張曉燕，余 琦，白雪娟，梁 艷，李 寧※(綜述)，吳雪瓊(審校)

(1.中國人民解放軍第三○九醫(yī)院病理科,北京 100091; 2.鄭州金域臨床檢驗中心，鄭州 450000)

全世界約20億人口感染結核分枝桿菌，每年結核病新增病例870萬，將近140萬人死于此病[1]。隨著耐多藥結核病、廣泛耐藥結核病和人類免疫缺陷病毒感染患者的逐漸增多，結核病控制形勢越來越嚴峻[2]。從1923年開始，卡介苗就已經(jīng)加入世界衛(wèi)生組織擴大免疫計劃之中，至今卡介苗的接種量超過30億劑，并且每年有將近1億的新生兒仍在接種此疫苗，這使其成為臨床應用最為廣泛的結核疫苗，也是目前唯一可用于人類預防結核病的疫苗[3]。卡介苗可以有效預防新生兒及兒童嚴重的結核病(如結核性腦膜炎和粟粒性結核)，但對于成人肺結核疾病的預防效果非常弱，其免疫保護效率為0%～80%[4-7]。因此，研發(fā)新型的結核疫苗以替代或加強卡介苗勢在必行。

1 DNA疫苗的優(yōu)點

DNA疫苗是一種最常見的基因疫苗，將含編碼某種外源蛋白基因的質粒DNA直接導入動物組織機體內，外源基因于體細胞中表達，其表達產(chǎn)物為病原體的有效抗原成分，可刺激機體產(chǎn)生相應的抗體和細胞毒性T淋巴細胞，分別介導體液免疫和細胞免疫應答。DNA疫苗作為第三代疫苗，與第一代疫苗(減毒、滅活疫苗)及第二代疫苗(亞單位疫苗)相比，具有以下優(yōu)勢[8]：制備簡便，成本低廉；穩(wěn)定性及安全性更好；可將編碼不同抗原的基因構建在同一個質粒中或將不同的抗原基因的多種重組質粒聯(lián)合應用，制備多價核酸疫苗；可持續(xù)誘導體液及細胞免疫應答；預防和治療作用兼顧。

2 結核病DNA疫苗

1994年英國Lowrie等[9]首先報道將編碼麻風分枝桿菌熱激蛋白 (heat shock proteins,HSP)65基因的重組質粒DNA肌內注射免疫小鼠，然后用結核分枝桿菌攻擊，結果細胞免疫功能顯著增強，肝臟菌落形成單位顯著減少，表明DNA疫苗與常規(guī)卡介苗有相似的保護作用。從此，DNA疫苗成為防治結核病研究的新熱點。

1998年隨著英國Sanger中心和法國Paeteur研究所科學家對結核分枝桿菌H37Rv株的全基因組測序工作的圓滿完成，為尋找結核DNA疫苗的研究提供了極好的機遇[10-11]。結核分枝桿菌全基因組序列由4 411 529 bp組成，包括4411個基因，具有潛在編碼能力的基因約有3977個，約占90.2%。結核DNA疫苗所插入的目的基因應選擇具有免疫保護性的抗原序列，從中篩選保護力強的作為候選基因。在這二十幾年中，有許多結核病DNA疫苗在動物實驗中獲得了較理想的效果，主要包括Ag85復合物、6×103早期分泌性抗原靶(6×103Da early secretory antigenic target,ESAT6)、結核分枝桿菌分泌蛋白64(mycobacterium tuberculosis secreted proteins 64,MPT64)、HSP65、HSP70等。也有一些新型的結核病DNA疫苗取得了一定的成果。

