師迎旭(綜述)，蘇秀蘭(審校)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，呼和浩特 010050)

自1979年以來，p53被證實(shí)主要在維護(hù)基因組的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。目前，p53在其他方面的作用也逐步被發(fā)現(xiàn)[1]。激活的p53可以抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)和分化受損。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的p53靶基因超過16個，但目前仍不清楚哪一個是起決定作用的。p53能激活多條信號途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡：Fas、PIDD、DR5；Bax、Noxa、p53基因上調(diào)凋亡調(diào)控因子(the p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)、p53AIP；PIGs；Soctin、PERP、PAG608、Siah；IGF-BP3。關(guān)于p53基因如何抑制腫瘤的發(fā)展仍是研究的熱點(diǎn)。

1 p53的凋亡通路

腫瘤抑制基因p53和原癌基因Bcl-2是p53凋亡通路中兩個最早被確定的基因。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這兩種基因和蛋白之間具有很強(qiáng)的遺傳和生理關(guān)系。越來越多的報(bào)道顯示，p53主要通過與Bcl-2家族蛋白相互作用發(fā)揮促凋亡與抗凋亡的功能[2]。Bcl-2最初是在非霍奇金濾泡狀B細(xì)胞淋巴瘤中分離并命名的。Bcl-2家族成員具有較高的同源性，具有一個或多個Bcl-2的同源性(Bcl-2 homology，BH)結(jié)構(gòu)域(BH1、BH2、BH3、BH4)，可以形成異二聚體。根據(jù)作用其可分為兩類：①抗凋亡作用，如Bcl-2、Bcl-xL、髓細(xì)胞白血病基因1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)、Bcl-w、秀麗線蟲基因9等；②促凋亡成員，如Bax、Bak、PUMA、Noxa、Bim、Bcl-xs、Bad、Bik、Bid等?？沟蛲龊痛俚蛲黾易宓鞍字g平衡的改變決定了細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡過程。

促凋亡的Bcl-2蛋白家族成員共同含有BH3結(jié)構(gòu)域(BH3-only)，能夠編碼Bid。接受凋亡信號后，Bid與Bcl-2家族蛋白Bax和Bak相互作用，使Bax蛋白嵌入到線粒體外膜中，增強(qiáng)線粒體外膜的通透性，導(dǎo)致釋放細(xì)胞色素C和其他促凋亡因子,如第二線粒體衍生的胱天蛋白酶(caspase)激活劑/低等電點(diǎn)凋亡抑制蛋白直接結(jié)合蛋白的釋放[3]。Bid可誘導(dǎo)Bcl-2或Bcl-xL釋放出Bid和Bim促進(jìn)凋亡。p53蛋白在細(xì)胞應(yīng)急情況下被激活，同樣具有BH3-only相似的功能和轉(zhuǎn)錄因子作用，p53致Bid的表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)下游靶基因參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程調(diào)。此外，在細(xì)胞凋亡中p53還具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄作用。p53通過與Bax的相互作用，促進(jìn)Bax的活化和Bax蛋白插入到線粒體膜中，使線粒體通透性增加。

2 PUMA對于p53凋亡通路的調(diào)控

Bcl-2在細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制中起著十分重要的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Noxa和PUMA(bbc3)編碼的BH3也較為重要[4-6]。PUMA和Noxa基因的轉(zhuǎn)錄均受p53正性調(diào)控，參與全部的p53介導(dǎo)的凋亡信號。Noxa由PMAIP1(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酰引導(dǎo)蛋白1)基因編碼，具有2個BH3結(jié)構(gòu)域，可以泛素化降解Mcl-1[7]。X射線照射小鼠后可激活依賴p53的凋亡途徑，從而誘導(dǎo)Noxa表達(dá)。Noxa是唯一編碼BH3的Bcl-2家族成員，只具有BH3區(qū)域，而沒有其他BH域。研究發(fā)現(xiàn)，Noxa在非依賴p53的凋亡途徑中起重要作用[8]。Noxa通過介導(dǎo)非p53的凋亡過程，經(jīng)BH3與線粒體和抗凋亡的Bcl-2家族成員相互作用，直接激活Noxa及其他凋亡蛋白，導(dǎo)致caspase-9的激活，但此過程并不會增強(qiáng)PUMA水平。

