黃 璜 李宗軍 侯愛香

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，長沙 410128）

（食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室2，長沙 410128）

脂肪酶（Lipase E.C.3.1.1.3）是一類特殊的酯酶，能水解三酰甘油酯為脂肪酸、二酸甘油酯、單酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的長鏈脂肪酸酰基酯，特點是在油水界面起催化作用。在糧油食品工業(yè)中，脂肪酶可催化酯交換、水解、醇解等反應(yīng)，利用Sn1，3-位定向脂肪酶催化油脂進(jìn)行定向酯交換，將廉價的油脂通過改性生產(chǎn)高利用價值的油脂，目前國內(nèi)外研究最多的是生產(chǎn)類可可脂、人造黃油、起酥油等。在功能性結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工業(yè)方面，利用酶法將具有不同營養(yǎng)和生理功能的脂肪酸結(jié)合到甘油骨架的特殊位置，形成特定分子結(jié)構(gòu)的三?；视王ナ悄壳皣鴥?nèi)外研究熱點。

我國是世界上最大的棉籽油加工國，據(jù)統(tǒng)計，近幾年我國的棉籽壓榨量在1 000萬t左右，在國產(chǎn)油料作物中，棉籽壓榨量僅次于油菜籽和花生，位居第3位，棉籽油是一種重要的食用植物油。棉籽油中含有大量的人體必需脂肪酸，最宜與動物脂肪混合食用，其不飽和脂肪酸油酸和亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占70%～80%，其中含量最多的多不飽和脂肪酸亞油酸占46%～60%，能有效抑制血液中膽固醇上升，維護(hù)人體的健康。棉籽油最大的缺點是脂肪酸凝固點較高，低溫貯存時會有高熔點的固體酯從油中析出，造成流動性差，不易儲藏，從而影響了外觀和食用性能。

棉籽油分提產(chǎn)物，是棉籽油在冬化即結(jié)晶分提工藝中，油在低溫下養(yǎng)晶一段時間之后過濾，油通過帆布包裹的板式過濾機或箱式過濾機，剩余的低溫下引起油變渾濁且黏稠的高熔點的固體脂肪。這些固脂既可以是少量的高熔點甘油酯也可以是蠟質(zhì)，占棉籽油量的20%～25%。

由于目前國內(nèi)棉籽產(chǎn)業(yè)鏈較短，絕大部分企業(yè)沒有對副產(chǎn)品進(jìn)行深加工就直接投入需求使用。以致造成棉籽油分提產(chǎn)物的浪費，本試驗以棉籽油分提產(chǎn)物和中碳鏈脂肪酸（辛酸）為底物，采用Sn1，3-位定向的固定化脂肪酶作為催化劑，進(jìn)行酶催化酸解反應(yīng)，制備富含亞油酸和辛酸的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，合成的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)產(chǎn)物中辛酸主要位于甘油Sn-1，3位，而亞油酸、油酸主要位于甘油骨架Sn-2位。該結(jié)構(gòu)脂質(zhì)在保留傳統(tǒng)棉籽油的物理特性和使用功能基礎(chǔ)上，降低了高熔點的甘油酯含量，改善了棉籽油分提產(chǎn)物的脂肪酸組成，增加了具有一定功能的中碳鏈脂肪酸辛酸，又不破壞原有的不飽和脂肪酸亞油酸和油酸的含量，而且最大限度的發(fā)揮了亞油酸和油酸的功效，添加的辛酸又具有熱量低、功能速度快、降血脂、和減少脂肪在體力堆積的功效，且充分利用了棉籽油分提產(chǎn)物，使其變廢為寶，擴(kuò)大了油脂用途，提高棉籽油的使用價值和經(jīng)濟(jì)價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棉籽油分提產(chǎn)物：湖南盈成油脂工業(yè)有限公司辛酸（分析純99%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；固定化脂肪酶 Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozyme 435：諾維信生物技術(shù)有限公司。

GC-4000A氣相色譜儀：北京東西分析儀器有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；TDL80-2B臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-（111）循環(huán)水真空泵：天津華鑫儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶促酸解反應(yīng)

稱取2 g棉籽油分提產(chǎn)物于50 mL具塞三角瓶中，按照一定底物比（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比）加入辛酸，加入固定化脂肪酶（底物量計），混勻，蓋緊塞子，置于水浴恒溫振蕩器中，設(shè)置一定反應(yīng)溫度，調(diào)整振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)一定時間，終止反應(yīng)，得到混合產(chǎn)物。

