王帥飛，王 軍，郎希龍，張 浩

·綜 述·

誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞在心臟疾病領(lǐng)域的研究和應(yīng)用

王帥飛，王 軍，郎希龍，張 浩

誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞；細(xì)胞分化；細(xì)胞移植；疾病模型；藥物篩選；生物起搏器

誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是一種類似于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的、具有自主增殖和分化能力的多能性干細(xì)胞。iPSCs可以由各種不同動(dòng)物的不同體細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)化而來，能增殖并分化成各種體細(xì)胞，其中包括具有收縮和興奮功能的心肌細(xì)胞。截止目前，iPSCs分化的心肌細(xì)胞主要用于以下幾個(gè)方面：通過細(xì)胞移植治療缺血性心肌病及心肌梗死；在體外建立遺傳性心臟病模型，研究其發(fā)病機(jī)制；檢測藥物心臟毒性，篩選患者特異性個(gè)體化藥物；構(gòu)建心臟生物起搏器。

iPSCs具有類似于ESCs的全能性，并能自主增殖和分化，可以由患者的體細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)化獲取，避免了ESCs應(yīng)用的社會(huì)倫理問題和移植后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，因而為干細(xì)胞生物學(xué)和臨床再生／修復(fù)醫(yī)學(xué)提供了新的方向［1］。本文主要論述iPSCs分化為心肌細(xì)胞的相關(guān)研究及其在心臟疾病領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。

1 iPSCs

1.1 iPSCs的概念 2006年日本科學(xué)家Yamana?ka［2］等通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將多能性相關(guān)因子Oct4、Sox2、Klf4和c－Myc轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生了形態(tài)、生長特性與ESCs相似的細(xì)胞，并能自主增殖、分化為擬胚體（EB），證明其具有多向分化的潛能。這種將體細(xì)胞重編程產(chǎn)生的具有多向分化潛能的細(xì)胞被稱為iPSCs，這項(xiàng)技術(shù)被稱作iPSC技術(shù)。不久，Yu等［3］將Oct4、Sox2、Nanog和Lin28轉(zhuǎn)入人的體細(xì)胞，產(chǎn)生了類似人的ESCs的人hiPSCs。

1.2 iPSCs技術(shù)的發(fā)展 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠?qū)⒍嗄苄韵嚓P(guān)因子導(dǎo)入體細(xì)胞使其重編程為iPSCs，但是轉(zhuǎn)化效率極低。近期研究發(fā)現(xiàn)，維生素C［4］、組蛋白去乙酰酶抑制物（如丙戊酸）、TGFβ受體阻滯劑等可以提高iPSCs生成的效率［5－6］。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因可以整合到宿主基因組，重編程因子c－Myc為原癌基因，使得腫瘤形成風(fēng)險(xiǎn)增大［7］。為了減少腫瘤形成風(fēng)險(xiǎn)，目前多采用無c－Myc重編程技術(shù)［8］，應(yīng)用非整合性的腺病毒載體或者直接向靶細(xì)胞導(dǎo)入重編程蛋白［9－10］。

2 iPSCs定向分化為心肌細(xì)胞的相關(guān)研究

iPSCs可自動(dòng)分化為EB，出現(xiàn)收縮性心肌細(xì)胞［11］。研究證實(shí)，分化的心肌細(xì)胞（iPSCs－CMs）的分子結(jié)構(gòu)、功能特性與早期心肌細(xì)胞類似，且具有分裂增殖能力［12］。電生理研究證實(shí)，iPSCs－CMs表現(xiàn)出心室樣、心房樣、竇房結(jié)樣動(dòng)作電位［13］，且表達(dá)典型的心肌細(xì)胞離子通道。iPSCs－CMs對(duì)神經(jīng)激素類刺激物極為敏感［14］，加入異丙腎上腺素可以見到動(dòng)作電位頻率明顯增加，而加入鈉通道阻滯劑利多卡因、L－型鈣通道阻滯劑硝苯地平、鉀通道阻滯劑E4031后動(dòng)作電位頻率則明顯減低。針對(duì)iPSCs分化效率低，科研人員嘗試加入內(nèi)胚層分泌的促心肌生成因子和TGF－β來提高心肌分化效率。研究發(fā)現(xiàn)，活化素A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4／2、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、Wnt抑制劑等加入培養(yǎng)基能有效提高分化效率［15］。

