賴利平，潘偉男，鄧水秀

(湖南食品藥品職業(yè)學院，湖南 長沙 410208)

14-3-3蛋白家族是一組在生物有機體和組織中廣泛表達的、高度保守的、分子量約為25～30KD的酸性蛋白質(zhì)。根據(jù)高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)中5個亞型各自的洗脫位置將哺乳動物腦中14-3-3蛋白的主要亞型命名為α～η，其中α和δ分別是β和ζ的磷酸化形式，另外兩個亞型τ(也稱為θ)和σ分別在T細胞和上皮細胞中表達，τ亞型也在腦等其他組織中廣泛表達，7種亞型均存在于所有真核細胞中。14-3-3作為一個二聚體蛋白家族，調(diào)控蛋白質(zhì)之間的相互作用，廣泛參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、周期進程、生長增殖、分化凋亡和擴展遷移。本文就14-3-3蛋白功能、機制的研究進展予以綜述。

1 14-3-3在細胞生長、增殖和分化中的作用

14-3-3通過不同的機制來調(diào)控細胞生長、增殖和分化。14-3-3在Raf-1/ERK/MAPK(細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，即促絲裂原激活蛋白)途徑中是通過與Raf-1的相互作用來調(diào)控細胞生長的。MAPK信號的級聯(lián)放大作用控制著細胞的生長、增殖和分化，包括多種底物和限速步驟。生長因子、激素和絲裂原能促使細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1和ERK2活化，MEK1和MEK2促絲裂原激活蛋白激酶激酶 MAPKK(或稱ERK活化激酶)活化ERK1/ERK2，而Raf-1能活化MEK1/MEK2。Ras作為Raf-1活性的刺激因子，在局部發(fā)揮激活的作用，對質(zhì)膜進行恢復(fù)補充。MEK1/MEK2活化后，其將激活MAPK。在此級聯(lián)放大的作用下，MEK1/2和MAPK激活潛在的轉(zhuǎn)錄因子并改變其基因表達方式[1]。14-3-3蛋白調(diào)控Raf-1的功能已經(jīng)明確，但其調(diào)控機制非常復(fù)雜，仍在繼續(xù)深入地研究探討中。Raf的所有亞型中均含有14-3-3蛋白的兩個結(jié)合位點，其中一個結(jié)合位點是顯性位點或稱為“管理者”位點[2]。在未活化的細胞中，顯性位點是磷酸化的，而另一位點是非磷酸化的。Raf-1并不能促使穩(wěn)定的Raf/14-3-3相互作用，因此，每個14-3-3二聚體僅通過其中一個結(jié)合位點(模序)與靶蛋白結(jié)合。當Raf-1的另一結(jié)合位點被磷酸化后，在高度局限性的濃縮作用的誘導(dǎo)下，其能與靶蛋白接近并快速結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)第一個結(jié)合位點(模序)定位于Ser 621，即激活Raf-1的重要調(diào)節(jié)區(qū)域，第二個結(jié)合模序定位于Ser 259，即抑制Raf-1的重要催化結(jié)構(gòu)域[3]。在未活化的細胞中，Raf-1的Ser 259是未磷酸化的，14-3-3不能結(jié)合Raf-1的N端，使Raf-1發(fā)揮對質(zhì)膜的激活作用。當兩個結(jié)合位點均被磷酸化后，14-3-3結(jié)合Raf-1的N端并引起其構(gòu)象變化，然而在此過程中14-3-3自身僅有輕微的構(gòu)象變化。研究結(jié)果顯示，14-3-3分離Raf-1從而阻斷其對質(zhì)膜的恢復(fù)作用，并抑制Ras/MAPK途徑[4]。研究發(fā)現(xiàn)，apelin-13通過14-3-3/Raf-1復(fù)合物-ERK 1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進大鼠血管平滑肌細胞增殖[5]。

