魏立曉，趙建邦，劉蘭生

內(nèi)消瘰癘丸(濃縮丸)，由夏枯草、玄參、大青鹽、海藻、浙貝母、薄荷、天花粉、哈殼(煅)、白蘞、連翹、熟大黃、甘草、地黃、桔梗、枳殼、當(dāng)歸、玄明粉制成。原標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)收載有熊果酸對(duì)照品、玄參對(duì)照藥材、大黃對(duì)照藥材、甘草對(duì)照藥材、當(dāng)歸對(duì)照藥材、橙皮苷對(duì)照品的薄層色譜鑒別，含量測(cè)定項(xiàng)采用薄層掃描法測(cè)定夏枯草中熊果酸的含量。為了更有效地控制該藥的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)薄荷、連翹進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定夏枯草中迷迭香酸的含量和玄參中哈巴俄苷的含量。

1 儀器與試藥

日本島津LC-2010A高效液相色譜儀，DikmaC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

哈巴俄苷對(duì)照品(批號(hào)111173-200604)、薄荷對(duì)照藥材(批號(hào)120916-200508)、薄荷腦對(duì)照品(批號(hào)110729-200506)、連翹對(duì)照藥材(批號(hào)120908-200613)、連翹苷對(duì)照品(批號(hào)110821-200711)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。迷迭香酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)111871-201202)。內(nèi)消瘰癘丸(濃縮丸)采用2家企業(yè)的6批樣品(蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號(hào)12C9-1、12C9-2、12C9-3;蘭州太寶制藥有限公司，批號(hào)73110510、73110524、73110603)實(shí)驗(yàn)。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 薄荷的薄層鑒別 取本品粉末10 g，加石油醚(60～90℃)20 mL，密塞，振搖數(shù)分鐘，放置30 min，濾過，藥渣備用，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液［1］。另取薄荷對(duì)照藥材0.5 g，加石油醚(60～90℃)5 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取薄荷腦對(duì)照品，加石油醚(60～90℃)制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例及制備工藝，配制不含薄荷的陰性對(duì)照品，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法［2010版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)附錄ⅥB］實(shí)驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液5 μL及對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液-乙醇(1∶4)的混合溶液，在100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［2］。見圖1。

圖1 薄荷的薄層鑒別(日光下)

2.1.2 連翹的薄層鑒別 取本品粉末10 g，加石油醚(60～90℃)20 mL，密塞，振搖數(shù)分鐘，放置30 min，濾過;藥渣揮盡石油醚后加甲醇20 mL，密塞，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。再取連翹對(duì)照藥材1 g，同法處理，作為對(duì)照藥材溶液。另取連翹苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例及制備工藝，配制不含連翹的陰性對(duì)照品，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法［2010版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)附錄ⅥB］實(shí)驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液10 μL、對(duì)照藥材溶液10 μL、供試品溶液 5 μL、陰性對(duì)照液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(8∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［3-4］。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜和對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖2。

圖2 連翹的薄層鑒別(日光下)

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 夏枯草的含量測(cè)定

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱DikmaC18(4.6 mm×250 mm，5 μm);以甲醇-0.1%磷酸(35∶65)為流動(dòng)相，峰形及保留時(shí)間均比較理想;檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm;柱溫 30 ℃;流速 1 mL/min;進(jìn)樣量各 10 μL［5-7］。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，精密加稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量;超聲處理(功率180 W、頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量;用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得［8］。

2.2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸對(duì)照品適量，精密加入稀乙醇，制成含迷迭香酸19.67 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含夏枯草的陰性對(duì)照樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.1.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液，分別按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，樣品與對(duì)照品在同一保留時(shí)間有相同的波峰出現(xiàn)，而空白溶液則無相應(yīng)的波峰(圖3)。

圖3 內(nèi)消瘰癘丸中迷迭香酸高效液相色譜圖

2.2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取上述迷迭香酸對(duì)照品溶液 2、4、6、8、10、12、14 μL，按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程:Y=3.560 922 9×10－7X－0.000 376 297，r=0.999 98，迷迭香酸在0.039 34～0.275 38 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.1.7 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取迷迭香酸對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，各進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分平均值為548 398.4，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.49%。表明精密度良好。

2.2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)12C9-1)，分別在 0、2、4、6、8 h，按上述色譜條件各進(jìn)樣1次，每次10 μL，測(cè)定峰面積積分平均值為280 451.2，RSD為0.77%。

2.2.1.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精取同一批供試品(批號(hào)12C9-1)6份，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，迷迭香酸含量平均值為0.451 88 mg/g，RSD為0.78%。

2.2.1.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精取6份(批號(hào)12C9-1)已知含量的供試品，精加迷迭香酸對(duì)照品，按上述供試品溶液制備和色譜條件測(cè)定含量，平均回收率98.33%，RSD為2.27%(表1)。