PUMA是于2001年被發(fā)現(xiàn)的一種具有促凋亡作用的p53靶基因，高度保守[9-11]。PUMA在正常狀況下低表達(dá)，應(yīng)激后可以迅速誘導(dǎo)激活PUMA，參與p53依賴性和非依賴性細(xì)胞凋亡過程，受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，而不是翻譯后修飾調(diào)控。被激活后，PUMA與抗凋亡Bcl-2家族成員相互作用，從而釋放Bax和(或)Bak，啟動線粒體凋亡信號。線粒體功能障礙將激活caspase級聯(lián)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)證明，PUMA在DNA損傷激活的p53介導(dǎo)的凋亡途徑中更為重要，而Noxa作用相對有限[12]。PUMA具有4種亞型(α、β、γ、δ)，其中γ、δ缺少BH3結(jié)構(gòu)域，無法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。PUMA的促凋亡作用：一方面，PUMA介導(dǎo)p53依賴的所有凋亡信號[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡過程中，p53和PUMA啟動子上p53結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合是必不可少的[17]。PUMA的啟動子具有兩個p53結(jié)合區(qū)，對于PUMA與p53的結(jié)合，PUMA的活化至關(guān)重要。p53與PUMA啟動子的結(jié)合有利于核心組蛋白的修飾，如乙?；M蛋白H3和H4，促進(jìn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)開放和轉(zhuǎn)錄激活。PUMA基因缺失的動物或細(xì)胞，導(dǎo)致p53喪失誘導(dǎo)凋亡功能，而其他的p53靶基因(如Bak基因)缺失，不會阻礙p53的誘導(dǎo)凋亡作用。小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，盡管僅剔除PUMA能夠抵制etoposide(拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑足葉乙苷)與γ射線的促凋亡作用，不會使淋巴細(xì)胞死亡，但Noxa或PUMA的任何一個因子的降解都會減少成纖維細(xì)胞中由于DNA降解引起的細(xì)胞凋亡[14]。另一方面，PUMA可介導(dǎo)p53非依賴的凋亡信號[18-20]。缺少PUMA，人結(jié)腸癌細(xì)胞的p53依賴凋亡過程被抑制。缺失PUMA的淋巴細(xì)胞還可以抵制細(xì)胞因子缺失、地塞米松、星形孢菌素引發(fā)的凋亡過程[21-24]。PUMA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可通過激活多種凋亡蛋白如Bax和(或)通過其抗凋亡的Bcl-2家族成員，從而引發(fā)線粒體功能障礙和caspase激活。PUMA也可以直接激活Bax/Bak或細(xì)胞質(zhì)的p53誘導(dǎo)的線粒體功能障礙，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑。此外，PUMA也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白的下游分子，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[25-26]。

3 MCL-1對于p53凋亡通路的調(diào)控

研究顯示，PUMA對于細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要作用，它除了受p53的調(diào)控，還受其他因子的調(diào)節(jié)，如MCL-1[27-28]。MCL-1屬于抗凋亡Bcl-2家族蛋白的一員，通過不同的剪接方式可生成兩種變體：選擇性剪接較長的變體(異構(gòu)體1)可通過抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的存活；而剪接較短的變體(異構(gòu)體2)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡和死亡誘導(dǎo)。MCL-1可以作為上游的分子，通過阻止細(xì)胞色素C的釋放從而阻斷多種凋亡誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，然而MCL-1抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚未闡述清楚。研究顯示，缺失MCL-1可以破壞p53-Bak復(fù)合物的形成，過表達(dá)MCL-1可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生存[29]。MCL-1是一個很不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，它的快速誘導(dǎo)表達(dá)和降解表明，它在細(xì)胞為適應(yīng)周圍環(huán)境迅速變化的凋亡調(diào)控中具有重要作用。其蛋白表達(dá)水平受到極其嚴(yán)格而復(fù)雜的調(diào)控，提示其在細(xì)胞受到應(yīng)激發(fā)生變化時(shí)，對細(xì)胞的存活與否發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