2.1傳統(tǒng)的結核病DNA疫苗

2.1.1Ag85復合物 Ag85復合物是結核分枝桿菌和卡介苗中的主要分泌性蛋白，在結核分枝桿菌H37Rv株中占分泌蛋白總量的30%，是一組重要的分枝桿菌分泌蛋白。Ag85復合物是由Ag85A、Ag85B、Ag85C三個亞單位組成，有研究表明Ag85A和Ag85B的可誘導較強的Th1免疫反應，干擾素γ、白細胞介素2和腫瘤壞死因子α顯著升高，而Ag85C卻無此效應[8]。Ag85A是一種纖維連接蛋白，相對分子質量是32×103，三者中分泌量較高。Wang等[12]在研究動物實驗中表明，Ag85A DNA疫苗能誘導強烈的免疫反應：Th1型細胞因子(干擾素γ和白細胞介素2)的顯著分泌，并且在調節(jié)大量免疫細胞激活及誘導細胞毒性細胞在清除病毒或者細菌中發(fā)揮重要的作用，本實驗室用生理鹽水、空載體組、微卡菌苗、Ag85A DNA疫苗分別肌內注射免疫小鼠，酶聯(lián)免疫吸附測定法測定產(chǎn)生的干擾素γ高于其他組，白細胞介素4最低。Liang等[13]通過構建多重耐藥結核病菌株的小鼠模型，用不同組疫苗治療，最后單獨使用Ag85A DNA疫苗組與利福平或吡嗪酰胺聯(lián)合治療組降低了肺、脾的細菌載量，表明Ag85A DNA疫苗對多重耐藥結核病菌株也有一定的治療作用。

Ag85B抗原具有較高的免疫原性，免疫接種Ag85B抗原，可以保護小鼠和豚鼠避免結核分枝桿菌引起的相關炎性反應[14]。用Ag85B DNA疫苗免疫小鼠，結果顯示由CD4+T細胞產(chǎn)生的干擾素γ顯著增高，并且控制了巨噬細胞內的結核分枝桿菌的增長，對感染結核分枝桿菌的小鼠起到了保護性作用[15]。

2.1.2ESAT-6、MPT64 ESAT6和MPT64都是結核分枝桿菌早期分泌濾液蛋白中的主要成分，也是重要的T細胞抗原。Kamath等[16]將MPT64、Ag85B和ESAT-6這3種分泌性抗原基因分別導入pJW4303載體中，構建成pJI23(DNA-64)、pJI30(DNA-85B)和pJIE6(DNA-E6)重組質粒，并且以PBS、pJW4303載體和卡介苗作為對照組，分別肌內注射免疫C57BL/6J鼠3次，每3周1次，MPT64、Ag85B DNA疫苗組的小鼠脾淋巴細胞明顯增殖并產(chǎn)生高水平干擾素γ，但不產(chǎn)生白細胞介素4，隨后第3次免疫小鼠后4周用結核分枝桿菌氣霧攻擊后，小鼠肺菌落計數(shù)顯示，Ag85B DNA疫苗的保護力最強，其次為ESAT6 DNA疫苗，MPT64 DNA疫苗次之，但三者均比卡介苗的保護力差。吳雪瓊等[17]用生理鹽水(A)、載體JW4303質粒(B)和卡介苗(C)為對照，MPT64 DNA疫苗組(D)和ESAT6 DNA(E)疫苗組免疫小鼠，最后1次DNA免疫后3周腹腔內注射結核分枝桿菌H37Rv株菌懸液，結核分枝桿菌攻擊5周后，B、C、D和E組脾菌落數(shù)均顯著少于A組；結核分枝桿菌攻擊10周后，從肺菌落數(shù)由低到高依次是C

2.1.3HSP65、HSP70 HSP65、HSP70都屬于HSP家族，在結構上都是高度保守的蛋白質，并且在結核分枝桿菌感染過程中，是機體對抗其入侵的重要的免疫保護性抗原，它們既能增強機體的免疫應答，又保持了分枝桿菌抗原特性與免疫佐劑的作用，并且還具有分子伴侶的作用，可協(xié)助表達蛋白質的折疊，在結核分枝桿菌感染的后期發(fā)揮作用。Lowrie等[9]最先報道以麻風分枝桿菌HSP65質粒DNA免疫小鼠，然后用結核分枝桿菌或卡介苗攻擊，結果顯示，HSP65質粒DNA能顯著增強細胞免疫功能，肝臟菌落計數(shù)顯著減少。Lowrie等[18]首次將HSP65、HSP70 DNA疫苗用于治療BALB/c小鼠結核病模型中，實驗以生理鹽水、空質粒載體和卡介苗為對照組，用pcDNA3.0-HSP65和pcDNA3.0-HSP70重組質粒免疫小鼠，HSP65、HSP70 DNA疫苗誘導產(chǎn)生的γ干擾素水平顯著高于對照組，產(chǎn)生的白細胞介素4也顯著低于其他各組(P<0.05)；從小鼠的脾、肺菌落計數(shù)來看HSP65 DNA疫苗組最低，HSP70 DNA疫苗次之，先將結核小鼠經(jīng)化療12周后做菌落計數(shù)，再用生理鹽水、空載體質粒、HSP65 DNA疫苗間隔2周免疫小鼠3次，第24周用地塞米松治療1次，8周后再做菌落計數(shù)，結果顯示，HSP65 DNA疫苗可使小鼠結核病化療后脾和肺內殘余的菌數(shù)顯著減少。Silva等[19]用HSP65 DNA疫苗結合化療藥物治療BALB/c小鼠結核病，1個月就可顯著減少肺和脾結核分枝桿菌載量，6個月后肺中未檢測到結核分枝桿菌；同時還發(fā)現(xiàn)HSP65聯(lián)合化療藥物治療對結核分枝桿菌敏感株H37Rv和耐藥株同樣有效。