14-3-3調(diào)控細胞生長和增殖的另一個機制是促絲裂原激活蛋白激酶-1(BMK1)。BMK1是MAPK家族的另一重要成員，其能促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，但BMK1的調(diào)控機制尚不十分清楚。MEK5是一個逆向作用的激酶，可促使BMK1磷酸化而激活。BMK1活化后使轉(zhuǎn)錄因子MEF2C磷酸化并被激活，14-3-3β與BMK1調(diào)控有關(guān)。有研究證實BMK1 C端的Ser 486磷酸化后才能與14-3-3β結(jié)合，而且14-3-3β與BMK1結(jié)合后可抑制BMK1的磷酸化并阻斷后續(xù)的 MEF2C激活作用[6]。另有研究證實，通過BMK1(Ser 486，即定位在BMK1-MEF2C的相互作用位點區(qū)域)和14-3-3的相互作用，14-3-3可能競爭性地抑制BMK1與MEF2C結(jié)合。因此，14-3-3可通過激活BMK1轉(zhuǎn)錄因子底物來抑制BMK1。近期研究證實，14-3-3結(jié)合p27調(diào)控細胞增殖，p27是一個周期依賴性蛋白激酶抑制因子，遷移至核內(nèi)后抑制周期依賴性蛋白激酶的活性并阻斷細胞周期的進程。因為周期依賴性蛋白激酶是核蛋白，p27定位在細胞核內(nèi)對其抑制周期依賴性蛋白激酶的活性具有重要意義。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt途徑調(diào)控細胞增殖、生存及活性，但過度激活有致癌作用。Akt磷酸化p27定位于Ser 10、Thr 157和Thr 198，p27的Thr 157磷酸化與14-3-3密切相關(guān)。在胞漿中14-3-3與p27分離，故能抑制p27的核內(nèi)功能[7]，最終激活細胞周期蛋白CDK復(fù)合物和細胞周期進程。

2 14-3-3在細胞周期調(diào)控和細胞凋亡中的作用

14-3-3在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮了較重要的作用。14-3-3與其靶蛋白結(jié)合后通過不同的機制影響細胞周期進程，也有可能通過影響蛋白質(zhì)定位或改變酶活性來影響細胞周期進程。Cdc25C是Cdc25雙重蛋白磷酸酶家族的成員之一，此家族包括 Cdc25A、Cdc25B和 Cdc25C。Cdc25B和Cdc25C已經(jīng)被證實與CDCK1/cyclin B1復(fù)合物(此復(fù)合物促使細胞周期從G2期向M期過渡)的激活有關(guān)。Cdc25C激活周期依賴性蛋白激酶CDC2，而CDC2經(jīng)有絲分裂促進細胞生長。Cdc25B的過度表達比Cdc25C更能有效誘發(fā)過早的有絲分裂并可導(dǎo)致有絲分裂突變。在分裂間期，14-3-3ε、14-3-3γ與Cdc25C結(jié)合可能是通過CDC2抑制過早激活的作用實現(xiàn)的，使得胞漿中的Cdc25C隔離并失活，而Cdc25C通過TAK1激酶和其他未知激酶在Ser 216磷酸化后可與14-3-3ε/γ 結(jié)合[8]。此外，CDC2抑制 CDC2激活劑的作用可確保其在有絲分裂開始階段就具有活性。當所謂的“檢查點激酶”CH1K活化時，以相似的機制在DNA損傷后發(fā)揮作用。CH1K磷酸化Cdc 25C后，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，Cdc25C在胞漿中分離開來并使細胞周期停滯在G2期。與之相反，14-3-3σ等另外5種亞型不能與Cdc25C直接結(jié)合[8]，14-3-3σ對Cdc25C的間接影響是通過Cdc25C誘導(dǎo)的抑制染色質(zhì)過早凝聚來完成的，而14-3-3β與14-3-3ε通過相同的調(diào)控機制也能抑制Cdc25B。14-3-3還可直接通過影響wee-1酶活性來調(diào)控細胞周期。Wee-1是一種酪氨酸激酶，在分裂間期經(jīng)磷酸化而被激活，其在Ser 642位點磷酸化后與14-3-3蛋白結(jié)合并能增強其活性，活化的Wee-1抑制CDC2磷酸化并阻斷細胞周期進程[9]。