4 MCL-1與PUMA在p53凋亡通路中的作用

MCL-1可以直接或間接地激活Bcl-2家族促凋亡蛋白Bak與Bax抑制細(xì)胞凋亡。MCL-1通過與Bim或Bak形成異源二聚體中和凋亡蛋白的作用，抑制細(xì)胞色素C的釋放及細(xì)胞凋亡。MCL-1可以通過BH1結(jié)構(gòu)域和PUMA的BH3結(jié)構(gòu)域相互作用，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中抑制MCL-1可以通過上調(diào)PUMA來激活Bak與Bax。另外，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體可以通過死亡受體途徑激活caspase-8和caspase-3，而活化的caspase-8或caspase-3可以切割抗凋亡的MCL-1，當(dāng)MCL-1被切割后，將阻止與促凋亡的Bcl-2家族成員(如Bim)間形成復(fù)合體，最終通過線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26,30-31]。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，MCL-1和PUMA共同定位于線粒體，表明MCL-1和PUMA在線粒體上結(jié)合[32]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MCL-1可以抑制PUMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且MCL-1的BH1結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄淇筆UMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著重要的作用[33]。MCL-1的蛋白穩(wěn)定性可以被PUMA提高，而且這種MCL-1蛋白穩(wěn)定性的提高是由于和PUMA的直接結(jié)合所致。研究顯示，將PUMA的BH3結(jié)構(gòu)域去除之后，PUMA失去提高M(jìn)CL-1蛋白穩(wěn)定性的功能；同時(shí)也證明了PUMA結(jié)合MCL-1只能部分阻止MCL-1的快速降解，提示除了PEST(為一富含脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸的約10個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)序列)和BH1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)MCL-1的快速降解，還存在其他降解信號，而且位于MCL-1蛋白的C末端[34]。該項(xiàng)研究闡明了Mcl-1可以與PUMA相互作用，而且提示MCL-1可能通過與PUMA結(jié)合而提高自身穩(wěn)定性，最終行使抗凋亡的功能[35-36]。在紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程早期，p53能被激活，并作為一個轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)多種與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。細(xì)胞接受凋亡刺激后，胞內(nèi)p53水平增加，進(jìn)入胞質(zhì)p53與MCL-1競爭結(jié)合Bak，使MCL-1釋放Bak，引起B(yǎng)ak寡聚化，MCL-1缺乏。Bak的寡聚化能增加線粒體外膜通透性，最終激活線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[37]。

作為一種腫瘤抑制基因，p53的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長停滯和凋亡，通過平衡這兩種細(xì)胞的生命活動，最終決定細(xì)胞的命運(yùn)。不同于其他的腫瘤抑制基因，大多數(shù)腫瘤中的p53突變的錯義類型，會導(dǎo)致單個氨基酸的變化，影響蛋白質(zhì)上的DNA結(jié)合域，表明與DNA序列特異性結(jié)合是抑制p53活性與逃脫腫瘤命運(yùn)的關(guān)鍵。

5 小 結(jié)

p53被證明在多種凋亡刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，但是它的誘導(dǎo)凋亡的潛在機(jī)制還不明確。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)p53的下游分子PUMA誘導(dǎo)凋亡功能十分重要，具有重要的促凋亡作用。通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，激活caspase-9從而引發(fā)凋亡。PUMA的缺失能夠阻礙DNA損傷，激活p53引發(fā)的凋亡過程。此外，PUMA的缺失也可以抑制多種凋亡因子的誘導(dǎo)凋亡途徑。p53的另一個下游分子MCL-1是一個抗凋亡分子，通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，抑制caspase-9，從而阻礙凋亡的發(fā)生。Mcl-1與PUMA可以在線粒體通過Bcl-2家族蛋白的BH結(jié)構(gòu)域(BH1與BH3)發(fā)生相互作用，通過相互作用可以提高M(jìn)cl-1的穩(wěn)定性，最終抑制細(xì)胞的凋亡途徑。當(dāng)細(xì)胞受到刺激損傷時(shí)，會引發(fā)p53的凋亡通路，p53通過PUMA促進(jìn)細(xì)胞凋亡；如果細(xì)胞癌變，則細(xì)胞就會逃離凋亡的命運(yùn)，p53可能會通過調(diào)節(jié)Mcl-1的活性，阻礙細(xì)胞的凋亡過程，但具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

