等的不均一混合物，生理活性肽的分子量分布范圍比較大，為了確定抗氧化能力最強的明膠肽分子量大小和抗氧化功效，首先利用超濾技術(shù)對制備的明膠肽進行了初步分離，并檢測了不同組分的OH·清除率，結(jié)果如表2。

表2 超濾對明膠多肽分子量分布（%）及OH·清除率的影響Table2 OH·radical scavenging activities of geltain peptides with different MW s

由各組分清除·OH自由基能力（表2）可知，明膠肽的抗氧化活性與其分子量大小密切相關(guān)，分子量越低活性肽抗氧化活性越強，分子量小于10K的短肽抗氧化活性尤為明顯。因此篩選分子量小于10K的組分作為進一步分離的樣品。

2.3 明膠抗氧化肽色譜分離不同組分OH·清除率的結(jié)果與分析

從明膠酶解產(chǎn)物中制備的抗氧化多肽，通過超濾初步分離后，經(jīng)強陽離子交換色譜SP-Sephadex C-25，Sephadex G-50凝膠過濾和C18高效液相色譜等分離、純化步驟，最終得到了兩個不同的多肽組分，不同階段各個不同組分均具有較強的抗氧化活性，明膠活性肽分離結(jié)果如圖1～圖3所示。

圖1 明膠水解產(chǎn)物的SP-Sephadex C-25離子交換色譜圖Fig.1 Elution profile of gelatin hydrolysate on SP-Sephadex C-25 column

圖2 明膠的Sephadex G-50凝膠過濾色譜圖Fig.2 Elution profile of gelatin on Sephadex G-50 column

圖3 明膠的C18反相高效液相色譜圖Fig.3 Elution profile of fraction gelatin on C18HPLC column

①將超濾分離篩選的分子量小于10 K的組分上陽離子交換色譜純化，收集得到組分1～5，他們對OH·清除率分別為：25.7%、43.57%、39.25%、32.74%、47.53%。其中組分2和5清除活性較高，結(jié)合酶解物濃度（組分2濃度為0.02mol/L，組分5濃度為0.4mol/L），篩選組分2為進一步分離的樣品。②將陽離子交換色譜分離收集的組分2濃縮后上到Sephadex G-50凝膠過濾層析色譜柱上，225 nm測量吸光值，結(jié)果如圖2所示。檢測各個不同組分的OH·清除率，在相同的濃度下清除率分別為：47.83%、48.32%、49.15%、49.02%和55.37%，其中組分5抗氧化活性最強，篩選為下一步分離的樣品。③應(yīng)用C18反相柱對凝膠過濾層析制備的具有較強抗氧化活性的肽段進行分離，獲得兩個組分，結(jié)果如圖3所示。兩個組分的高分辨率RPHPLC圖譜均呈現(xiàn)單一主峰，無拖尾和重疊，因此可以認定收集肽段組成比較單一，純度較高，作為分析樣品繼續(xù)進行氨基酸組成分析。④多肽的抗氧化活性與其氨基酸組成和種類有關(guān)，目前的研究發(fā)現(xiàn)某些單一的氨基酸Phe和Glu[1]、Gly和Asp[16]、His和Lys[17]也有某些抗氧化活性，但其活性遠遠低于由其所組成的抗氧化肽，即肽的活性遠遠大于其氨基酸的活性，可能的原因在于肽鏈內(nèi)氨基酸間的短程相互作用，組成活性中心、構(gòu)建了“空穴”，增強了其與自由基的接觸，降低了環(huán)境的影響[18]。Boli[19]的實驗證實：Met、Tyr、Phe和His是四種有自由基清除效果的關(guān)鍵氨基酸，多肽中以上四種氨基酸含量較多時抗氧化活性較強。本研究利用氨基酸分析儀測定篩選的兩個組分的氨基酸組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組分1每100毫克樣品中含有氨基酸較多的分別為Gly（102.77ng）、Glu（47.69ng）、Phe（39.82ng）、Asp（26.18 ng）、His（13.56 ng）和Lys（13.26 ng）；組分2的主要組成氨基酸為Gly（524.77 ng）、Glu（524.32 ng）、Lys（324.39 ng）、Phe（183.11 ng）、His（62.36 ng）和Met（48.77 ng）。這個結(jié)果和現(xiàn)有的研究結(jié)果比較一致，另外，除了氨基酸種類、數(shù)量影響生理活性肽的抗氧化功效外，活性肽中氨基酸的排列順序也可能決定著功能肽的抗氧化性能，有必要對篩選的組分測定氨基酸順序，進一步從構(gòu)效關(guān)系研究其在體內(nèi)的抗氧化作用機制和分子機理。

3 結(jié)論

應(yīng)用不同酶水解明膠，利用OH·清除率評估抗氧化功效，采用超濾、Sephadex C-25、Sephadex G-50、C18色譜等技術(shù)逐步篩選明膠酶解產(chǎn)物對其進行分離，并對每個分離階段收集制備的不個組分進行羥自由基清除活性測定，最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)：組分中甘氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等含量較高的肽具有較好的抗氧化活性，OH·清除率在濃度為2%時達到55.37%，預(yù)示明膠肽可以作為一種良好的抗氧化劑在食品中應(yīng)用。

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Study of Scavenging Effecton on OH Radical，Separation and Purification of Gelatin Antioxidant Peptides

ZHANG Xiao-qiang1，2，CHEN Xue-feng2
（1.Depertment of P.E.Xianyang Normal University，Xianyang 712000，Shaanxi，China；2.College of life﹠Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xiˊan 710021，Shaanxi，China）

We used four different kinds of commercial protease to hydrolyze gelatin，and measure the antioxidant activity of hydrolysate such as their abilities to scanvage OH·radicals.Peptides derived from geltain was separated by ultra-filtration technology.The result showed that the trypsin hydrolysate had the best antioxidant activity.Furthermore，we used SP-Sephadex C-25 cation exchange chromatography and Sephadex G-50 gel filtration chromatography to separate the trypsin hydrolysate and get an elution peak part with strong activities of scanvaging OH·radicals.The result of experiment indicates that the OH·scavenging rate of the hydrolyzate was up to55.37%.They contained the key amino acid for the antioxidation，such as Glu，Met，Phe，Lys et al.

gelatin polypeptide；OH·；antioxidant；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.003

2013-04-11

咸陽師范學(xué)院專項科研基金重點項目（13XSYKY065）

張小強（1970—），男（漢），工程師，博士，研究方向：食品功能因子和作用機理。