王振斌 王 璽 馬海樂 林曉明 王 林 王 干 白志杰

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

芝麻餅粕蛋白質(zhì)是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的完全蛋白質(zhì)資源。蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小、結(jié)構(gòu)特征、氨基酸組成、帶電情況等理化性質(zhì)直接相關(guān)［1-4］，還與加工條件及pH、溫度、離子強(qiáng)度等外部環(huán)境等因素密切相關(guān)［1-2］。充分掌握蛋白質(zhì)的功能特性，對于蛋白質(zhì)在食品工業(yè)中的應(yīng)用，以及進(jìn)行新型蛋白質(zhì)食品的開發(fā)具有重要意義。國內(nèi)外對于芝麻蛋白質(zhì)理化和功能性質(zhì)的已有研究指出芝麻蛋白是食品工業(yè)潛在的原材料［5-7］。芝麻蛋白提取方法較多，其中堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。提取方法對蛋白質(zhì)的物理和功能性質(zhì)具有顯著的影響，針對提取技術(shù)對芝麻蛋白理化和功能性質(zhì)的對比研究目前鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)以堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法3種不同工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品為原料，對其理化性質(zhì)和功能性質(zhì)進(jìn)行對比研究，以期為芝麻餅粕蛋白質(zhì)的工業(yè)化提取技術(shù)的選擇提供理論依據(jù)，并推動(dòng)芝麻蛋白在食品工業(yè)上的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芝麻餅粕蛋白質(zhì)：自制；芝麻餅粕：新沂吉順昌油脂科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：美國Sigma公司；大豆色拉油：市售；分析純試劑：氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

pH5-3C型pH計(jì)：上海理達(dá)儀器廠；HH-A恒溫水浴攪拌鍋：江蘇金壇市中大儀器廠；SPF401F電子天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）中國有限公司；TGL-16高速臺式冷凍離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FJ200-S數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；FOSS 2100型凱氏定氮裝置：上海新嘉電子有限公司；AKTA Purifier 100蛋白質(zhì)分離純化設(shè)備：美國 GE Healcare集團(tuán)；Sykam S433D／S433氨基酸分析儀：上海仁特檢測儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芝麻餅粕蛋白質(zhì)的制備

在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)PA的工藝條件為：NaOH濃度0.37 mol／L，提取溫度75.19℃，提取時(shí)間4.7 h，液料比25.19，提取次數(shù)1次，提取結(jié)束后離心過濾，所得上清液即為芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取液，以1mol／L鹽酸調(diào)上清液pH至4.0（芝麻餅粕蛋白質(zhì)等電點(diǎn)）使蛋白質(zhì)沉淀，靜止30 min后4 500 r／min離心20 min，棄上清，所得沉淀再加5倍體積70%乙醇，室溫浸泡30 min，離心，再加2次2倍體積去離子水洗滌，離心，下層蛋白質(zhì)真空冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品，產(chǎn)品中蛋白含量為58.76%；超聲輔助堿提法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)PU的工藝條件為：超聲功率密度2.22 W／mL，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度70℃，NaOH濃度0.33 mol／L，液料比50，提取結(jié)束后離心過濾，所得上清液即為芝麻蛋白質(zhì)提取液，以1 mol／L鹽酸調(diào)上清液pH至4.0（芝麻餅粕蛋白質(zhì)等電點(diǎn)）使蛋白質(zhì)沉淀，靜止30 min后4 500 r／min離心20 min，棄上清，所得沉淀再加5倍體積70%乙醇，室溫浸泡30 min，離心，再加2次2倍體積去離子水洗滌，離心，下層蛋白質(zhì)真空冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品，產(chǎn)品中蛋白含量為60.23%；蛋白酶法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)PE的工藝條件為：酶解時(shí)間45 min，pH 9，酶解溫度50℃，加酶量4 000 U／g，液料比20，反應(yīng)過程中經(jīng)常以1 mol／L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，反應(yīng)結(jié)束后，100℃滅酶 15 min，冷卻后4 500 r／min離心20 min，下層沉淀再加5倍體積去離子水?dāng)嚢?0 min后離心，合并3次上清液，真空濃縮、冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品，產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量為67.89%。