3 iPSCs在心臟病領(lǐng)域的應(yīng)用

以上研究使得iPSCs為心臟再生／修復(fù)醫(yī)學(xué)和心臟疾病的研究提供了新的方向，這些應(yīng)用研究包括：通過細(xì)胞移植治療缺血性心肌病及心肌梗死；在體外建立遺傳性心臟病模型，研究發(fā)病機(jī)制；檢測藥物心臟毒性，篩選患者特異性個(gè)體化藥物以及心臟生物起搏器的構(gòu)建等（圖1）。

圖1 iPSC細(xì)胞在心臟病領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 缺血性心肌病的治療 2009年，Nelson［16］等將鼠源未分化的iPSCs和成纖維細(xì)胞分別移植入急性心肌梗死的小鼠心肌內(nèi)，術(shù)后行心臟彩超檢查顯示，iPSCs組在第一周后心臟射血分?jǐn)?shù)明顯較對(duì)照組好，這種趨勢(shì)一直維持到第4周；iPSCs組室壁基本正常，而對(duì)照組在第4周左室前壁變薄、心尖部有室壁瘤形成；iPSCs組左室舒張末內(nèi)徑（LVDd）和QT離散度明顯較對(duì)照組減??；組織活檢也顯示iPSCs組心臟體積總體較對(duì)照組小。另外，研究中雖然發(fā)現(xiàn)將未分化的iPSCs注入免疫缺陷心肌梗死鼠后，可以在梗死心肌和周圍逐漸形成腫瘤，但是在免疫功能正常的鼠中觀察8周未見腫瘤形成，這提示免疫功能正常情況下可以提供一個(gè)iPSCs定向向心肌分化的微環(huán)境。2011年，Mauritz［17］等報(bào)道，iPSCs來源的Flk－1＋細(xì)胞無論在體內(nèi)還是在體外，均可以分化為心肌細(xì)胞，將iPSCs－Flk1＋細(xì)胞移植入急性心肌梗死的小鼠體內(nèi)，可以明顯改善心臟功能和心臟重構(gòu)。

2013年，Zhang［18］等報(bào)道，將豬未分化iPSCs移植到豬心梗區(qū)域，與對(duì)照組相比，血管再生明顯增多，血管內(nèi)皮生長因子及CX43增多，而神經(jīng)生長因子減少，交感神經(jīng)重塑減少，氧化應(yīng)激明顯改善，炎癥反應(yīng)明顯減輕，通過電刺激誘導(dǎo)室性心律失常也明顯減少，從而證實(shí)了iPSCs細(xì)胞移植能預(yù)防心梗后室性心律失常發(fā)生。2013年，Yan［19］等將iPSCs和iPSCs－CMs共同植入糖尿病鼠心肌，發(fā)現(xiàn)可減輕氧化應(yīng)激損傷（促氧化表達(dá)減少，抗氧化劑如過氧化氫酶和MnSOD表達(dá)上升）及相關(guān)的細(xì)胞凋亡和纖維化（Akt上調(diào)，ERK1／2下調(diào)），減緩不良心肌重塑，超聲心動(dòng)圖提示心臟功能提升。2013年，Yama?da［20］報(bào)道，將iPSCs植入鼠心梗區(qū)域，可以提高左室傳導(dǎo)性及收縮性能，減少瘢痕形成，逆轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)重塑，減緩心肌失代償，有望使缺血心肌異常室壁運(yùn)動(dòng)重新同步化。但是iPSCs能否用于臨床治療心肌梗死的患者，還需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尤其大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行證實(shí)，以進(jìn)一步證明iPSCs用于細(xì)胞移植的有效性和安全性。