2.2新型的結核病DNA疫苗

2.2.1Rv3407 結核分枝桿菌RV3407基因由300 bp組成，編碼一個由99個氨基酸組成的蛋白質，分子質量為11.0096×103。Rv3407蛋白是結核分枝桿菌在生長過程中分泌到細胞外的分泌蛋白，主要在結核分枝桿菌休眠期表達，是一種潛伏相關抗原，此抗原受兩種復蘇促進因子的調控[20]。Schuck等[21]研究35個結核潛伏期相關抗原和ESAT6/培養(yǎng)濾液蛋白融合抗原、純蛋白衍生物刺激活動性肺結核患者和結核潛伏感染者T淋巴細胞產(chǎn)生的免疫反應和細胞因子，結果顯示，其中7種結核潛伏期相關抗原(Rv3407、Rv1733c、Rv2003、Rv2005c、Rv0140、Rv1009和Rv2450c)能刺激T淋巴細胞產(chǎn)生較強的反應，尤其是Rv3407特異的T淋巴細胞反應在結核潛伏感染患者中可廣泛檢出，而在活動性肺結核患者中未檢出，在個體中檢測Rv3407特異的T淋巴細胞干擾素γ反應可有效地鑒別結核病患者和結核潛伏感染者，其一致率達83%。

Mollenkopf等[22]對結核分枝桿菌H37Rv和卡介苗菌株的蛋白質采用比較蛋白質組學技術進行分析，從而挑選表達不同的蛋白質基因作為候選的DNA疫苗(至少60個蛋白在兩菌株中表達不同[23])，鑒定了其中36個基因作為候選的結核分枝桿菌DNA疫苗，通過應用氣溶膠法制備的小鼠結核模型進一步研究其保護效力，結果發(fā)現(xiàn)候選者Rv3407 DNA疫苗具有強而的免疫保護效力，可誘導小鼠產(chǎn)生高水平的干擾素γ。此外，通過卡介苗初免、Rv3407 DNA疫苗加強的異源性初免加強策略，其產(chǎn)生的抗結核感染的免疫保護效力優(yōu)于卡介苗單獨免疫。

劉蓉娜等[24]以基因重組卡介苗AERAS-422基因組為模板，通過聚合酶鏈反應擴增獲得長300 bp的Rv3407基因片段，成功地構建了真核表達質粒pVAX1-Rv3407，轉染293T細胞48 h后，采用免疫熒光法及蛋白質印跡法檢測到Rv3407蛋白在293T細胞中有表達，表明該質粒可通過宿主細胞的轉錄系統(tǒng)表達蛋白抗原。Rv3407 DNA疫苗能誘導宿主產(chǎn)生細胞免疫應答和體液免疫應答，為新型結核疫苗的研制奠定了基礎。

