鐘友好，趙弟萍，薛 峰，朱夢(mèng)雅，方 威，陳 偉*

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

2008年8月我國(guó)發(fā)生了三聚氰胺問題奶粉事件，截至2008年8月27日全國(guó)已累計(jì)篩查嬰幼兒2 238.4萬人次，累計(jì)報(bào)告泌尿系統(tǒng)出現(xiàn)異常的患兒29.4萬 人，其中甘肅省食用三聚氰胺污染奶粉泌尿系統(tǒng)結(jié)石患病率高達(dá)8.96%[1]，安徽省人民醫(yī)院統(tǒng)計(jì)泌尿系統(tǒng)結(jié)石患病率為7.97%[2]，“毒奶粉”事件將三聚氰胺這一化學(xué)名詞帶入普通民眾實(shí)際生活中，一時(shí)大家談“奶粉”色變。

三聚氰胺化學(xué)名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，重要氮雜環(huán)有機(jī)化工原料[3]，主要用作生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂的原料還可作為甲醛清潔劑、減水劑、阻燃劑等[4]。 目前所使用的“凱氏定氮法”[5]存在著無法測(cè)出氮來源的缺陷。通過添加三聚氰胺會(huì)使以凱氏定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)虛漲，因而三聚氰胺常被不法商人用作添加劑，以提升蛋白質(zhì)含量指標(biāo)[6]。三聚氰胺毒性輕微，但人體長(zhǎng)期攝入，尤其是嬰幼兒，會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌[7]。目前三聚氰胺的檢測(cè)已成為乳制品檢測(cè)中的一項(xiàng)必檢項(xiàng)目。

金納米粒子也稱為膠體金，是指一種分散相粒徑在1～150 nm之間的金溶液，屬于多相不均勻體系，其顏色隨粒徑大小不同從而呈現(xiàn)出由橘紅色到紫紅色的變化。膠體金在藥物小分子檢測(cè)、抗原抗體標(biāo)記、分子生物學(xué)和化學(xué)反應(yīng)催化等方面得到了廣泛的應(yīng)用[8]。金納米粒子常用于標(biāo)記特定的抗原抗體制備出的膠體金標(biāo)記物從而開發(fā)出被分析物的快速免疫檢測(cè)的方法，如膠體金免疫層析法。

膠體金免疫層析（gold immunochromatography assay，GICA）是20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的一種快速檢測(cè)技術(shù)，是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合起來的一種固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)[9]，其原理是：將特異性的抗原或抗體固定于硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜等固相載體的一端，而后將此端浸入待檢樣品溶液中，然后以NC膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，使滴加在膜一端的液體慢慢向膜的另一端滲移，在此遷移過程中，各種免疫反應(yīng)試劑進(jìn)行特異性結(jié)合，最后通過目測(cè)膠體金標(biāo)記物的顯色情況從而到達(dá)目標(biāo)物的檢測(cè)，并且膠體金可與抗體分子形成較牢固的結(jié)合物，并且不影響抗體的生物特性[10]。與其他免疫分析方法相比，GICA具有不需要專用儀器、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單方便、可長(zhǎng)期保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果、易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，主要作為定性或半定量篩選檢測(cè)手段[11-12]。目前，GICA法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種毒素，生物大分子和抗生素的檢測(cè)[13-15]。梅占龍等[16]成功建立利用膠體金免疫層析試紙條對(duì)塑料水杯中雙酚A的快速超靈敏檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

99.9%三聚氰胺（化學(xué)純）、檸檬酸三鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、甘氨酸（Gly）、賴氨酸（Lys） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，純度大于98%）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA） 北京拜爾迪生物科技公司；氯金酸百靈威科技有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）、玻璃纖維膜、吸水墊、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）底板 上海金標(biāo)生物科技有限公司；三聚氰胺人工抗原、羊抗鼠二抗、三聚氰胺人工抗原小鼠腹水單克隆抗體、BSA抗體均由江蘇省出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraeus Fresco 17高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛科技公司；2802 UV/Vis紫外分光光度計(jì) 山東寶萊科技股份有限公司；XYZ3000金標(biāo)點(diǎn)樣儀、CM4000金標(biāo)切條機(jī)美國(guó)Bio-Dot公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體金的制備與鑒定