3.2 遺傳性心臟病模型的建立及發(fā)病機(jī)制研究iPSCs技術(shù)可以取遺傳性心臟病患者自身的體細(xì)胞重編程為iPSCs，誘導(dǎo)定向分化為iPSCs－CMs，在體外建立遺傳性心臟病患者的疾病細(xì)胞模型，從細(xì)胞水平研究其發(fā)病機(jī)制，篩選特異性藥物，嘗試通過基因修飾探索基因治療方案。Moretti［21］等取1型長QT綜合征（LQTS）患者皮膚成纖維細(xì)胞重編程并誘導(dǎo)分化為iPSCs－CMs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍然保留有1型LQTS的基因型（常染色體錯(cuò)義突變R19OQ），與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程明顯延長，對(duì)兒茶酚胺導(dǎo)致的心動(dòng)過速易感性增加，而用β腎上腺素受體阻滯劑則可以減輕這種變化。2011年，Itzha?ki［22］等取2型LQTS（KCNH2基因上A614V點(diǎn)突變導(dǎo)致）患者的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs，發(fā)現(xiàn)其動(dòng)作電位時(shí)程明顯延長，而這種延長主要是由于心臟快速延遲整流鉀電流（Ikr）顯著減少導(dǎo)致，而且這種細(xì)胞顯示出明顯的致心律失常性，主要表現(xiàn)為早期后除極和誘發(fā)性的心律失常，這與患者的臨床特征相吻合。2013年，Belin［23］等獲取2型LQTS患者的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs，通過對(duì)突變位點(diǎn)準(zhǔn)確的基因糾正，使 Ikr電流和動(dòng)作電位時(shí)程恢復(fù)正常。2013年，Ma［24］等取3型LQTS（SCN5A突變）患者的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs建立疾病模型，與正常組對(duì)照發(fā)現(xiàn)，其動(dòng)作電位明顯延長，TTX敏感鈉通道增加，動(dòng)作電位平臺(tái)期鈉通道難失活且易復(fù)活，利用鈉通道阻滯劑美西律可逆轉(zhuǎn)此病理過程。

2013年，Caspi［25］等獲取致心律失常右室心肌?。ˋRVC）患者的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs，建立疾病模型研究ARVC發(fā)病機(jī)制（PKP2突變），實(shí)時(shí)（聚合酶鏈反應(yīng)，PCR）發(fā)現(xiàn)PKP2表達(dá)顯著下降，免疫染色發(fā)現(xiàn)橋粒蛋白及CX43表達(dá)下降，電生理發(fā)現(xiàn)場電位上升時(shí)間延長，電子顯微鏡觀察到增寬和扭曲的橋粒及胞內(nèi)脂滴聚集，這與促脂生成轉(zhuǎn)錄因子PPAR－γ上調(diào)有關(guān)，發(fā)現(xiàn)了應(yīng)用糖原合成激酶GSK－3β阻滯劑可以抑制此病理過程。2013年，Zhang［26］等取兒茶酚胺依賴多形性室速（CPVT，蘭尼堿受體RyR2點(diǎn)突變導(dǎo)致）患者的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs建立疾病模型，與正常組對(duì)照發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與鈣信號(hào)通路改變有關(guān)：鈣信號(hào)通路單一，胞內(nèi)鈣儲(chǔ)備較低，（鈣誘導(dǎo)鈣釋放，CICR）獲得較高，對(duì)腎上腺素能調(diào)節(jié)敏感。iPSCs技術(shù)在體外建立遺傳性心臟病患者的疾病細(xì)胞模型，為疾病發(fā)病機(jī)制研究、藥物測試及篩選、新的治療方法的探索提供了一個(gè)更為方便、有效的平臺(tái)。

3.3 藥物心臟毒性檢測及藥物篩選 心血管疾病藥物往往具有副作用，主要表現(xiàn)為心臟毒性和致心律失常作用，而且心臟病患者對(duì)藥物的副作用更為敏感，因而可以用iPSCs－CMs在體外建立藥物檢測模型，較當(dāng)前應(yīng)用永生細(xì)胞系和動(dòng)物模型測試藥物的敏感性和特異性更高。Ma［27］等利用3型LQTS患者的iPSCs－CMs在體外構(gòu)建了三維絲狀心肌組織用來研究其收縮異常機(jī)制，并檢測一系列藥物的心臟毒性。Navarrete［28］等利用hiPSCs－CMs和低阻抗微電極陣列檢測了hERG鉀通道阻滯劑（如索他洛爾、奎尼丁）的致心率失常作用（后除極化提前和異位搏動(dòng)），較當(dāng)前的永生細(xì)胞系／動(dòng)物模型更敏感有效，能準(zhǔn)確鑒別假陽性和假陰性hERG阻滯劑。Guo［29］等利用88種藥物和30種內(nèi)源性分子對(duì)hiP?SCs－CMs節(jié)律性和搏動(dòng)頻率的影響，建立了人心肌細(xì)胞失節(jié)律風(fēng)險(xiǎn)（hCAR）模型，更有效地評(píng)價(jià)藥物的致心律失常作用以及尖端扭轉(zhuǎn)型心律失常、LQTS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，心血管疾病藥物尤其是抗心律失常藥物往往存在異質(zhì)性，個(gè)體差異較大，對(duì)于心律失?；颊叨?，同一種藥物，并不能取得相同療效，而源自患者的iPSCs－CMs具有其特異性，可以針對(duì)個(gè)體進(jìn)行藥物篩選。但是目前尚不能肯定人的iP?SCs－CMs與患者體內(nèi)心肌細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)是否一致。

