王景尚 黃 燁 殷惠軍 陳可冀

糖尿病(DM)是繼腫瘤、心血管疾病之后發(fā)病率居世界第3位的慢性病，嚴重威脅人類的健康和生命。如何有效遏制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，已成為國內(nèi)外亟待解決的重大科學問題。良好的血糖控制是防止糖尿病及其晚期并發(fā)癥的有效途徑。流行病學調(diào)查證實，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展不僅與血糖整體水平升高有關，而且與血糖波動密切相關［1］。血糖波動幅度是獨立于HbA1c之外的另一重要的血糖控制評價指標，同時也是糖尿病患者心血管事件發(fā)生與死亡的獨立危險因素和預測因子［2］。因此，血糖波動相關研究已成為近年來糖尿病及其并發(fā)癥防治研究的熱點之一。

實驗模型是連接基礎和臨床的橋梁與紐帶，不僅是進行有效藥物篩選及藥物作用機制深入研究的重要手段，同時也是深化臨床認識，“從臨床到實驗室，再從實驗室到臨床”，實現(xiàn)醫(yī)學轉(zhuǎn)化不可或缺的重要組成部分。近年來，不少學者對糖尿病血糖波動實驗模型進行了深入探討并取得了一定進展，為進一步明確血糖波動對糖尿病的影響及其作用機制提供了實驗依據(jù)，同時也為藥物研發(fā)提供了思路。

一、血糖波動的評價標準

評價標準的確立是成功建立實驗模型的前提和依據(jù)。血糖波動評價標準是糖尿病血糖波動模型成功建立的關鍵環(huán)節(jié)。一直以來，HbA1c一直作為評價糖尿病患者血糖控制的金標準［3］。然而，HbA1c值相同并不等于全天血糖譜相同，HbA1c相似的DM患者血糖波動性可能不同［2］。因此，全面認識血糖就必須在重視血糖均值的同時，關注血糖波動性。目前，評估血糖波動性的參數(shù)主要從日內(nèi)血糖波動、日間血糖波動、進餐相關性血糖波動和嚴重低血糖危險等4個方面進行［4］。日內(nèi)血糖波動的評價參數(shù)包括血糖水平的標準差(SDBG)、最大血糖波動幅度(LAGE)、血糖波動于某一范圍的時間百分比、曲線下面積或頻數(shù)分布、M值和平均血糖波動幅度(MAGE)等。日間血糖波動的評價參數(shù)主要包括日間血糖平均絕對差(MODD)和空腹血糖變異系數(shù)(FPG－CV)。餐后血糖波動的評價參數(shù)包括平均進餐波動指數(shù)(MIME)和餐后血糖的時間與曲線下面積增值(IAUC)，嚴重低血糖危險的評價指標為低血糖指數(shù)(LBGI)。在臨床應用中，應根據(jù)實際需要的不同和參數(shù)各自的特點進行合理選擇，并將血糖波動幅度與空腹血糖、餐后兩小時血糖及HbA1c進行綜合考慮，才能全面認識血糖，進而更好地干預和預防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。