本實(shí)驗(yàn)中所使用的膠體金采用檸檬酸三鈉還原法[17]制備。取250 mL錐形瓶先用水洗干凈，再用王水浸泡24 h后洗凈烘干備用。錐心瓶中加入50 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/L的氯金酸溶液，加雙蒸水置50 mL放于磁力攪拌器上加熱至沸騰。維持1 300 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速不變，迅速加入一定體積的質(zhì)量濃度為10 g/L的檸檬酸三鈉溶液[18]。溶液的顏色在2 min內(nèi)發(fā)生明顯變化，至顏色不變后繼續(xù)加熱煮沸5 min。冷卻后加雙蒸水補(bǔ)至50 mL，放在0～4 ℃條件下保存待用。不同的金納米粒子粒徑所用的檸檬酸三鈉量的關(guān)系及顏色如表1所示。

注：本實(shí)驗(yàn)中所用為理論粒徑25 nm的膠體金顆粒。

通過紫外-可見分光光度計(jì)掃描膠體金在350～850 nm處的吸光度，獲得膠體金紫外吸收光譜，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)[19]。30 d后再進(jìn)行顏色和吸收光譜確證。

1.3.2 膠體金-三聚氰胺單克隆抗體復(fù)合物的制備

1.3.2.1 常規(guī)標(biāo)記與重懸純化

用0.1 mol/L K2CO3溶液將制得的膠體金溶液pH值調(diào)至8.0，然后加入一定量的三聚氰胺抗體，在室溫條件下孵育1 h后再向其中加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% BSA溶液 ，混合溶液再繼續(xù)反應(yīng)30 min后即得到膠體金-三聚氰胺單克隆抗體復(fù)合物。將復(fù)合物于4 ℃，9 500 r/min離心7 min，移去上清液，沉淀用重懸液重懸，即制成膠體金-三聚氰胺單克隆抗體復(fù)合物濃縮液。

1.3.2.2 增敏標(biāo)記與重懸純化

向1 mL已調(diào)pH值的膠體金中加入10 μL抗BSA抗體，混勻靜置1 h，之后加入80 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的人血清白蛋白，混勻靜置30 min。在4 ℃，9 500 r/min離心7 min，移去上清液，沉淀物用重懸液進(jìn)行重懸，即制成增敏標(biāo)記復(fù)合物濃縮液。

1.3.3 試紙條原料的預(yù)處理

1）將作為結(jié)合墊的玻璃纖維膜置于金標(biāo)墊預(yù)處理液中浸泡2 h，取出放于37 ℃烘干后切成4 mm×5 mm，將6 μL膠體金-三聚氰胺單克隆抗體復(fù)合物滴加在金標(biāo)墊上，于25 ℃干燥完成后放于4 ℃條件下保存；2）樣品墊在樣品墊預(yù)處理液中浸泡2 h后取出于37 ℃條件下烘干待用；3）將不同濃度的三聚氰胺人工抗原和羊抗鼠二抗用噴膜儀包被在NC膜上，形成間隔5 mm的檢測(cè)線（test line，T線）和質(zhì)控線（control line，C線），37 ℃條件下烘干3 h，取出置于4 ℃避光干燥保存。

1.3.4 三聚氰胺檢測(cè)試紙條的組裝

上述已處理過的樣品墊、NC膜、吸水墊按順序分別粘貼在PVC底板上，用切條機(jī)切成4 mm寬的條狀，置于4 ℃避光干燥貯存。如圖1所示，結(jié)合墊和增強(qiáng)墊組裝在試紙條上完成試紙條的全部組裝步驟，便可用于檢測(cè)。此外，為了保證實(shí)驗(yàn)過程中結(jié)果的可重復(fù)性，在制備半成品試紙條、識(shí)別墊及增強(qiáng)墊時(shí)數(shù)目可達(dá)上百，之后用鋁箔紙封閉置于恒溫恒濕環(huán)境中貯存?zhèn)溆谩?/p>