3.4 生物心臟起搏器的構(gòu)建 電生理檢測發(fā)現(xiàn)iP?SCs－CMs表現(xiàn)室性、房性、結(jié)性動(dòng)作電位，說明其中含有竇房結(jié)樣起搏細(xì)胞，具有構(gòu)建生物起搏器的潛能。2012年，Mandel［30］等對(duì)人毛囊細(xì)胞源iPSCs－CMs連續(xù)15天行細(xì)胞外電描記，進(jìn)行非線性動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，iPSCs－CMs的搏動(dòng)與竇房結(jié)細(xì)胞相似，具有搏動(dòng)頻率變異性（BRV），搏動(dòng)頻率－時(shí)間關(guān)系呈冪次分布（Power－Law Behavior），對(duì)腎上腺素能／膽堿能刺激物反應(yīng)敏感，證實(shí)了hiPSCs－CMs具有生物起搏潛能，但是搏動(dòng)平均頻率過慢（39～70 bpm）。Kuzmenkin［31］等發(fā)現(xiàn)，盡管iPSCs向心血管系統(tǒng)定向分化時(shí)可以分化為心房肌、心室肌、血管以及傳導(dǎo)系統(tǒng)的細(xì)胞，但是大部分分化而來的細(xì)胞（80%～90%）還是表現(xiàn)為心室肌細(xì)胞樣的動(dòng)作電位。因此，誘導(dǎo)iPSCs盡可能向結(jié)樣細(xì)胞分化以獲得較高純度的起搏細(xì)胞成為生物起搏亟需解決的問題。Jiang［32］等發(fā)現(xiàn)iPSCs中鈣激活鉀通道（SKCa）表達(dá)較低，Kleger［33］等發(fā)現(xiàn)應(yīng)用SKCa激活劑可以促進(jìn)此通道活化，激活Ras－Mek－Erk信號(hào)通路，有助于iPSCs向起搏細(xì)胞分化。Zhu［34］等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β／表皮生長因子受體（NRG－1β／ErbB）信號(hào)通路調(diào)節(jié)hESCs－CMs中結(jié)樣心肌細(xì)胞與工作樣心肌細(xì)胞的比例，通過抑制該信號(hào)通路有利于hESCs向起搏細(xì)胞分化。當(dāng)然，利用起搏細(xì)胞特異性表面標(biāo)記從分化心肌細(xì)胞中進(jìn)一步篩選起搏細(xì)胞也是一種方法。然而iPSCs來源的起搏細(xì)胞其起搏頻率尚無法達(dá)到臨床應(yīng)用的水平，通過對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的基因修飾（如導(dǎo)入起搏基因或者縫隙連接蛋白Cx45）有望提高其起搏效率。

4 前 景

短短幾年，iPSCs技術(shù)取得了巨大發(fā)展，其在心臟疾病研究、治療方面也取得了明顯進(jìn)步。目前存在的主要問題是iPSCs的重編程機(jī)制尚未完全闡明、重編程及誘導(dǎo)分化技術(shù)尚缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)及其遠(yuǎn)期的安全性問題［35］。盡管如此，iPSCs技術(shù)為再生／修復(fù)醫(yī)學(xué)提供了一條有效可行的道路，必將促進(jìn)再生／修復(fù)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展。在心臟疾病領(lǐng)域，盡管iPSCs－CMs的應(yīng)用研究尚處在起步階段，但現(xiàn)有研究已經(jīng)表明這一技術(shù)在心臟疾病的治療中具有非常光明的應(yīng)用前景，為未來心臟疾病的治療開啟了全新的研究方向。

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10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.03.19

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81271707，81371692）

200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院胸心外科

張 浩，E－mail：dr.zhghao＠gmail.com