二、血糖波動實驗模型研究現(xiàn)狀

以血糖波動評價標準為依據(jù)，研究者在血糖波動模型建立方面進行了一定探索，主要分為細胞和動物實驗模型兩種。

1．細胞實驗模型:目前細胞實驗模型均通過間斷給予不同濃度的葡萄糖造成日內(nèi)血糖波動和日間血糖波動，從而模擬機體的血糖波動狀態(tài)。但由于實驗對象和目的的不同，在葡萄糖濃度，波動時間間隔、頻率、持續(xù)時間以及波動次數(shù)上存在一定差異。綜合目前研究，主要有以下幾種方法:(1)意大利Morpurgo－Hofman衰老研究實驗室是全世界最早進行血糖波動細胞實驗研究的單位。借助人臍靜脈內(nèi)皮細胞，通過間斷給予含有5mmol/L和20mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，每24h更換1次，采用日間血糖波動的方式建立血糖波動模型，干預14天，血糖波動14次［5］。近10年來運用該模型在波動高糖加重內(nèi)皮損傷、炎癥反應和氧化應激等方面取得了重要進展。(2)Giannini等［6］通過對胎兒神經(jīng)上皮細胞間斷給予含有10mmol/L和20mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，每24h更換1次，建立血糖波動模型，觀察了血糖波動在糖尿病神經(jīng)病變中的重要作用，干預5天，血糖波動5次。(3)Del Guerra等［7］通過對人胰島B細胞間斷給予含有16．7mmol/L和5．5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，每24h更換1次，構建血糖波動模型并證實了格列齊特可顯著減輕血糖波動造成的胰島β細胞的凋亡，干預5天，血糖波動5次。(4)本課題組通過對人臍靜脈內(nèi)皮細胞間斷給予低糖型 DMEM(血糖濃度5.0mmol/L)和高糖型DMEM培養(yǎng)基(25．0mmol/L)，每24h更換1次，建立血糖波動模型，研究了PI3K/Akt信號通路在波動高糖損傷內(nèi)皮中的重要作用及西洋參莖葉總皂苷的保護效應，干預8天，血糖波動8 次［8］。Chen 等［9］采用相同方法探討了波動高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞膜硬化的影響，但干預7天，血糖波動7次。(5)侯志強等［10］通過對大鼠胰島和大鼠胰島瘤細胞(INS－1)細胞間斷給予含有11．1mmol/L和25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，每24h更換1次，建立血糖波動模型并探討血糖波動對大鼠胰島及INS－1細胞的影響，干預72h，血糖波動3次。Shi等［11］觀察了血糖波動對INS－1細胞凋亡的影響，其血糖濃度為 5．5mmol/L 和 33．3mmol/L，每 12h換液一次，觀察72h，血糖波動6次。Cheong等［12］觀察了血糖波動對INS－1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，其換液時間、觀察時間和波動次數(shù)與Shi XL相同，但其血糖濃度為11mmol/L 和 30mmol/L。(6)Sun 等［13］通過對大鼠腎小球間質(zhì)細胞、人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞間斷給予含有5mmol/L和25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，每6h更換1次，建立血糖波動模型，在血糖波動致糖尿病微/大血管病變中的作用機制研究方面取得了豐富成果，干預72h，血糖波動12次［13］。(7)Zhong等［14］觀察了血糖波動對人視網(wǎng)膜周細胞的影響，其血糖濃度為5mmol/L和25mmol/L，每48h換液1次，干預8天，血糖波動4次。(8)Masumoto等［15］觀察了血糖波動對人胎盤絨毛癌細胞的影響，血糖濃度分別為7mmol/L和42mmol/L，每6h更換1次，觀察48h，血糖波動8次。(9)Li－Bo等［16］發(fā)現(xiàn)血糖波動具有促進單核細胞促炎細胞因子釋放的作用，其血糖濃度為5和15 mmol/L，每12h更換1次，干預72h，血糖波動6次。

2．動物實驗模型:糖尿病動物模型包括1型和2型，主要有實驗誘導和自發(fā)性糖尿病動物模型兩大類。其中，自發(fā)性1型糖尿病動物模型包括BB大鼠和NOD小鼠，而2型包括ZDF大鼠、OLETF大鼠、GK大鼠、OB小鼠、T－KK小鼠和NSY小鼠等。實驗誘導性模型制備方法包括胰腺切除術誘導法、化學藥物誘導法、拮抗胰島素因子誘導法、食物誘發(fā)及催肥等，其中以化學藥物誘導法(主要使用鏈脲佐菌素和四氧嘧啶)操作簡單且可行性高，是目前獲得實驗性糖尿病動物模型最常用的方法，其誘導的動物品系包括大鼠、小鼠、犬、猴和豬等。

目前血糖波動動物模型研究有限，現(xiàn)有模型主要是通過飲食干預造成重復餐后高血糖和胰島素注射造成大幅度血糖波動而建立的，動物品系僅限于大鼠和小鼠。具體造模方法主要有以下幾種:(1)Azuma等是較早進行血糖波動動物模型探索的研究者。通過每日定時兩次喂食GK大鼠(非肥胖型的2型糖尿病)的方法誘導重復餐后高血糖而構建血糖波動模型，證實了反復血糖波動具有促進單核與內(nèi)皮細胞黏附、加重大鼠胸主動脈內(nèi)皮損傷的作用，血糖波動12周。(2)Watada等在鏈脲佐菌素(STZ)誘導形成1型糖尿病大鼠模型基礎上，通過每日定時兩次喂食的方法誘導重復餐后高血糖而建立血糖波動模型，證實了血糖波動在糖尿病大血管病變中的促進作用，血糖波動4周。(3)Mita等［17］應用每日定時兩次喂食ApoE基因缺陷小鼠定量麥芽糖的方法誘導反復餐后高血糖制備血糖波動模型，觀察血糖波動對ApoE小鼠動脈粥樣硬化程度的影響，血糖波動6周。(4)Horváth等［18］基于STZ成功誘導1型糖尿病大鼠模型，通過隔日1次注射60U/kg長效胰島素造成血糖控制不良(具有大幅度血糖波動)模型(穩(wěn)定組通過每日1次注射60U/kg中效甘精胰島素嚴格控制血糖)，研究發(fā)現(xiàn)快速血糖波動具有誘導氧化應激和內(nèi)皮損傷的作用，血糖波動30天。(5)涂白青等［19］在四氧嘧啶誘導形成糖尿病1型小鼠模型的基礎上，通過每日3次腹腔注射2g/kg葡萄糖的方式制備血糖波動模型，觀察了血糖波動對小鼠臟器的影響，干預6周。(6)本課題組在高脂飲食聯(lián)合STZ注射成功制備2型糖尿病大鼠模型基礎上，根據(jù)造模成功糖尿病大鼠自身的血糖波動性(主要為FPG－CV)進行分組，觀察了血糖波動對糖尿病大鼠的影響并對相關機制進行了深入探討，血糖波動8周［20］。