圖 1 增敏型免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of the enhanced sensitivity test strip

1.3.5 試紙條結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在T線和C線處均出現(xiàn)紅色線條判定為陰性；T線處出現(xiàn)淺紅色線條判定為弱陽性；T線處未出現(xiàn)線條，C線處出現(xiàn)紅色或淺紅色線條判定為陽性；C線處未出現(xiàn)線條，無論T線是否出現(xiàn)線條，均判定為檢測(cè)無效。

1.3.6 試紙條的優(yōu)化

1.3.6.1 抗體加入量在同樣體積已調(diào)pH值膠體金溶液中加入不同體積的三聚氰胺單克隆抗體，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表 2 復(fù)合物偶聯(lián)抗體加入量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design for the amount of complex coupled antibody Table 2 Experimental design for the amount of complex coupled antibody序號(hào) 膠體金溶液/mL 三聚氰胺單克隆抗體/μL 1 1 4 2 1 6 3 1 8 4 1 10 5 1 12 6 1 14

1.3.6.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

采用了超純水、磷酸緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.4）兩種反應(yīng)體系。將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用這兩種溶液配制成100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，用于試紙條檢測(cè)，觀察記錄T、C線的顯色強(qiáng)度和顯色穩(wěn)定時(shí)間。

1.3.6.3 金標(biāo)墊上復(fù)合物滴加量

在4 mm×5 mm的金標(biāo)墊上分別滴加3、4、5、6、7 μL的偶聯(lián)復(fù)合物，干燥待用。

該優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中所用三聚氰胺樣品均為用10%乙醇溶液助溶的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品液，樣品液質(zhì)量濃度梯度為0、10、50、100、500、1 000 μg/L，5、10、50、100、500、1 000 mg/L。

1.3.7 試紙條特異性實(shí)驗(yàn)

將含氨基有機(jī)化合物Gly、Lys、4-ATP和d-NTP分別用PBS緩沖溶液配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L溶液，用質(zhì)量濃度為50 μg/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品和PBS緩沖溶液作為對(duì)照組，用試紙條檢測(cè)，觀察試紙條顯色情況。

1.3.8 食品樣品中三聚氰胺殘留檢測(cè)

1）從超市購(gòu)入新鮮牛奶經(jīng)液相色譜確證陰性后，取10 mL牛奶加入不同量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品使牛奶中三聚氰胺添加量達(dá)到500、200、100、50 μg/L，編號(hào)為食品樣品1、2、3、4；2）取新鮮牛奶樣品為食品樣品5，作為空白對(duì)照。加入標(biāo)樣處理1 h后，在4 ℃、4 000 r/min離心15 min，除去上層脂肪即可用于檢測(cè)[20]；3）樣品檢測(cè)：在三聚氰胺膠體金試紙條樣品墊上滴加樣品80 μL，反應(yīng)5～10 min后，讀取并判定結(jié)果。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金的評(píng)價(jià)與鑒定

通過肉眼觀察，制備的膠體金溶液呈現(xiàn)透亮無雜質(zhì)的酒紅色，符合25 nm粒徑的膠體金溶液顏色特征，掃描350～850 nm波長(zhǎng)范圍吸光度，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?5 nm膠體金溶液在520 nm左右有特征峰，峰形尖銳平滑，說明制得的膠體金粒徑均一，形狀規(guī)則。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中所制備的膠體金的穩(wěn)定性，將制備的膠體金取出一部分后貯存用于4 ℃條件下檢驗(yàn)其穩(wěn)定性。膠體金存放30 d后的紫外圖譜，與現(xiàn)制膠體金紫外圖譜基本一致，表明所制膠體金穩(wěn)定性比較好。

圖 2 25 nm現(xiàn)制膠體金溶液與儲(chǔ)存30 d后紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 UV-visible spectrum of synthesized 25 nm gold nanoparticles after being stored for 30 d

2.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 抗體加入量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