1.2.2 氨基酸分析

精確稱取一定量樣品置于水解管中，加入6 mol／L的 HCI溶液，真空封口，在110℃下水解24 h，冷卻后定容、過濾、蒸干，取濾液1 mL于小燒杯中，真空干燥后加入1 moL 0.02 mol／L HCL溶液，在空氣中放置30 min后，采用氨基酸自動(dòng)分析儀測定氨基酸的含量（色氨酸除外）。

1.2.3 相對分子量的測定

采用AKTA Purifier 100蛋白質(zhì)分離純化設(shè)備進(jìn)行檢測，凝膠柱類型及規(guī)格為Superose1 210／300 GL（10 mm×300 mm）預(yù)裝柱，檢測波長為UV 215 nm，洗脫液為50 mmol／L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（含0.15 mol／L NaCl），上樣體積為 500μL，洗脫流速 0.5 mL／min。分子量標(biāo)品為牛血清白蛋白質(zhì)（分子質(zhì)量MW 67 000 u）、細(xì)胞色素（MW 12 700 u）、鈷胺酰胺（VB12，MW 1 355 u）、Gly-Gly-Tyr-Arg（MW 451.48 u）。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量對數(shù)（lg-MW）為橫坐標(biāo)（X），洗脫時(shí)間為縱坐標(biāo)（Y）作線性回歸分析，得到線性回歸方程Y＝-4.094X＋30.66，相關(guān)系數(shù)R2＝0.990 4。

1.2.4 溶解性的測定

參照 Klompong法［8］。準(zhǔn)確稱取0.20 g樣品溶于20 mL水中，分別調(diào)節(jié)至相應(yīng)pH，室溫?cái)嚢?0 min，4 500 r／min離心20 min后取上清液，用半微量凱氏定氮法［9］分別測定上清液和未處理樣品中的含氮量，氮溶解指數(shù)（Nitrigon Solmion Index，NSI）計(jì)算公式為：

1.2.5 持水性和持油性的測定

參照Khalid法［10］。稱取0.50 g蛋白質(zhì)樣品置于10 mL的預(yù)先干燥并稱好質(zhì)量的離心管中，加入5 mL去離子水（大豆油），充分振蕩、混勻后，置于40℃水浴中保溫30 min，4 000 r／min離心30min，傾去上層未吸附的水（大豆油），稱重，按照式（2）計(jì)算每克蛋白質(zhì)樣品的持水性（持油性）。

式中：W0為蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量／g；W1為離心管加干燥樣品的總質(zhì)量／g；W2為離心后離心管加沉淀的總質(zhì)量／g。

1.2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照Klompong法［8］。稱取一定量樣品溶解于不同pH緩沖液中配成1.0%的蛋白質(zhì)溶液，室溫?cái)嚢?0 min后，加入5.0 mL大豆油，以10 000 r／min均質(zhì)60 s，立即從底部吸取100μL乳濁液與10.0 mL 0.1%SDS溶液混勻，500 nm處測定光吸收值A(chǔ)0，此值即為乳化活性（EA）。10 min后重新從靜置的乳濁液底部取樣測定光吸收值A(chǔ)t。乳化穩(wěn)定性（ES）用乳化穩(wěn)定指數(shù)（ESI）表示：

式中：At為10 min時(shí)刻的吸光值；A0為0時(shí)刻的吸光值；Δt為3次測定乳化活性的時(shí)間間隔，本試驗(yàn)中該值為10 min。令 K＝At／A0，則當(dāng) ΔT為定值時(shí)，K與ESI成正比關(guān)系。為了避免計(jì)算時(shí)出現(xiàn)ΔA為0或負(fù)值，引進(jìn)吸光值比（K）來描述乳化穩(wěn)定性。

