姚 笛 葉曼曼 李 琳 樊 蕾 孟 超 楊 健

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319）

（浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司2，杭州 310035）

低聚木糖系由2～7個木糖分子以α-1，4糖苷鍵結(jié)合而成［1］，具有很強(qiáng)的增殖腸道益生菌［2］、改善腸道微生態(tài)環(huán)境等功能［3-4］，它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低，具有抗齲齒作用［5］。低聚木糖作為一種非消化性糖，理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸、耐熱，是一種功能性食品配料［6-7］，被認(rèn)為是目前最有前途、國內(nèi)外研究最為廣泛的功能性低聚糖之一。

低聚木糖的生產(chǎn)主要是以富含木聚糖的植物（如玉米芯、棉籽殼、麩皮等）為原料，通過木聚糖水解酶酶解而得的一種低聚糖［8-9］，制備低聚木糖的原料多為木聚糖提取率較高的木質(zhì)纖維素，玉米芯中含有大約35%的半纖維素、35%的纖維素和15%的木質(zhì)素，其中半纖維素的主要組成為木聚糖，它通過降解可生產(chǎn)低聚木糖［10-11］。目前，我國對玉米芯的利用相對來說還很少，除少量進(jìn)行初加工外，絕大部分作為農(nóng)家燃料被燒掉，既浪費(fèi)了資源又污染環(huán)境，我國對低聚木糖的研究起步較晚，與一些發(fā)達(dá)國家相比，在技術(shù)和工藝上都有一定程度的差距。近年來，由于低聚木糖市場需求的持續(xù)增長，對其生產(chǎn)工藝的技術(shù)要求也不斷提高。因此，以價(jià)廉易得的玉米芯為原料，研究開發(fā)低聚木糖產(chǎn)品具有極大的競爭力和市場開發(fā)前景［12-14］。本研究旨在開發(fā)高附加值的低聚木糖，以玉米芯為原料，通過響應(yīng)面法對酶法提取低聚木糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為玉米芯資源的有效利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，具有重要的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米芯：大慶市郊區(qū)；木聚糖酶：本實(shí)驗(yàn)室利用球毛殼霉發(fā)酵后分離純化獲得；木聚糖：sigma公司；D-木糖、3，5-二硝基水楊酸、乙醇等為國產(chǎn)分析純。

1.2 玉米芯木聚糖粗品的制備

采用堿法提取木聚糖粗品，具體流程為：干燥的玉米芯粉→堿法浸提→上清液→過濾→粗提液→中和→沉淀→離心→水解→醇沉→離心→烘干沉淀→得木聚糖粗品。

1.3 酶解木聚糖制備低聚木糖

取木聚糖粗品，用蒸餾水浸泡12 h制成木聚糖濃縮液，調(diào)pH為5.7，添加木聚糖酶，搖床水浴振蕩酶解，過濾，重復(fù)3次，取其上清液進(jìn)行還原糖含量的測定。

1.4 單因素試驗(yàn)

以木聚糖底物濃度、木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時間4個影響玉米芯中低聚木糖含量的因素做單因素試驗(yàn)，確定各因素適宜的范圍。

1.5 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量及其水平。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以還原糖含量為指標(biāo)，選取木聚糖底物濃度、木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時間4個因素，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，用響應(yīng)面分析（Response surface analysis，RSA）方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，以確定酶處理的最優(yōu)工藝條件。每個試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，取試驗(yàn)結(jié)果的平均值。其中各自變量的因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表

1.6 還原糖含量測定

還原糖含量采用 DNS法測定（以木糖計(jì)，g／L）［15］。

1.7 酶解液組分分析

采用高效液相色譜法分析最優(yōu)條件下玉米芯酶解液中低聚木糖的主要成分［16］，色譜條件：色譜柱為Suga KS-802柱；檢測器為515示差折光檢測器；流動相為超純水；流速0.8 mL／min；進(jìn)樣量5μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 底物濃度對還原糖含量的影響

由圖1可知，隨著木聚糖底物濃度的增加，酶解液中還原糖含量逐漸增加，酶解后酶解液中還原糖含量在木聚糖底物濃度為1%～5%時逐漸增加，而在3%～5%時還原糖含量增加不明顯。因此，為節(jié)省原材料，宜選用木聚糖底物濃度3%。

圖1 底物濃度對還原糖含量的影響

2.1.2 木聚糖酶添加量對還原糖含量的影響

由圖2可知，隨著木聚糖酶添加量的增大，酶解液還原糖含量逐漸增加，加酶量為40 mL／g時還原糖含量最高，所加酶量以40 mL／g較好。

圖2 加酶量對還原糖含量的影響

2.1.3 酶解溫度對還原糖含量的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，酶解液的還原糖含量先逐漸增加后有所降低，溫度過高對木聚糖酶活力有一定的影響，因此，酶解溫度為60℃時還原糖含量最高。