注：*.數(shù)量多少表示顯色的深淺程度。下同。

從表3可見，C線顯色強(qiáng)度穩(wěn)定能夠有效；T線顯色程度先隨著抗體加入體積的增加而增加，6 μL后顯色強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。根據(jù)免疫層析試紙條檢測(cè)原理，在試紙條上抗體-包被原結(jié)合部位的金顆粒達(dá)到一定數(shù)量（107粒/mm2）時(shí)，肉眼即可觀察到紅色斑點(diǎn)或線條的出現(xiàn)[21]。經(jīng)分析這種顯色變化是由于膠體金上抗體和包被原之間反應(yīng)的飽和性導(dǎo)致，2 μL和4 μL組是由于加入抗體較少，三聚氰胺大量與抗體結(jié)合，使能夠與T線處包被原充分接觸反應(yīng)的抗體減少導(dǎo)致在T線處捕獲固定的金納米顆粒較少，影響了線條出現(xiàn)產(chǎn)生不同的顯色強(qiáng)度；而6 μL組能夠滿足抗原與抗體之間的充分接觸反應(yīng)達(dá)到飽和，T線處包被原全部與抗體發(fā)生反應(yīng)，大量的金納米粒子聚集使顯色強(qiáng)度增加，8、10、12 μL組的抗體已處于過飽和狀態(tài)，過量標(biāo)記過的抗體隨著毛細(xì)作用流向吸水墊，因而與6 μL組顯色相近。因此從經(jīng)濟(jì)性和有效性考慮選擇6 μL為抗體最適加入量。

2.2.2 反應(yīng)體系對(duì)試紙條檢測(cè)的影響

表 4 上樣緩沖液體系的影響Table 4 Impact of sample buffer systems on the color reaction Table 4 Impact of sample buffer systems on the color reaction指標(biāo) 反應(yīng)體系超純水 磷酸緩沖溶液顯色強(qiáng)度 *** ****顯色穩(wěn)定平均時(shí)間/min 8 5

從表4可以看出，磷酸緩沖液組的顯色強(qiáng)度與超純水組相比更強(qiáng)，而且達(dá)到顯色穩(wěn)定所需時(shí)間短，是因?yàn)榱姿峋彌_溶液能夠?yàn)榭乖贵w反應(yīng)提供更好的pH值，使整個(gè)免疫反應(yīng)在一個(gè)穩(wěn)定適合的體系中進(jìn)行，因而顯色效果要優(yōu)于超純水體系，并且加快了反應(yīng)速度，因此選擇磷酸緩沖溶液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系。

2.2.3 結(jié)合墊上滴加量對(duì)結(jié)果的影響

表 5 結(jié)合墊上滴加量對(duì)試紙條檢測(cè)結(jié)果的影響Table 5 Effect of different quantities of pad added on test strip Table 5 Effect of different quantities of pad added on test strip指標(biāo) 結(jié)合墊滴加量/μL 3 4 5 6 7 C線顯色強(qiáng)度 *** *** *** *** ***T線顯色強(qiáng)度 * ** *** **** ****顯色穩(wěn)定平均時(shí)間/min 11 10 8 6 5

由表5可知，隨著金標(biāo)墊上膠體金與抗體偶聯(lián)物量的增加，T線顯色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，C線強(qiáng)度穩(wěn)定，并且達(dá)到顯色穩(wěn)定所需時(shí)間短。當(dāng)金標(biāo)墊滴加量為6 μL和7 μL時(shí)T線顯色效果都很好且7 μL組顯色穩(wěn)定所需時(shí)間更短，所以選擇金標(biāo)墊滴加量為7 μL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)滴加量。

2.3 傳統(tǒng)型試紙條和增敏型試紙條檢測(cè)靈敏度

圖 3 傳統(tǒng)型和增敏型試紙條對(duì)比Fig.3 Comparison of sensitivity between the traditional and the enhanced strips