1.2.7 起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定

參照Rhicha法［11］。稱取一定量樣品溶解于pH 7緩沖液中配成1.0%的蛋白質(zhì)溶液，室溫?cái)嚢?0 min后，然后用數(shù)顯高速分散機(jī)以10 000 r／min攪打60 s，立即全部轉(zhuǎn)移至 50 mL量筒內(nèi)，測定此時(shí)（0 min）泡沫的體積（V1）并代表起泡性FC。

讀取室溫靜止放置30 min后量筒中泡沫體積（V2），則起泡穩(wěn)定性FS計(jì)算公式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。P＜0.05為差異顯著水平，P＜0.01為差異極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻餅粕蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析

堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)PA、PU和PE的氨基酸組成及必需氨基酸含量見表1。從表1可以看出，3種工藝制備的蛋白質(zhì)氨基酸組成平衡，必需氨基酸含量豐富，谷氨酸、精氨酸和天門冬氨等非必需氨基酸含量均相對較高，而賴氨酸含量相對較少，這可能是因?yàn)橹ヂ轱炂稍诠I(yè)制油過程中，由于物理或化學(xué)操作所造成的。3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)的氨基酸組成存在一定差異，但差異較小，導(dǎo)致差異的原因可能與制備的方法不同有關(guān)。由表2數(shù)據(jù)還可以看出，從親水性氨基酸和疏水性氨基酸的比例來看，3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)均是親水性蛋白質(zhì)，可以根據(jù)它們的氨基酸含量來判斷其功能性質(zhì)。與FAO／WHO理想必需氨基酸模式相比3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)中除賴氨酸含量稍低外，其他必需氨基酸組成均接近或高于FAO／WHO模式，所以3種工藝制備的蛋白質(zhì)均具有良好的營養(yǎng)價(jià)值。由于蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值主要是由氨基酸尤其是必需氨基酸的含量和比例決定的，所以，3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值高，適宜于進(jìn)一步加工制作食用蛋白質(zhì)以作為營養(yǎng)食品或加工食品的配料，從而提高其應(yīng)用價(jià)值［12-15］。

表1 3種芝麻餅粕蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析／g／100 g

2.2 芝麻餅粕蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布

堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)PA、PU和PE的相對分子質(zhì)量分布的吸收峰對應(yīng)的相對分子質(zhì)量與面積比如表2所示。表2可知，PA各組分相對分子質(zhì)量5 000以上的芝麻餅粕蛋白質(zhì)占總量的78.74%。PU各組分相對分子質(zhì)量5 000以上的芝麻餅粕蛋白質(zhì)占總量的74.87%。PA與PU的吸收峰的相對分子質(zhì)量和分子量分布范圍百分比都比較接近，說明短時(shí)間的超聲波在加速蛋白質(zhì)溶出的同時(shí)對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的破壞力比較小。PE各組分相對分子質(zhì)量2 000以下的芝麻餅粕蛋白質(zhì)占總量的73.8%。與PA及PU相比，PE中低分子質(zhì)量肽鏈所占的比重較大。這是因?yàn)榈鞍酌冈谝欢ǖ臈l件下對芝麻餅粕蛋白質(zhì)長鏈的水解作用。

表2 3種芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品相對分子量分布比例

2.3 芝麻餅粕蛋白質(zhì)的溶解性的比較

由圖1可知，在不同的pH值下，芝麻餅粕蛋白質(zhì)溶解性不同，在等電點(diǎn)附近（pH 4）時(shí)NSI最低，溶解性差，而在偏離等電點(diǎn)的酸性和堿性條件下NSI較高。因?yàn)橹ヂ轱炂傻鞍踪|(zhì)分子是兩性分子，既能像酸一樣解離，又能像堿一樣解離。在酸性介質(zhì)中，蛋白質(zhì)分子主要以正離子狀態(tài)存在，電荷互相排斥，分子分散性好，溶解性較好。但是隨著pH值的升高，芝麻餅粕蛋白質(zhì)的NSI就逐步下降，在等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)以兩性離子狀態(tài)存在，NSI變得最低，當(dāng)pH值繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)又變成負(fù)離子，NSI隨著pH值得升高而升高［12］。