14-3-3通過與兩種凋亡前體蛋白Bax和BAD相互作用來調(diào)控細胞凋亡。正常情況下，Bax在無活性狀態(tài)時位于細胞質(zhì)中，DNA損傷后，未與14-3-3σ結(jié)合的Bax位于中心體周圍的線粒體中，并促使細胞快速進入凋亡過程。然而當14-3-3σ存在時，14-3-3σ通過非依賴性磷酸化途徑與Bax相互作用，兩者結(jié)合后Bax在胞漿中處于無活性狀態(tài)，阻止細胞進入凋亡過程，最近報道了14-3-3θ與Bax相互作用也有此類似效應(yīng)[10]。此外，14-3-3通過調(diào)節(jié)BAD調(diào)控細胞凋亡，BAD可以抑制Bcl2和Bclx的抗凋亡作用。在Akt、PKA和核糖體S6激酶-1磷酸化BAD后，BAD可與14-3-3結(jié)合。兩者結(jié)合后，14-3-3誘導(dǎo)BAD構(gòu)象變化，使BAD從Bcl2或者Bclx中分離出來，依次阻斷BAD的凋亡前體效應(yīng)。因此，14-3-3蛋白在阻礙和抑制細胞凋亡中發(fā)揮了積極作用，可在細胞損傷至凋亡的一段時間內(nèi)完成DNA的修復(fù)。

3 14-3-3在細胞擴展和遷移中的作用

14-3-3通過整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)機制在調(diào)控細胞擴展和遷移中發(fā)揮作用。整聯(lián)蛋白是細胞表面的糖蛋白家族，其將細胞外基質(zhì)與肌動蛋白細胞支架相連接。通過跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，整聯(lián)蛋白可以調(diào)控細胞擴展、遷移和存活。14-3-3β與β-1整聯(lián)蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)相互作用，而14-3-3β的過度表達可刺激細胞擴展和遷移。大多數(shù)蛋白質(zhì)是通過依賴性磷酸化或非依賴性磷酸化途徑與14-3-3相互作用的，然而與其他蛋白質(zhì)不同的是，在依賴性磷酸化或非依賴性磷酸化途徑中，β-1整聯(lián)蛋白胞質(zhì)尾區(qū)不與14-3-3的基序結(jié)合，β-1整聯(lián)蛋白與14-3-3β通過另一種機制結(jié)合。最新研究顯示，14-3-3β通過一個新的結(jié)合位點與β-1整聯(lián)蛋白相互作用，但此作用需要位于14-3-3β兼性凹槽外的helix C Ser60殘基的參與[11]。Ser60磷酸化后可能會阻斷14-3-3β與 β-1整聯(lián)蛋白胞漿區(qū)的相互作用，促進細胞擴展和遷移。此外14-3-3β可能還通過與Raf-1、p130cas(細胞擴展中有關(guān)的微量蛋白)或其他與細胞遷移有關(guān)的信號途徑相互作用來促進細胞擴展和遷移。

14-3-3影響細胞擴展和遷移的另一個機制Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)途徑。興奮性細胞內(nèi)鈣觸發(fā)劑多重信號途徑包括CaMK級聯(lián)及其下游靶點CaMKⅠ、CaMKⅣ和蛋白激酶B(PKB)。CaMKⅠ位于細胞質(zhì)中，起到調(diào)控mRNA翻譯、細胞支架構(gòu)建和軸突生長活力的作用。CaMKⅣ位于核內(nèi)，起調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用。此外，在興奮性胞內(nèi)Ca2+存在的情況下，CaMKⅠ和CaMKⅣ上的磷酸化位點被CaMK激酶(CaMKK)磷酸化后得以激活。最新研究顯示，CaMKK中PKA介導(dǎo)的磷酸化存在三個調(diào)節(jié)位點，分別為Ser74、Ser108和Ser458，其中Ser108和Ser458磷酸化可使CaMKK失活，Ser74磷酸化后可使CaMKK與14-3-3結(jié)合從而抑制CaMKK。此外，CaMKK與14-3-3結(jié)合可以阻斷Thr108脫磷酸化作用，使CaMKK處于無活性狀態(tài)[12]。

4 結(jié)語

盡管在1968年就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了14-3-3蛋白家族，但直到10多年前才有研究發(fā)現(xiàn)其特殊作用。最新研究顯示，14-3-3在細胞周期調(diào)控、分化、凋亡、擴展、遷移等方面作用顯著，預(yù)測未來的深入研究可開啟14-3-3與細胞功能調(diào)控復(fù)雜關(guān)系的密鑰。

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