1.2.2 產(chǎn)物分離純化

將上述混合產(chǎn)物于離心機中離心去除脂肪酶，取上層液溶于15 mL正己烷中，滴2～3滴酚酞指示劑，用1 mol／L堿滴定至微紅，劇烈搖晃，靜置分離出正己烷層，并于水相中加入10 mL正己烷再次萃取，合并正己烷層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中70℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。

1.2.3 脂肪酶穩(wěn)定性研究

將每次反應(yīng)的固定化脂肪酶，通過過濾將酶與產(chǎn)物分離并回收，用石油醚（沸程30～60℃）洗滌2次，室溫下吹干，然后進(jìn)行循環(huán)使用，以考察脂肪酶的穩(wěn)定性。

1.2.4 結(jié)構(gòu)脂質(zhì)分析

取50 mg結(jié)構(gòu)脂質(zhì)于10 mL容量瓶中，加入2 mL石油醚∶苯（1∶1），待油脂完全溶解后加入1 mL KOH-甲醇溶液，劇烈振蕩1 min，并常溫下放置30 min，使充分甲酯化，用蒸餾水定容，靜置分層，取上層清液10 uL于氣相色譜中測定脂肪酸組成及含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 ?；w選擇

中鏈脂肪酸酯（MCT）即含有中鏈脂肪酸（MCFA）的脂質(zhì)在胃腸中水解速度快，可直接從門靜脈吸收，且不需要肉堿就能直接進(jìn)入線粒體氧化分解，因此具有代謝易、功能快、熱值低，同時還有氧化穩(wěn)定性強、熔點低、改善人體代謝條件等特殊功能，還對某些疾病有一定的治療作用。目前國內(nèi)外研究較多的MCFA有八碳和十碳脂肪酸——辛酸和癸酸，本試驗選用辛酸作為?；w。

2.2 脫酸堿液選擇

脂肪酶作用于三酰甘油，使Sn1，3-位長鏈脂肪酸斷裂，游離于油相中，加之底物中含有過量的辛酸，使得離心去酶后的混合產(chǎn)物中游離脂肪酸含量較高，為了脫去游離脂肪酸，防止油酸敗，工業(yè)中常用堿液中和脫酸，產(chǎn)生的游離脂肪酸鹽與油脂分層后去除，得到結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。萬銀松［1］在對菜籽油進(jìn)行酶催化制取結(jié)構(gòu)脂質(zhì)研究中使用0.96 mol／L的KOH溶液滴定中和游離脂肪酸。王瑛瑤等［2］在對菜籽油酶催化改性反應(yīng)體系中使用8 mol／L的KOH-乙醇水溶液（30∶70）中和游離脂肪酸。工業(yè)生產(chǎn)中常用一定濃度的NaOH進(jìn)行堿煉脫酸。本試驗分別對1 mol／L的 KOH水溶液、KOH-乙醇水溶液、NaOH-乙醇水溶液（V乙醇∶V水＝30∶70，乙醇為99.5%分析純）3種堿液中和游離脂肪酸的能力進(jìn)行了比較。結(jié)果見表1。

表1 3種不同堿液中和游離脂肪酸能力的比較

由表1可看出，KOH-乙醇水溶液進(jìn)行滴定分層時間最快，且為液液分層，容易分離出上層油脂。原因在于：1）KOH相比NaOH堿性強，與酸中和速度快且分層明顯；2）NaOH具有很強的吸水性和潮解性，放置一定時間后有少量的白色物析出，工業(yè)中常用NaOH是因為其價格低廉，經(jīng)濟(jì)實惠；3）乙醇是一種很好的溶劑，在油脂的相關(guān)反應(yīng)中，加入乙醇既能溶解KOH，又能溶解油脂，讓它們在均相中充分接觸，增大接觸面積，加快反應(yīng)速率，提高反應(yīng)效率，用乙醇水溶液滴定中和后，上層正己烷層與下層脂肪酸鹽層分離快且明顯。因此，比較3種堿液，KOH-乙醇水溶液脫酸效果最好。