圖1 pH對3種芝麻餅粕蛋白質(zhì)的溶解性的影響

由圖1可知，在相同pH條件下3種方法制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)的氮溶解指數(shù)存在明顯差異，特別是在酸性條件下。在等電點(diǎn)時(shí)，堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法制備的芝麻餅餅粕蛋白質(zhì)的NSI分別為7%、40.23%和72.5%，三者差異極顯著?？傮w上：PE＞PU＞PA。超聲波輔助堿提可以提高蛋白質(zhì)的溶解性，原因可能是超聲波處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，親水性增強(qiáng)，同時(shí)超聲波處理能打斷蛋白質(zhì)分子表面的自由氨基群與鄰近的羧基群之間的靜電引力，使蛋白質(zhì)分子彼此分散，不易聚集，因而提高了蛋白質(zhì)的溶解度［13-14］。蛋白酶法制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)溶解性最好，這是由于蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解和改性，極性基團(tuán)數(shù)目增加、多肽鏈平均分子量降低、蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生變化，從而使蛋白質(zhì)親水性增強(qiáng)，有利于蛋白質(zhì)在水中的溶解［15］。

2.4 芝麻餅粕蛋白質(zhì)的持水性和持油性的比較

堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)的持水性分別為0.880 7、1.444 9、1.671 35 g／L；持油性分別為2.12、2.708 5、2.258 g／L。由圖2可知，3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)的持水性和持油性均有顯著性差異（P＜0.05），且PE＞PU＞PA。PU的持水性高于PA，這是因?yàn)槌暡ǖ母男宰饔檬沟鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，極性基團(tuán)展開，能夠吸附大量的水分子［16-17］。與PA和PU相比，PE的持水性提高了15.68%。這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子被酶解后，大量親水基團(tuán)外露的緣故。

圖2 3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)的持水性和持油性

在許多食品和生物體系中，蛋白質(zhì)和脂類之間存在著相互作用，這作用是脂類的非極性脂肪族鏈和蛋白質(zhì)的非極性鍵之間的疏水相互作用［16］。與PA相比，PU的持油性提高了，這是因?yàn)槌暡ǖ母男宰饔檬怪ヂ轱炂傻鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，疏水性氨基酸殘基數(shù)增加，能與脂類強(qiáng)烈的相互作用，形成脂質(zhì)-蛋白質(zhì)絡(luò)合物。而PE的持油性更高，可能是因?yàn)榻?jīng)蛋白酶水解，芝麻餅粕蛋白質(zhì)鏈的高級結(jié)構(gòu)被打開，使得疏水性氨基酸殘基數(shù)增加，持油性能提高［17-18］。

2.5 芝麻餅粕蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性的比較

由圖3可知，芝麻餅粕蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近（pH 4）時(shí)乳化性最差，而在偏離等電點(diǎn)的酸性和堿性條件下乳化性較好。芝麻餅粕蛋白質(zhì)的pH-乳化性曲線與pH-溶解性曲線相似，可能都是由蛋白質(zhì)分子表面的結(jié)構(gòu)和帶電荷性決定的。

圖3 3種芝麻餅粕蛋白質(zhì)的乳化性隨pH的變化

PU與PA的乳化性差異較小，而PE的乳化性明顯優(yōu)于PU和PA。蛋白酶解引起蛋白質(zhì)乳化性發(fā)生改變，主要原因是芝麻餅粕經(jīng)過蛋白酶的適度水解，使得蛋白質(zhì)的溶解度增大，有利于蛋白質(zhì)在油／水界面擴(kuò)散并定位，因此乳化性增強(qiáng)［19］。