三、糖尿病血糖波動模型的思考

建立方便實用、可靠性高、重復性好的血糖波動實驗模型是進行血糖波動機制實驗研究的前提。臨床應用是基礎實驗研究的最終目的和價值體現(xiàn)，因此在實驗中選擇更加貼近臨床的干預條件是實驗研究的基本要求之一。

1．選擇適當?shù)难菨舛群透深A時間:目前細胞實驗研究中高血糖濃度往往在20mmol/L以上，大大超出了一般糖尿病病人的血糖控制范圍，同時存在間隔時間過長，干預時間過短，波動次數(shù)過少的問題，與臨床實際相差較遠。因此，適當降低高血糖濃度(如至11．1～16．7mmol/L)，縮短更換培養(yǎng)基時間(6～12小時/次)，增加干預時間(＞7天)更加貼近臨床。

應用快速血糖儀測定實驗動物血糖，簡單便捷，可較快掌握模型動物的血糖波動狀態(tài)。多數(shù)血糖儀上限均在33．3mmol/L，對于超過上限的血糖往往不能顯示，加之血糖超過33．3mmol/L時，模型大鼠多伴有高滲性高血糖狀態(tài)或有腎功能障礙。因此，有必要適當限定模型大鼠空腹血糖和餐后血糖水平。對于空腹血糖最好控制在7．8～16．7mmol/L之間，餐后血糖在11．1～33．3mmol/L之間。干預時間采用定時定量投食的方法，觀察時間應根據(jù)實驗目的的不同進行選擇。

2．合理選擇造模用動物:糖尿病血糖波動動物模型首先必須是成功穩(wěn)定的糖尿病動物模型，其次要對不同的干預因素(如飲食干預，藥物干預等)反應敏感，模型特征出現(xiàn)迅速且穩(wěn)定。相對于化學物誘導(如STZ、四氧嘧啶等)的糖尿病動物模型而言，基因缺陷動物模型(如GK大鼠、BB大鼠、NSY小鼠模型等)穩(wěn)定性相對較好，同時可有效地排除化學物本身對血糖波動的影響，但也存在模型動物成模時間不定、血糖水平不可控和成本昂貴的問題?；瘜W誘導的糖尿病模型成本較低，可控制造模大鼠血糖水平，較易出現(xiàn)血糖水平波動，但穩(wěn)定性尚需加強。因此，根據(jù)實驗目的不同，選擇合理的實驗動物造模對糖尿病血糖波動動物模型的建立至關重要。

此外，目前血糖波動模型用動物均為大鼠或小鼠，尚未有使用豬、犬或猴等進行糖尿病血糖波動模型制備的相關研究，需要在今后研究中加強。隨著人源化動物模型(humanized animal models)研究的不斷發(fā)展，人源化糖尿病小鼠模型也取得了巨大進步。研究人員利用NSG品系小鼠成功培育了遺傳上自發(fā)及可誘發(fā)高血糖的模型，從而可以在存在或缺乏完整的人類免疫系統(tǒng)的情況下進行人胰島的功能性研究，這也為制備更接近人體生理病理狀態(tài)的血糖波動實驗動物模型，研究血糖波動對人體胰島功能的影響提供了更好的選擇。