2.2.2Rv1733c Rv1733c是結核分枝桿菌在休眠期表達量比較高的一種保守的跨膜蛋白[25]。Gillian等[26]在南非、岡比亞和烏干達這三個結核高負擔國家中研究7個經(jīng)典的結核分枝桿菌重組蛋白抗原和51個休眠調節(jié)子編碼的結核分枝桿菌重組蛋白抗原刺激人機體產(chǎn)生的免疫應答情況，發(fā)現(xiàn)Rv1733c抗原是這三種人群中被識別頻率最高的一個潛伏相關蛋白抗原，并且應用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測全血中分泌的干擾素γ量也較高。Bivas-Benita等[27]用PLGA-PEI np載入pV1J.ns-tPA質粒載體中與Rv1733c連接，構建了Rv1733c DNA疫苗，每間隔3周肌內注射免疫BALB/c小鼠1次，共3次，第3次免疫后3周，再用Rv1733c蛋白加不完全弗氏佐劑進行加強免疫一次，結果顯示，Rv1733c DNA疫苗組的脾淋巴細胞增殖顯著高于空載體組，干擾素γ水平也顯著增加；并且在最后用蛋白加強免疫后脾淋巴細胞的增殖和干擾素γ分泌都顯著增強。Roupie等[28]將8個休眠調節(jié)子基因編碼的結核分枝桿菌抗原(Rv1733c、Rv1738、Rv2029c、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c和Rv2628)與DNA載體pV1J.ns-tPA連接，分別肌內注射免疫BALB/c和C57BL/6J小鼠，用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測Rv1733c DNA疫苗組小鼠血清中可產(chǎn)生較高水平的免疫球蛋白G抗體，但脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中分泌的Th1型細胞因子干擾素γ和白細胞介素2較少。Rv1733c DNA疫苗能誘導宿主產(chǎn)生較強的體液免疫應答，而Th1型細胞免疫應答的結果尚不一致，是否可作為新型結核疫苗的侯選者尚需進一步研究。

2.2.3Rv3872 RD1(region of difference-1)區(qū)基因僅存在于致病性結核分枝桿菌基因組中，而在卡介菌中缺失。RD1區(qū)全長9.5 kb，有9個開放讀碼框(Rv3871～Rv3879c)，共編碼9個蛋白質，其中Rv3872編碼蛋白為PE35，是PE蛋白家族成員之一。PE蛋白質家族是一個富含甘氨酸的蛋白質家族，該家族蛋白質在結核抗原變異中扮演著非常重要的角色。Hanif等[29]將PE35基因克隆到DNA疫苗載體pUMVC6中，構建成pUMVC6-PE35重組質粒，肌內注射BALB/c小鼠，3周后最后一次免疫接種，將小鼠處死，進行脾淋巴細胞培養(yǎng)，結果顯示，PE35 DNA疫苗組的脾淋巴細胞顯著增殖，并且分泌大量Th1型細胞因子干擾素γ，而Th2型細胞因子白細胞介素5和抗炎細胞因子白細胞介素10未檢測到，此外，他們又合成6個不同的PE35多肽(P1-P6)，對PE35 T細胞表位進行了預測，結果顯示，多肽P1、P3、P4和P5均可刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖，其中多肽P4(VSAQAATAFTSEGIQLLASNAQD)脾淋巴細胞增殖最顯著；多肽P1、P3和P6可刺激小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生干擾素γ，其中多肽P6(GEAVQDVARTYSQIDDGAAGVFAE)產(chǎn)生的干擾素γ最多；所有多肽刺激小鼠脾淋巴細胞均未檢測到白細胞介素5和白細胞介素10的分泌。這些結果表明，PE35 DNA疫苗主要誘導 Th1型免疫，PE35不同的抗原表位可誘導產(chǎn)生不同強度的T細胞反應，PE35 DNA疫苗可能作為一種新的結核病候選疫苗。

3 小 結

隨著耐多藥結核病及廣泛耐藥結核病患者逐漸增多，再加上高病死率的人類免疫缺陷病毒感染，因此選擇一種有效地控制和預防結核病發(fā)生的具有安全、經(jīng)濟、高效的結核疫苗就顯得至關重要。雖然結核DNA疫苗以其無比的優(yōu)勢已成為研究熱點，包括多價的DNA疫苗、卡介苗初免DNA疫苗加強免疫、DNA疫苗與細胞因子聯(lián)合免疫等，但其仍存在一些不可避免的問題，如抗原基因的選擇、載體的構建、免疫途徑和免疫程序的選擇、免疫佐劑的使用、安全性、免疫耐受性等。隨著對結核桿菌致病的免疫機制的進一步研究和闡述，基因組學和蛋白質組學研究的深入，相信這些問題都將解決，DNA疫苗會以其他疫苗無可比擬的優(yōu)勢給結核患者帶來希望。

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