圖3 酶解溫度對還原糖含量的影響

2.1.4 酶解時間對酶解液還原糖含量的影響

由圖4可知，隨著酶解時間延長，酶解液的還原糖含量先增加后減少，3～5 h增加明顯，5～7 h有所降低，處理5 h時酶解液的還原糖含量最高，所以酶解時間以5 h較好。

圖4 酶解時間對還原糖含量的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化低聚木糖提取工藝參數(shù)分析

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

響應(yīng)面法優(yōu)化低聚木糖提取工藝試驗(yàn)結(jié)果如表2，通過Design Expert數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行回歸分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可知，底物濃度的一次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），加酶量的一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明這2個因素對還原糖含量的線性效應(yīng)顯著，所有二次項(xiàng)對還原糖含量的曲面效應(yīng)極顯著，交互項(xiàng)AB、AD交互效應(yīng)顯著（P＜0.05），表明各影響因素對還原糖含量的影響不是簡單的線性關(guān)系。表3分析結(jié)果可見，整體模型的P值小于0.000 1，該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，并且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明該回歸方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行了較好擬合，二次回歸方程為：R＝3．82＋0．17A＋0．12B＋0．08C-0．07D-0．18AB＋0．02AC-0．26AD-0．06BC-0．04BD-（5．00E＋003）CD-0．95A2-0．43B2-0．25C2-0．41D2

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面以及等高線分析結(jié)果

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值在各試驗(yàn)因子交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個三維空間曲面。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀。圖5、圖6是對響應(yīng)值還原糖含量影響較大的兩因素交互作用的響應(yīng)面，其他因素交互作用不顯著。

圖5 底物濃度和加酶量對還原糖含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

由圖5可知，底物濃度在（3%～4%）范圍內(nèi)，木聚糖酶添加量在（40～50 mL／g）范圍內(nèi)時，兩者存在著顯著的增效作用，還原糖含量隨著底物濃度和木聚糖酶添加量的增加而增加；而當(dāng)?shù)孜餄舛攘吭冢?%～3%）范圍內(nèi)，木聚糖酶添加量在（30～40 h）范圍內(nèi)時，還原糖含量隨著兩個因素的增加而減少。由圖6可知，底物濃度在（3%～4%）范圍內(nèi)，酶解時間在（5～6 h）范圍內(nèi)時，兩者存在著顯著的增效作用，還原糖含量隨著底物濃度和酶解時間的增加而升高；而當(dāng)?shù)孜餄舛仍冢?%～3%）區(qū)間，酶解時間在（4～5 h）還原糖含量隨著兩個因素的增加開始降低。

圖6 底物濃度和酶解時間對還原糖含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

為了確定最佳點(diǎn)的值，對試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，以得到高還原糖低聚木糖的最佳制備工藝條件，經(jīng)分析得出最佳制備條件為：底物濃度為3%，加酶量為41 mL／g（底物），51℃時酶解4.88 h所得的低聚木糖含量最高，3.88 mg／mL。為檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行玉米芯中低聚木糖的提取，同時考慮到實(shí)際操作的便利，最佳條件修正底物濃度為3%，加酶量為40 mL／g（底物），50℃時酶解5 h所得的低聚木糖含量為3.86 mg／mL。與預(yù)測值比較可知，本試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 優(yōu)化條件下酶解液的組分分析

采用HPLC對玉米芯酶解液中低聚木糖組分進(jìn)行分析，低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜如圖7所示，從圖7可以看出，1號峰為木糖，出峰時間11.426 min，2號為木二糖（10.324 min），3號為木三糖（9.875 min），4號為木四糖（9.216 min），5號為木五糖（8.571 min）。酶解液中低聚木糖組分的HPLC圖譜如圖8，由積分面積可知低聚木糖（木二～木五）的相對含量達(dá)68.1%，說明此水解條件能夠較好的制備低聚木糖。

圖7 低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

圖8 酶解液中低聚木糖組分的HPLC圖譜

3 結(jié)論

采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，經(jīng)響應(yīng)面分析結(jié)合實(shí)際值確定玉米芯酶法制備低聚木糖的最佳工藝條件為底物濃度3%，加酶量為40 mL／g（底物），50℃時酶解5 h所得的酶解液中還原糖含量為3.86 mg／mL。能夠使玉米芯中的木聚糖充分水解得到低聚木糖，并通過HPLC進(jìn)行水解產(chǎn)物的分析，證明水解產(chǎn)物中含有較高的木二糖、木三糖、木四糖及木五糖等低聚木糖組分，低聚木糖（木二～木五）的相對含量達(dá)68.1%，因此說明優(yōu)化的水解條件能夠較好的制備低聚木糖。

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