3．注重總熱量均衡，引入“升糖指數(shù)”概念:餐后血糖波動是血糖波動評價的重要參數(shù)，同時也是血糖波動模型造模的依據(jù)和著眼點?，F(xiàn)有的動物模型多采用定時喂食飼料和麥芽糖，腹腔注射葡萄糖或不同時效胰島素的方式誘導反復的血糖波動，盡管取得了一定的研究成果，但同時也存在諸多缺點，最主要的是總熱量不平衡的問題。以上研究中的對照組(血糖穩(wěn)定組)多采用普通飼料或蒸餾水注射，與波動組大鼠相比，所獲得的總熱量并不均衡，因此研究結(jié)果并不能完全排除總熱量差異所帶來的影響?！吧侵笖?shù)(GI)”是反映食物引起人體血糖升高程度的指標，引入該概念可有效克服總熱量不同造成的干擾，是建立糖尿病血糖波動動物模型可以嘗試的方法。另外，不同時效胰島素的應用，使治療作用和血糖波動之間相疊加，在研究藥物效應方面缺乏說服力。

4．重視模型自身血糖波動及非糖尿病模型血糖波動:干擾因素的存在是研究血糖波動對機體影響及其機制，建立穩(wěn)定、可靠、公認的糖尿病血糖波動模型的主要障礙之一。減少干擾因素的最好方法就是盡量不對糖尿病模型大鼠進行干預。本課題組前期在成功制備2型糖尿病大鼠模型后連續(xù)兩周測定大鼠空腹血糖，根據(jù)糖尿病大鼠自身血糖波動性的差異(主要為FBG－CV)將糖尿病大鼠分為波動性高血糖組和穩(wěn)定性高血糖組，通過數(shù)周干預，取得了較好的實驗結(jié)果［20］。雖然該方法存在實施過程較為復雜、干預時間較長、人力物力耗費過大等諸多缺點，尚需進一步改進，但有效地減少了干擾因素，仍不失為一種值得推薦的方法。在今后的研究中，我們會將模型自身血糖波動性與定時定量投食結(jié)合起來，并引入“升糖指數(shù)”概念，使該模型進一步完善。

血糖波動幅度增大不僅對糖尿病患者是一種風險，對健康人群亦是如此。因此，我們在關注糖尿病模型血糖波動的同時，對非糖尿病模型的血糖波動也要予以充分重視，包括高脂血癥模型(ApoE小鼠)、高血壓模型、急性心梗模型以及正常動物。這對于更好探討血糖波動本身對模型的影響及影響機制具有非常重要的意義。

5．結(jié)合中醫(yī)理論制備糖尿病血糖波動中醫(yī)證候模型:中醫(yī)藥在糖尿病，特別是2型糖尿病的防治中具有其獨特優(yōu)勢，而且這種優(yōu)勢往往不表現(xiàn)在降糖方面，而是在穩(wěn)定血糖和改善并發(fā)癥上。如何利用中醫(yī)理論，制備出符合中醫(yī)病癥特點的糖尿病證候模型，是深入開展中醫(yī)藥防治糖尿病研究的關鍵所在。目前國內(nèi)研究者在化學藥物誘導出糖尿病動物模型的基礎上，運用中藥四氣五味的藥性理論，研制出一些2型糖尿病中醫(yī)證候模型，如糖尿病腎陰虛模型、氣陰兩虛模型和陰虛熱盛模型等。此外，大量體內(nèi)外研究證實中醫(yī)藥在穩(wěn)定血糖方面療效肯定。然而，符合中醫(yī)理論的血糖波動證候模型匱乏極大地限制了中醫(yī)藥穩(wěn)糖機制研究。近來研究顯示，血糖波動與情緒和自主神經(jīng)功能紊亂密切相關。在中醫(yī)理論中，肝為將軍之官，其性主動、喜條達、惡抑郁，與精神、情志及神經(jīng)內(nèi)分泌密切相關。肝失疏泄而致肝氣郁滯或肝火亢盛均表現(xiàn)為精神、情志及內(nèi)分泌方面的異常波動。那么是否可以通過對2型糖尿病大鼠進行情志刺激制備糖尿病血糖波動中醫(yī)證候模型呢?這可能是未來研究的方向之一。

四、展 望

自從血糖波動在糖尿病及其并發(fā)癥防治中的重要地位被大家認識以來，不少研究者通過深入探索，建立了多種有效的糖尿病血糖波動模型，取得了一定成果，加深了對血糖波動損傷機體及其機制的認識。然而，糖尿病血糖波動實驗模型仍存在諸多不足或可探索之處。運用適當?shù)难遣▌訚舛?、間隔和時間，選擇合理的造模動物，注重模型動物總熱量攝入平衡，引入“升糖指數(shù)”概念，并結(jié)合模型自身血糖波動，可能為建立既簡便實用、可靠性高、重復性好，又符合臨床實際的動物模型提供了思路。中醫(yī)藥在穩(wěn)定血糖方面療效確切，中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病也已被廣泛認可，采用多因素、中西醫(yī)結(jié)合方法進行動物造模是今后研究的方向之一。

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