從圖3A可知，傳統(tǒng)型試紙條在0～10 μg/L范圍隨著檢測(cè)物質(zhì)量濃度的增加，試紙條T線顯色逐漸減弱，減弱趨勢(shì)與三聚氰胺質(zhì)量濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。10 μg/L時(shí)T線減弱十分明顯；隨著三聚氰胺質(zhì)量濃度的增加，C線峰面積基本不變，T線隨著質(zhì)量濃度增加峰面積逐漸減小。

從圖3B可知，增敏型試紙條在0～5 μg/L范圍內(nèi)隨著三聚氰胺質(zhì)量濃度增加C線顯色清晰，顯色強(qiáng)度強(qiáng)、顏色深、背景輕，這是因?yàn)樵鰪?qiáng)墊上膠體金表面偶聯(lián)的抗BSA抗體可與C線表面捕獲的膠體金表面的BSA相結(jié)合，使C線處固定的膠體金增多，因而增敏后C線顯色明顯增強(qiáng)，線顯色逐漸減弱，靈敏度明顯提高，當(dāng)三聚氰胺質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 μg/L時(shí)T線減弱已很明顯，因此可將其作為增敏型試紙條肉眼的最低檢測(cè)限；對(duì)于C、T檢測(cè)線結(jié)果的灰度掃描結(jié)果與C線的峰面積基本一致，T線峰面積呈現(xiàn)一定的線性減弱趨勢(shì)。

圖 4 傳統(tǒng)型和增敏型試紙條灰度掃描C、T線峰面積曲線Fig.4 Grayscale scanning peak areas of C and T lines for the traditional and the enhanced strips

對(duì)兩種類型試紙條檢測(cè)結(jié)果峰面積曲線的對(duì)比（圖4）顯示兩種試紙條的C線峰面積均不隨著三聚氰胺質(zhì)量濃度增加而增加，基本保持一致，傳統(tǒng)型試紙條T線在0～10 μg/L的線性較好，最低檢測(cè)限為10 μg/L，而增敏型試紙條檢測(cè)在0～0.5 μg/L存在比較好的線性，最低檢測(cè)限為0.5 μg/L，相比傳統(tǒng)型試紙條將檢測(cè)限提高了20倍。

以上結(jié)果表明這種增敏方法對(duì)試紙條檢測(cè)靈敏度具有較強(qiáng)的增敏效果，由此可見已成功建立一種基于膠體金免疫層析試紙條的三聚氰胺增敏檢測(cè)新方法。

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

圖5a顯示：C線均顯色清晰，強(qiáng)度好，試紙條背景干凈；在檢測(cè)質(zhì)量濃度為50 μg/L的三聚氰胺樣品時(shí)，T線基本消線，其他含氨基待檢測(cè)物（Gly、Lys、4-ATP和dNTP質(zhì)量濃度均為1 000 μg/L）以及上樣緩沖液PBS都不能使T線減弱，說明除增敏型試紙條對(duì)三聚氰胺具有很高的特異性；圖5b中對(duì)于試紙條檢測(cè)線的灰度掃描結(jié)果也顯示除三聚氰胺外其他含氨基物質(zhì)均無法使T線消線；圖5c中柱狀圖更直觀的顯示了這種方法檢測(cè)特異性好，發(fā)生交叉反應(yīng)率低。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含氨基類化合物無法與三聚氰胺單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，不能干擾檢測(cè)結(jié)果，這種增敏的免疫層析檢測(cè)方法具有優(yōu)異的特異性。

2.5 食品樣品中三聚氰胺殘留檢測(cè)

圖 5 特異性實(shí)驗(yàn)Fig.5 Specificity testing

圖 6 牛奶樣品三聚氰胺檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Test results for melamine in milk samples