2.3 脂肪酶篩選

不同來源的脂肪酶具有不同的催化特性，如催化活力、作用三酰甘油位置專一性、酶穩(wěn)定性等。在酶催化油脂改性反應(yīng)體系中，脂肪酶對產(chǎn)物的合成率、脂肪酸在三酰甘油中的分布情況起著決定性作用［3］。為了得到最佳的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，篩選最適合棉籽油分提產(chǎn)物酶法改性的脂肪酶，對棉籽油分提產(chǎn)物三酰甘油Sn1，3-位作用特異性最強的脂肪酶，本試驗選用了3種脂肪酶，對其催化特異性及催化效果進(jìn)行研究對比。

2.3.1 不同酶添加量下3種脂肪酶催化能力比較

取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例2∶1（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比），Lipozyme RM IM，Lipozyme TL IM，Novozyme 435這3種脂肪酶添加量2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，于水浴恒溫振蕩器中，反應(yīng)溫度60℃，振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)時間4 h。得到不同酶添加量下3種脂肪酶催化制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量變化曲線如圖1所示。

圖1 不同酶添加量下3種脂肪酶催化能力比較

由圖1可以看出，3種脂肪酶都能催化底物酸解反應(yīng)，但是效果差別較顯著，隨著酶添加量的增多，辛酸含量不斷增加，且當(dāng)酶添加量達(dá)到10%時，辛酸含量幾乎沒有變化。3種脂肪酶相比較，Lipozyme RM IM脂肪酶催化效果最好（辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)25.62%），明顯高于另外2種脂肪酶，其次是Novozyme 435脂肪酶（辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)9.98%），催化效果最差的是Lipozyme TL IM脂肪酶（辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高僅為2.58%），Lipozyme TL IM脂肪酶添加量2%和4%時對底物幾乎沒有催化能力，可能是60℃下Lipozyme TL IM脂肪酶活性受影響?？傊诓煌柑砑恿織l件下，3種脂肪酶中，Lipozyme RM IM脂肪酶催化棉籽油分提產(chǎn)物制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量最高。

2.3.2 不同溫度下3種脂肪酶催化能力比較

取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例2∶1（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比），Lipozyme RM IM，Lipozyme TL IM，Novozyme 435這3種脂肪酶添加量8%，于水浴恒溫振蕩器中，分別設(shè)反應(yīng)溫度為40、50、60、70、80℃，振蕩速率為 100 r／min，反應(yīng)時間4 h。得到不同反應(yīng)溫度下3種脂肪酶催化制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量變化曲線如圖2所示。

圖2 不同反應(yīng)溫度下3種脂肪酶催化能力比較

由圖2可看出，在不同溫度條件下，Lipozyme RM IM和Novozyme 435脂肪酶都能較好的催化底物的酸解反應(yīng)，而Lipozyme TL IM脂肪酶則催化活性很低。不同的反應(yīng)溫度下3種脂肪酶的催化活性的變化趨勢不同，Lipozyme RM IM催化活性隨著溫度升高而加強，到60℃時催化活性達(dá)到最大，隨后活性逐漸減弱。Novozyme 435催化活性50℃之前變化不大，50℃之后隨著溫度升高，催化活性不斷增強。Lipozyme TL IM催化活性很低，但也存在變化趨勢，隨著溫度的升高，其催化活性不斷減弱?？傊?種脂肪酶相比，Lipozyme RM IM在不同反應(yīng)溫度下催化活性最強。

基于2個條件下3種脂肪酶催化能力的比較，Lipozyme RM IM脂肪酶催化棉籽油分提產(chǎn)物形成的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸的含量最高。因此選用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM作為催化劑進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.4 溶劑體系選擇

脂肪酶在油脂改性中所應(yīng)用的反應(yīng)體系主要有4類，分別為有機相中的酶催化反應(yīng)、微水條件下的無溶劑體系、微乳液體系和炒臨界流體［4］。目前在有關(guān)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)制取的文獻(xiàn)報道中，應(yīng)用最多的是無溶劑體系和含微量水分的有機溶劑體系。本試驗采用2種最常用的反應(yīng)體系——無溶劑體系和正己烷體系，比較2種體系下脂肪酶的催化能力。取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例2∶1（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比），加入10 mL正己烷，Lipozyme RM IM脂肪酶添加量 2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，于水浴恒溫振蕩器中，反應(yīng)溫度60℃，振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)時間4 h。不添加正己烷重復(fù)上述試驗。得到不同反應(yīng)體系下制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量變化曲線如圖3所示。