[1] Reed JC.Double identity for proteins of the Bcl-2 family[J].Nature,1997,387(6635):773-776.

[2] Cheok CF,Verma CS,Baselga J,etal.Translating p53 into the clinic[J].Nat Rev Clin Oncol,2011,8(1):25-37.

[3] Stamelos VA,Redman CW,Richardson A.Understanding sensitivity to BH3 mimetics:ABT-737 as a case study to foresee the complexities of personalized medicine[J].J Mol Signal,2012,7(1):1-15.

[4] Yu ZD,Wang H,Zhang LB,etal.Both p53-PUMA/NOXA-Bax-mitochondrion and p53-p21cip1 pathways are involved in the CDglyTK-mediated tumor cell suppression[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,386(4)：607-611.

[5] Park SY,Jeong MS,Jang SB.In vitro binding properties of tumor suppressor p53 with PUMA and NOXA[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,420(2):350-356.

[6] Happo L,Cragg MS,Phipson B,etal.Maximal killing of lymphoma cells by DNA damage-inducing therapy requires not only the p53 targets Puma and Noxa,but also Bim[J].Blood,2010,116(24):5256-5267.

[7] Nakajima W,Tanaka N.Noxa induces apoptosis in oncogene-expressing cells through catch-and-release mechanism operating between Puma and Mcl-1[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,413(4):643-648.

[8] Elmore S.Apoptosis:a review of programmed cell death[J].Toxicol Pathol,2007,35(4):495-516.

[9] Han J,Flemington C,Houghton AB,etal.Expression of bbc3,a pro-apoptotic BH3-only gene,is regulated by diverse cell death and survival signals[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(20):11318-11323.

[10] Yu J,Zhang L,Hwang PM,etal.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells[J].Mol Cell,2001,7(3):673-682.

[11] Nakano K,Vousden KH.PUMA,a Novel proapoptotic gene,is induced by p53[J].Mol Cell,2001,7(3):683-694.

[12] Michalak EM,Villunger A,Adams JM,etal.In several cell types tumour suppressor p53 induces apoptosis largely via Puma but Noxa can contribute[J].Cell Death Differ,2008,15(6):1019-1029.

[13] Kuwana T,Newmeyer DD.Bcl-2-family proteins and the role of mitochondria in apoptosis[J].Curr Opin Cell Biol,2003,15(6):691-699.

[14] Yu J,Zhang L.No PUMA,no death:implications for p53-dependent apoptosis[J].Cancer Cell,2003,4(4):248-249.

[15] Lai CY,Tsai AC,Chen MC,etal.Aciculatin induces p53-dependent apoptosis via MDM2 depletion in human cancer cells in vitro and in vivo[J].PloS One,2012,7(8):e42192.

[16] Thakur VS,Ruhul Amin AR,Paul RK,etal.p53-dependent p21-mediated growth arrest pre-empts and protects HCT116 cells from PUMA-mediated apoptosis induced by EGCG[J].Cancer Lett,2010,296(2):225-232.

[17] Galehdar Z,Swan P,Fuerth B,etal.Neuronal apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress is regulated by ATF4-CHOP-mediated induction of the Bcl-2 homology 3-only member PUMA[J].J Neurosci,2010,30(50):16938-16948.