表1 迷迭香酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 1樣品測(cè)定 精取6批不同廠家的樣品，按上述供試品溶液制備和色譜條件測(cè)定含量，6批樣品 12C9-1、12C9-2、12C9-3、73110510、73110524、73110603 迷迭香酸含量分別為0.450 4、0.456 6、0.466 4、0.422 7、0.360 5、0.375 4 mg/g，均值為0.422 0 mg/g。

2.2.2 玄參的含量測(cè)定

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱DikmaC18(4.6 mm×250 mm，5 μm);以乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相，峰形及保留時(shí)間均比較理想;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;柱溫30℃;流速 1 mL/min;進(jìn)樣量各 10 μL［9-12］

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸漬30 min;超聲處理(功率180 W、頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量;用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得［10-12］。

2.2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取哈巴俄苷對(duì)照品適量，精密加入80%甲醇，制成含哈巴俄苷15.04 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含玄參的陰性對(duì)照樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.2.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液，分別按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，樣品與對(duì)照品在同一保留時(shí)間有相同的波峰出現(xiàn)，而空白溶液則無相應(yīng)的波峰。樣品、對(duì)照品、陰性對(duì)照高效液相色譜圖見圖4。

圖4 內(nèi)消瘰癘丸中哈巴俄苷高效液相色譜圖

2.2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取上述哈巴俄苷對(duì)照品溶液 4、6、8、10、12、14、16 μL，按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程:Y=4.384 076×10－7X－0.000 522 333 4，r=0.999 87，哈巴俄苷在0.060 16～0.240 64 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取哈巴俄苷酸對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，各進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分平均值為342 483，RSD為0.42%。

2.2.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)12C9-1)，分別在 0、2、4、6、8 h，按上述色譜條件各進(jìn)樣1次，每次10 μL，測(cè)定峰面積積分平均值為243 265，RSD為1.44%。

2.2.2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品6份(批號(hào)12C9-1)，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，哈巴俄苷含量平均值為0.266 82 mg/g，RSD為1.43%。

2.2.2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精取6份(批號(hào)12C9-1)已知含量的供試品，精加哈巴俄苷對(duì)照品，按上述供試品溶液制備和色譜條件測(cè)定含量，平均回收率98.26%，RSD為2.17%(表2)。

表2 哈巴俄苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.2.2.11 樣品測(cè)定 精取6批不同廠家的樣品，按上述供試品溶液制備和色譜條件測(cè)定含量，6批樣品 12C9-1、12C9-2、12C9-3、73110510、73110524、73110603 哈巴俄苷含量分別為0.266 3、0.272 5、0.278 1、0.169 8、0.169 5、0.157 7 mg/g，均值為0.219 0 mg/g。

3 討論

薄荷薄層色譜法鑒別參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)薄荷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別(3)項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)［1］263，結(jié)合本品的特性擬定如上述方法。

連翹薄層色譜法鑒別參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)連翹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別(2)項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)［1］159，以石油醚(30～60 ℃)提取，提取效果不佳，斑點(diǎn)不明顯，結(jié)合本品的特性采用石油醚(60～90℃)，薄層色譜斑點(diǎn)清晰。

實(shí)驗(yàn)前對(duì)本品夏枯草中迷迭香酸成分的提取方法進(jìn)行研究，分別考察了提取時(shí)間、提取溶劑和提取方式(超聲提取和加熱回流提取)，最終確定用稀乙醇超聲30 min效果最好。對(duì)本品玄參中哈巴俄苷的提取方法也進(jìn)行了同樣的研究，最終確定80%甲醇浸漬30 min后超聲30 min效果最佳。

原標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)采用薄層掃描法測(cè)定夏枯草中熊果酸的含量，中藥材如山楂、熊果、車前、女貞子等藥材都含有該成分［13］，含量檢測(cè)專屬性差，故建立新的方法檢測(cè)夏枯草中迷迭香酸的含量。玄參是內(nèi)消瘰疬丸(濃縮丸)中的重要藥味之一，玄參中已分離出化學(xué)成分有50多種，主要含有環(huán)烯醚萜、苯丙素苷、有機(jī)酸及揮發(fā)油等［14］。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定環(huán)烯醚萜類成分中的哈巴俄苷，有利于提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

現(xiàn)僅參考對(duì)6批實(shí)際樣品測(cè)定的結(jié)果，并考慮不同夏枯草原料中迷迭香酸含量的差異、大生產(chǎn)過程的損失、制劑中提取轉(zhuǎn)移的因素及實(shí)際操作過程的誤差，將其下浮至70%。限度暫定為本品每1 g含迷迭香酸(C18H16O8)不得少于0.30 mg。考慮不同玄參原料中哈巴俄苷含量的差異、大生產(chǎn)過程的損失、制劑中提取轉(zhuǎn)移的因素及實(shí)際操作過程的誤差，將其下浮至70%。限度暫定為本品每1 g含哈巴俄苷(C24H30O11)不得少于0.15 mg。

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