K值與ESI成正相關(guān)，K值越大，則ESI越大。由圖4可知，在pH＜6范圍內(nèi)，PU比PA的乳化穩(wěn)定性好，在pH＞6范圍內(nèi)則剛好相反。在不同的pH條件下，PE的乳化穩(wěn)定性差異較小，但高于PU和PA。蛋白酶的水解作用使得疏水基團(tuán)暴露于分子表面，有利于蛋白質(zhì)分子在油水界面上的有序排列，提高乳濁液的穩(wěn)定性［20-21］。

圖4 3種芝麻餅粕蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性隨pH的變化

2.6 芝麻餅粕蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性的比較

由圖5可知，3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性均有顯著性差異（P＜0.05），且PE＞PU＞PA。PU的起泡性及泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于PA，這是因?yàn)槌曁幚硎沟弥ヂ轱炂傻鞍椎臉O性基團(tuán)展開，有利于形成蛋白質(zhì)薄膜，使水的表面張力迅速降低，提高起泡性和起泡穩(wěn)定性［16，22］。

圖5 3種芝麻餅粕蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性

與PU相比，PE的起泡性與泡沫穩(wěn)定性分別提高了25%和11.07%。蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性與溶解性密切相關(guān)，蛋白酶水解后蛋白質(zhì)溶解性提高，緊密的蛋白質(zhì)分子變松散，疏水性氨基酸側(cè)鏈暴露，使蛋白質(zhì)快速定位至泡沫表面，提高蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性；同時(shí)有利于多肽鏈的交聯(lián)，形成一定的黏層，提高蛋白質(zhì)起泡穩(wěn)定性［21，23］。

3 結(jié)論

3.1 堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)PA、PU和PE的氨基酸組成存在一定差異，但差異較小，且均含有豐富的必需氨基酸，谷氨酸、精氨酸等非必需氨基酸含量也均較高。3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)中除賴氨酸含量稍低外，其他必需氨基酸組成均接近或高于FAO／WHO模式，所以3種工藝制備的蛋白質(zhì)均具有良好的營養(yǎng)價(jià)值。

3.2 堿溶酸沉法制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為 11 789、9 990、4 981、2 975、1 963、1 005、1 901和 94，分別占總量的 49.90%、28.84%、6.23%、2.73%、2.73%、1.97%、2.79%、4.79%；超聲輔助堿提法制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為 11 878、9 990、4 981、2 975、1 963、1 005、190和92，分別占總量的48.59%、26.28%、6.19%、2.92%、3.06%、2.39%、3.6%、6.97%；而蛋白酶法制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)吸收峰相對分子質(zhì)量為9 999、4 985、2 978、1 965、1 295、678、250和 177，分別占總量的1.65%、9.5%、8.23%、6.78%、11.98%、17.42%、25.59%、18.84%。

3.3 PA、PU和PE溶解性順序?yàn)椋篜E＞PU＞PA，三者均在等電點(diǎn)（pH 4）時(shí)最低，分別為7%、40.23%和72.5%。

3.4 PA、PU和PE的持水性、持油性、起泡性及起泡穩(wěn)定性均有顯著性差異，且PE＞PU＞PA。與PU相比，PE的持水性和持油性分別提高了15.68% 和20.31%，起泡性與起泡穩(wěn)定性分別提高了25%和11.07%。

3.5 蛋白質(zhì)的pH-乳化性曲線與pH-溶解性曲線相似，乳化性和溶解性均為等電點(diǎn)最低，偏離等電點(diǎn)的酸性和堿性條件下較高。與PU相比，PE的乳化性及乳化穩(wěn)定性均有一定程度的提高。在pH＜6范圍內(nèi)，PU的乳化穩(wěn)定性比PA的乳化穩(wěn)定性好，而在pH＞6范圍內(nèi)則相反；PE的乳化穩(wěn)定性最好。

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