由圖6a可知，隨牛奶中三聚氰胺質(zhì)量濃度（0、1、2、5、10 μg/L）的增加傳統(tǒng)型試紙條T線顯色逐漸減弱，符合T線強(qiáng)度與三聚氰胺質(zhì)量濃度的負(fù)相關(guān)關(guān)系，C線顯色強(qiáng)度一致，試紙條整體顯色清晰背景干凈，檢測(cè)結(jié)果辨識(shí)度高，在三聚氰胺質(zhì)量濃度為10 μg/L時(shí)T線完全消線，可見傳統(tǒng)型試紙條對(duì)于實(shí)際樣品最低檢測(cè)限為10 μg/L；由圖6b可知，增敏型試紙條對(duì)牛奶實(shí)際樣品的檢測(cè)，增敏型試紙條C、T線顯色清晰，背景弱，T線顯色隨著牛奶中三聚氰胺質(zhì)量濃度（0、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/L）增加而逐漸減弱，在三聚氰胺質(zhì)量濃度為2 μg/L時(shí)，傳統(tǒng)試紙條T線無法消線，而增敏試紙條T線能夠完全消線，可判定增敏型試紙條對(duì)于實(shí)際樣品的最低檢測(cè)限為2 μg/L。由于實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，實(shí)際樣品的pH值、鹽離子以及其他雜質(zhì)的影響，相比于實(shí)驗(yàn)條件下抗體的效價(jià)會(huì)有減弱，所以檢測(cè)靈敏度提高效果不及標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)驗(yàn)條件下靈敏度提高的效果好，增敏效果略有減弱，因此相比于傳統(tǒng)型試紙條檢測(cè)這一結(jié)果靈敏度只提高了5 倍。這一檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于嬰兒配方奶粉中三聚氰胺含量不得高于1 mg/kg、液態(tài)奶及成人奶粉中不高于2.5 mg/kg的規(guī)定[22]，也遠(yuǎn)低于市面上快靈生物、德諾泰克、綠洲生化和華安麥科等公司所售試紙條對(duì)于奶粉及液態(tài)奶的1 000 μg/L的檢測(cè)靈敏度，同時(shí)也表明這種新方法也適用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

3 討論與結(jié)論

膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫技術(shù)和層析技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展出來的一項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)[23]。由于其具有高效性、快速性、簡(jiǎn)便性，在現(xiàn)場(chǎng)篩查、高通量快速檢測(cè)中得以廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條利用的是抗原抗體特異性反應(yīng)原理[24-25]，在傳統(tǒng)的基于競(jìng)爭(zhēng)法的三聚氰胺免疫層析試紙條基礎(chǔ)上通過增加增強(qiáng)墊建立了一種能夠顯著提高靈敏度的半定量檢測(cè)新方法，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，既保留了檢測(cè)樣品無需預(yù)處理、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，又顯著地提高了檢測(cè)靈敏度。在最優(yōu)化條件下增敏型試紙條對(duì)于三聚氰胺的最低檢測(cè)限為0.5 μg/L，檢測(cè)范圍為0.1～5 μg/L，檢測(cè)時(shí)間10 min，檢測(cè)特異性好，假陽性出現(xiàn)率低，同時(shí)也適用牛奶樣品中三聚氰胺殘留檢測(cè)。

這種新方法能夠有效解決目前試紙條檢測(cè)靈敏度低的缺點(diǎn)，將極大地拓展免疫層析試紙條的應(yīng)用范圍，對(duì)于提升我國(guó)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和食品監(jiān)測(cè)水平提供重要的技術(shù)參考。

[1]王偉, 包軍勝, 吳恭瑾, 等. 甘肅省食用添加三聚氰胺污染奶粉嬰幼兒結(jié)石發(fā)病情況調(diào)查[J]. 中國(guó)循證醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 9(11): 1165-1168.

[2]胡世蓮, 吳蕾, 陳尹, 等. 安徽中部地區(qū)食用含三聚氰胺超標(biāo)奶粉嬰幼兒泌尿系結(jié)石發(fā)病情況調(diào)查[J]. 中國(guó)循證醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 8(12):1039-1042.

[3]趙亞華, 李勇. 三聚氰胺的毒性及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 19(4): 283-288.

[4]劉世鵬, 雷迎, 黃國(guó)旺, 等. 三聚氰胺檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2012, 33(3): 50-53.

[5]夏駿, 賴衛(wèi)華, 涂繼平, 等. 三聚氰胺膠體金免疫層析方法的建立[J].食品科學(xué), 2013, 34(20): 139-144.