圖3 2種溶劑體系下脂肪酶催化能力比較

由圖3可以看出，2種反應(yīng)體系下，隨著酶添加量的增多，辛酸含量呈上升趨勢，當(dāng)酶量達(dá)到10%時，隨著酶量繼續(xù)加大，辛酸含量變化不明顯。在酶添加量為2%時，兩體系中辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差10%，隨著酶量的加大，兩體系中辛酸含量逐漸接近，當(dāng)達(dá)到12%時相差僅為2%，差別并不大。因此，雖然正己烷體系下酶催化能力略高于無溶劑體系，但由于正己烷的有毒性、易燃性等性質(zhì)，和有機溶劑使用引起生產(chǎn)成本的增加使得有機溶劑不建議使用于食用油生產(chǎn)當(dāng)中，且由圖3看出無溶劑體系下脂肪酶的催化效果也很明顯。

無溶劑體系中，脂肪酶直接作用于反應(yīng)底物，具有較多優(yōu)點：提高了反應(yīng)底物濃度和產(chǎn)物濃度；反應(yīng)速度快；產(chǎn)物得率高；反應(yīng)體積??；減少了產(chǎn)物分離提純的步驟，使更容易純化；因不用或用少量的有機溶劑而大大降低了對環(huán)境的污染，降低了回收有機溶劑的成本，減少了溶劑殘留對人體造成的影響；為反應(yīng)提供了與傳統(tǒng)溶劑不同的新的分子環(huán)境，有可能使反應(yīng)的選擇性、轉(zhuǎn)化率得到提高［5］。因此，無溶劑體系是個極具潛力的反應(yīng)技術(shù)，本試驗采用無溶劑體系進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.5 影響辛酸合成率的單因素試驗

2.5.1 反應(yīng)溫度對辛酸合成率的影響

Xu等［6-7］的研究表明，在 Lipozyme RM IM催化菜籽油與辛酸合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)反應(yīng)體系中，隨著反應(yīng)溫度升高，酯交換程度和反應(yīng)速度均提高，同時還可使?；灰品磻?yīng)的程度和速度都隨之增加，在50～70℃內(nèi)?；l(fā)生位移呈直線增加趨勢。本試驗取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例2∶1（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比），Lipozyme RM IM脂肪酶添加量8%，于水浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)時間4 h，反應(yīng)溫度分別為40、50、60、70、80℃。得到不同反應(yīng)溫度下制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量變化曲線如圖4所示。

圖4 反應(yīng)溫度對辛酸合成率的影響

由圖4可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增加，結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的辛酸含量不斷上升，在60℃時辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，為22.45%。當(dāng)反應(yīng)溫度超過60℃時，辛酸含量有所下降，可能是因為過高的溫度導(dǎo)致脂肪酶酶活性下降，從而影響辛酸的合成。因此，在本試驗初步確定最適宜的反應(yīng)溫度為60℃。

2.5.2 反應(yīng)時間對辛酸合成率的影響

取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例2∶1（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比），Lipozyme RM IM脂肪酶添加量8%，于水浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)溫度 60℃，反應(yīng)時間分別為 2、4、6、8、10 h，得到不同反應(yīng)時間下制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量變化曲線如圖5所示。

圖5 反應(yīng)時間對辛酸合成率的影響

由圖5可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，制取結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量逐漸增大，脂肪酶與底物接觸得越充分，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到6 h時，辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大，為30.97%，當(dāng)反應(yīng)時間大于6 h，辛酸含量開始不斷降低。時間延長將導(dǎo)致各種程度酰基位移的發(fā)生，導(dǎo)致大量副產(chǎn)物的生成，因而對目標(biāo)產(chǎn)物中辛酸合成造成很大影響［8］。因此，本試驗初步確定最適宜的反應(yīng)時間為6 h。

2.5.3 酶添加量對辛酸合成率的影響

取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例2∶1（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比），Lipozyme RM IM脂肪酶添加量分別為 2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，于水浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間為4 h，得到不同酶添加量下制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量變化曲線如圖6所示。