[18] Fricker M,Papadia S,Hardingham GE,etal.Implication of TAp73 in the p53-independent pathway of Puma induction and Puma-dependent apoptosis in primary cortical neurons[J].J Neurochem,2010,114(3):772-783.

[19] Gomes NP,Espinosa JM.Gene-specific repression of the p53 target gene PUMA via intragenic CTCF-Cohesin binding[J].Genes Dev,2010,24(10):1022-1034.

[20] Qiu W,Wu B,Wang X,etal.PUMA-mediated intestinal epithelial apoptosis contributes to ulcerative colitis in humans and mice[J].J Clin Invest,2011,121(5):1722-1732.

[21] Li YZ,Liu XH.Advance in PUMA and cardiomyocyte apoptosis[J].Prog Biochem Biophys,2012,39(11):1045-1049.

[22] Levine AJ,Oren M.The first 30 years of p53:growing ever more complex[J].Nat Rev Cancer,2009,9(10):749-758.

[23] Lane D,Levine A.p53 research:the past thirty years and the next thirty years[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2010,2(12):a000893.

[24] Feng ZH,Wu R,Lin NH,etal.Tumor suppressor p53:new functions of an old protein[J].Front Biol(Beijing)，2011,6(1):58-68.

[25] Wang P,Yu J,Zhang L.The nuclear function of p53 is required for PUMA-mediated apoptosis induced by DNA damage[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(10):4054-4059.

[26] Zhang Y,Xing D,Liu L.PUMA promotes Bax translocation by both directly interacting with Bax and by competitive binding to Bcl-XL during UV-induced apoptosis[J].Mol Biol Cell,2009,20(13):3077-3087.

[27] Jiang T,Guo Z,Dai B,etal.Bi-directional regulation between tyrosine kinase Etk/BMX and tumor suppressor p53 in response to DNA damage[J].J Biol Chem,2004,279(48):50181-50189.

[28] Elkholi R,Floros KV,Chipuk JE.The role of BH3-only proteins in tumor cell development,signaling,and treatment[J].Genes Cancer,2011,2(5):523-537.

[29] Merwin EA.A C-terminus mitochondrial-localization region and BH3 Domain of Puma are required for apoptotic function[D].Canada:The University of Western Ontario,2013.

[30] Bolesta E,Pfannenstiel LW,Demelash A,etal.Inhibition of mcl-1 promotes senescence in cancer cells:implications for preventing tumor growth and chemotherapy resistance[J].Mol Cell Biol,2012,32(10):1879-1892.

[31] Brunelle JK,Ryan J,Yecies D,etal.MCL-1-dependent leukemia cells are more sensitive to chemotherapy than BCL-2-dependent counterparts[J].J Cell Biol,2009,187(3):429-442.

[32] Kim JY,Ahn HJ,Ryu JH,etal.BH3-only protein Noxa is a mediator of hypoxic cell death induced by hypoxia-inducible factor 1α[J].J Exp Med,2004,199(1):113-124.

[33] Ekoff M,Kaufmann T,Engstr?m M,etal.The BH3-only protein Puma plays an essential role in cytokine deprivation-induced apoptosis of mast cells[J].Blood,2007,110(9):3209-3217.

[34] Han J,Goldstein LA,Hou W,etal.Regulation of mitochondrial apoptotic events by p53-mediated disruption of complexes between antiapoptotic Bcl-2 members and Bim[J].J Biol Chem,2010,285(29):22473-22483.

[35] Arbour N.Bcl-2 Family members PUMA,Noxa and Mcl-1,in P53 mediated neuronal cell death[D].Canada:University of Ottawa,2007.

[36] Arbour N,Vanderluit JL,Le Grand JN,etal.Mcl-1 is a key regulator of apoptosis during CNS development and after DNA damage[J].J Neurosci,2008,28(24):6068-6078.

[37] Han J,Goldstein LA,Gastman BR,etal.Interrelated roles for Mcl-1 and BIM in regulation of TRAIL-mediated mitochondrial apoptosis[J].J Biol Chem,2006,281(15):10153-10163.