[6]和麗華, 劉馳青, 狄小蘭, 等. 昆明市五華區(qū)2009—2011年健康人群麻疹抗體水平監(jiān)測(cè)情況分析[J]. 衛(wèi)生軟科學(xué), 2012, 26(2): 149-150.

[7]何綺霞. 正確認(rèn)識(shí)三聚氰胺[J]. 廣東飼料, 2008, 17(10): 32-34.

[8]孫鳳霞. 三聚氰胺單克隆抗體制備及其高靈敏快速檢測(cè)技術(shù)研究[D].無錫: 江南大學(xué), 2011.

[9]M E I Z h a n l o n g, D E N G Yi, C H U H u a q i n, e t a l.Immunochromatographic lateral flow strip for rapid and on-site detection of BPA in water samples[J]. Microchim Acta, 2013, 180(3/4):279-285.

[10]孔繁徽, 黃印堯, 賴清金, 等. 免疫膠體技術(shù)及其發(fā)展前景[J]. 福建畜牧獸醫(yī), 2012, 24(7): 11-13.

[11]MICHAEL G W. Immunochromatographic techniques: a critical review[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2000, 366: 635-645.

[12]WESTAGARD J O. Point of care in using statistics in methods comparison studies[J]. Clinical Chemistry, 1998, 44(11): 2240-2245.

[13]VERHEIJEN R, OSSWALD I K, DIETRICH R, et al. Development of a one step strip test for rhe detection of (dihydro) streptomycin residues in raw milk[J]. Food and Agricultural Immunology, 2000,12(1): 31-40.

[14]GUO Yirong, LIU Shaoying, GUI Wenjun, et al. Gold immunochromatographic assay for simultaneous detection of carbofuran and triazophos in water samples[J]. Analytical Biochemistry, 2009, 389(1): 32-39.

[15]LAI Weihua, FUNG DANIEl Y C, YANG Xu, et al. Development of a colloidal gold strip for rapid detection of ochratoxin A with mimotope peptide[J]. Food Control, 2009, 20(9): 791-795.

[16]MEI Zhanlong, CHU Huaqin, CHEN Wei, et al. Ultrasensitive onestep rapid visual detection of bisphenol A in water samples by labelfree aptasensor[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 39(1): 26-30.

[17]FRENS G. Preparation gold dispersions of varying particle size:controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions[J]. Nature Physical Science, 1973, 241:20-22.

[18]MEI Zhanlong, DENG Yi, CHU Huaqin, et al. One-step signal amplified lateral flow strip biosensor for ultrasensitive and on-site detection of bisphenol A (BPA)[J]. Biosensors and Bioelectronics,2013, 49: 457-461.

[19]孫秀蘭, 趙曉聯(lián), 湯堅(jiān). 單分散性膠體金的制備工藝優(yōu)化[J]. 免疫學(xué)雜志, 2004, 20(2): 151-154.

[20]楊挺, 王妹婷, 郭逸蓉, 等. 動(dòng)物源食品中氯霉素殘留速測(cè)金標(biāo)試紙條的研制[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 23(11): 156-161.

[21]陳小鋒, 劉曙熙. 膠體金標(biāo)記免疫分析及其在小分子化合物快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 藥物生物技術(shù), 2004, 11(4): 278-280.

[22]衛(wèi)生部. 關(guān)于三聚氰胺在食品中的限量值的公告[EB/OL]. 衛(wèi)生部公告2011年第10號(hào)(2011-04-06). http://www.china.com.cn/news/txt/2011-04/22/content_22423009.htm.

[23]王自良, 王建華, 楊艷艷, 等. 抗氯霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的篩選及金標(biāo)試紙檢測(cè)方法的建立[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2006, 34(5): 6-11.

[24]賴衛(wèi)華, 熊勇華, 陳高明, 等. 應(yīng)用膠體金試紙條快速檢測(cè)赭曲霉毒素A的研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(5): 204-207.

[25]SHYU R H, SHYU H Y, LIU H W, et al. Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin[J]. Toxicon,2002, 40(3): 255-258.