圖6 酶添加量對辛酸合成率的影響

由圖6可以看出，隨著脂肪酶添加量的增多，結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量逐漸增加，酶量為2%～10%時，辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加明顯，從10.88%上升到23.77%，提高了13%。當(dāng)酶添加量超過10%時，辛酸含量變化不明顯，可能是因為，酶量的增加可以提高酶的催化效果，但過高的酶量會使體系內(nèi)參與反應(yīng)的水分減少，底物濃度加大導(dǎo)致無溶劑體系中黏度增大，傳質(zhì)阻力增大，使得酶催化效率降低。因此，本試驗初步確定最適宜的脂肪酶添加量為10%。

2.5.4 底物比對辛酸合成率的影響

取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比）分別為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，Lipozyme RM IM脂肪酶添加量8%，于水浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間為4 h，得到不同底物比例下制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量變化曲線如圖7所示。

圖7 底物比對辛酸合成率的影響

由圖7可以看出，當(dāng)?shù)孜锉壤秊?∶1時，辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.69%，當(dāng)比例升高到2∶1時，辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)驟然升高，達(dá)到22.45%，但隨著底物比例的繼續(xù)增大，辛酸含量不但沒有繼續(xù)升高，反而呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)?shù)孜锉壤_(dá)到4∶1時，辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降到最低，為13.3%，之后隨著底物比例加大，辛酸含量達(dá)到動態(tài)平衡，不再變化?？赡苁且驗椋跓o溶劑體系下脂肪酶直接作用于底物，高濃度的辛酸對酶催化環(huán)境的改變比較明顯，體系中高濃度的游離酸使酶分子周圍水相酸化及其在水相中溶解度增大，高濃度游離酸可以產(chǎn)生大量游離或離子化羧基，造成酶分子周圍水相的酸化，使酶催化微環(huán)境或酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變［9］，也可能是由于過多的底物導(dǎo)致了酶被底物包裹，因而影響了催化效率［10］。因此，本試驗初步確定最適宜底物比例為2∶1。

2.5.5 酶穩(wěn)定性研究

固定化酶不僅有穩(wěn)定性高、易于反應(yīng)物分離等優(yōu)點，還可以進(jìn)行回收反復(fù)使用，既可以使生產(chǎn)連續(xù)化，同時也降低了生產(chǎn)成本。但一般使用次數(shù)越多可使酶的催化活性減弱。本試驗對脂肪酶的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比）3∶1，Lipozyme RM IM脂肪酶添加量10%，于水浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時間分別為8 h，得到循環(huán)使用脂肪酶不同次數(shù)下辛酸含量的變化如圖8所示。

圖8 酶重復(fù)使用次數(shù)對辛酸合成率的影響

由圖8可知，本試驗條件下Lipozyme RM IM脂肪酶具有良好的穩(wěn)定性，循環(huán)使用10次，辛酸含量幾乎沒有變化，到第11次時辛酸含量開始下降，但此時的辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然達(dá)到了30%以上。因此，脂肪酶Lipozyme RM IM適合于工業(yè)化生產(chǎn)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。

2.6 響應(yīng)面試驗安排及試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，由Design-Expert.8.05b軟件的中心組合設(shè)計原理，以辛酸含量為響應(yīng)值，對相關(guān)性較大的反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時間（B）、酶添加量（C）、底物比例（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物摩爾比）4個因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，建立二次多項式回歸模型，綜合考慮各個因素對結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量的影響，因素水平編碼見表2，中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表2 因素水平編碼

表3 試驗安排及結(jié)果

2.6.1 各參數(shù)對辛酸含量的響應(yīng)面結(jié)果分析

對表3所得的數(shù)據(jù)，采用響應(yīng)面Design-Expert.8.05b軟件統(tǒng)計分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：

辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) ＝26．11＋1．11A＋1．99B-0．19C＋4．50D-0．12AB＋2．08AC-0．93AD＋0．18BC＋0．93BD＋2．34CD-0．084A2-0．65B2＋1．12C2-1．66D2，R2＝0.955 8。

回歸分析與方差分析結(jié)果見表4。

表4 回歸分析與方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，該模型回歸顯著（P＜0.01），表明回歸模型與試驗結(jié)果較吻合。失擬項不顯著（P＝0.086 0＞0.05），表明該模型擬合程度良好，試驗誤差小。方程決定系數(shù)R2＝0.955 8，說明95.6%的試驗數(shù)據(jù)可用這個方程解釋，也可用該模型來分析和預(yù)測試驗結(jié)果。變異系數(shù)（Coefficient of Variability，CV）代表不同試驗組之間的變異程度，本試驗的CV值為4.91%，較低的CV值說明本試驗的重復(fù)性比較好。由F檢驗結(jié)果的顯著性分析可知，影響最顯著地因素是B和D，即反應(yīng)時間和底物比例，其他2個因素影響較小，因素貢獻(xiàn)率為B＝D＞A＞C，即反應(yīng)時間 ＝底物比例 ＞反應(yīng)溫度 ＞酶添加量。

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法分析回歸模型得到最優(yōu)的響應(yīng)結(jié)果為：反應(yīng)溫度68℃，反應(yīng)時間7.88 h，酶添加量11.8%，底物比例2.98∶1，此時響應(yīng)面有最優(yōu)值辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)35.25%。

對響應(yīng)面得出的最優(yōu)條件進(jìn)行驗證試驗，制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝條件為：反應(yīng)溫度68℃，反應(yīng)時間8 h，酶添加量12%，底物比例3∶1，得到結(jié)構(gòu)脂質(zhì)辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.63%，與理論預(yù)測值基本一致，相對誤差為1.62%。說明回歸方程與實際操作擬合性好，驗證了模型是有意義的。

2.6.2 含水量對辛酸合成率的影響

所謂的無溶劑體系并不是絕對無水，一般含水量在0.01%以下，在絕對無水的條件下酶促反應(yīng)是不可能發(fā)生的。水分是酶維持活性構(gòu)象所必需，酶的活性構(gòu)象形成依賴于各種氫鍵、疏水鍵等非共價鍵的相互作用，而水參與氫鍵形成和疏水的相互作用。但水分過多容易使酶積聚成團(tuán)，導(dǎo)致疏水性底物較難與酶的活性部位接觸，從而影響傳質(zhì)。對不同的脂肪酶及不同的反應(yīng)體系，其最佳的含水量也是不同的。本試驗根據(jù)響應(yīng)面得出的最優(yōu)工藝條件，即取2 g棉籽油分提產(chǎn)物，辛酸比例3∶1（辛酸／棉籽油分提產(chǎn)物，物質(zhì)的量比），Lipozyme RM IM脂肪酶添加量12%，于水浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為100 r／min，反應(yīng)溫度分別為68℃，反應(yīng)時間10 h，得到不同含水量下制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸含量變化曲線如圖9所示。

圖9 含水量對辛酸合成率的影響

圖9可知，在所選含水量范圍內(nèi)，辛酸含量變化復(fù)雜，總體看來辛酸含量呈下降趨勢，但總的改變量并不大，雖然含水量10%時辛酸含量略有上升，但過多的含水量會使反應(yīng)向水解方向轉(zhuǎn)變，影響目標(biāo)物的生成。因此，本研究中原始底物的含水量足以維持酶的催化活性，且辛酸含量很高，所以不再考慮額外添加水分。

3 結(jié)論

對脂肪酶催化棉籽油分提產(chǎn)物和辛酸酸解反應(yīng)制取結(jié)構(gòu)脂質(zhì)進(jìn)行了研究。脫酸堿液選擇表明，KOH-乙醇水（V乙醇∶V水＝30∶70）溶液脫酸效果最好；脂肪酶篩選表明，Lipozyme RM IM具有較好的催化活性；溶劑體系選擇表明，無溶劑體系更適合制取結(jié)構(gòu)脂質(zhì)；利用響應(yīng)面分析方法進(jìn)行優(yōu)化試驗，建立了相應(yīng)的回歸模型，得到最優(yōu)酶法酸解工藝條件為：反應(yīng)溫度68℃，反應(yīng)時間7.88 h，酶添加量11.8%，底物比例2.98∶1，此時響應(yīng)面有最優(yōu)值辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)35.25%。在實際操作中對此工藝條件進(jìn)行驗證試驗，得到結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.63%，與理論預(yù)測值一致。底物本身的含水量足以維持酶的催化活性。棉籽油分提產(chǎn)物進(jìn)行油脂改性后制取的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，產(chǎn)品為淡黃色油狀液體，具有棉籽油固有香味，具有良好的物理性能，脂肪酸組成更有利于人體健康。

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