張林寶 孫 偉 寧璇璇 蔡文貴 張 喆 陳海剛 馬勝偉 賈曉平①

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣州 510300;2.國家海洋局煙臺(tái)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站 煙臺(tái) 264003)

細(xì)胞因子(Cytokine)是多種細(xì)胞分泌的能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、調(diào)節(jié)免疫功能、參與炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷愈合的小分子多肽,它們是細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)不可缺少的介質(zhì)(Kuby,1997)。無脊椎動(dòng)物中關(guān)于細(xì)胞因子樣物質(zhì)的研究主要集中在白介素和腫瘤壞死因子TNF-α(Tumor necrosis factor alpha)上。TNF-α 作為前炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)(Bazzoniet al,1996),能直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡并參與機(jī)體內(nèi)炎癥和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)(García-Castilloet al,2002)。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α LITAF(LPS-induced TNF a factor)是 TNF-α 重要的轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié) LPS誘導(dǎo) TNF-α的表達(dá)過程中起著非常重要的作用(Tanget al,2003)。LITAF在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中均被分離出來(Bolcato-Belleminet al,2004;Honget al,2006;Yuet al,2007;Parket al,2008;Zhanget al,2009),并證實(shí)其可以特異結(jié)合人TNF-α啟動(dòng)子上位于-515到-511位的 CTCCC序列(Tanget al,2003),在受到LPS刺激后與STAT6B蛋白形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控TNF-α的表達(dá)(Tanget al,2005)。

迄今為止,在扇貝、牡蠣等貝類中相繼報(bào)道了LITAF的基因克隆與功能研究(Yuet al,2007;Parket al,2008;Zhanget al,2009;赫崇波等,2012;Liet al,2012;Yanget al,2012;Yuet al,2012)。然而,有關(guān)菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)LITAF基因的功能研究則未見報(bào)道。菲律賓蛤仔作為我國海水養(yǎng)殖業(yè)的重要經(jīng)濟(jì)貝類,年產(chǎn)量高達(dá)180萬噸,是沿海居民最常食用的海產(chǎn)品之一(Zhanget al,2006)。但是,近年來頻發(fā)的病害問題嚴(yán)重制約了蛤仔養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,因此開展菲律賓蛤仔抗病及免疫相關(guān)基因的研究是非常重要和十分緊迫的。本研究在已構(gòu)建的cDNA文庫和大規(guī)模EST(expressed sequence tags,表達(dá)序列標(biāo)簽)分析的基礎(chǔ)上,采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends,cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù))等方法克隆菲律賓蛤仔LITAF基因序列,用生物信息學(xué)方法對(duì)基因和推測(cè)的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè),同時(shí)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在蛤仔不同組織以及受到不同微生物刺激后的表達(dá)情況。研究旨在深入了解菲律賓蛤仔的免疫抗病機(jī)制,為其遺傳改良和抗病品系選育工作提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品及處理

實(shí)驗(yàn)所用菲律賓蛤仔購自廣州市黃沙水產(chǎn)市場(chǎng),選取殼長(zhǎng)為3—4cm個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)開始前,在過濾海水中馴養(yǎng)一周,每日定時(shí)投喂小球藻,水溫控制在20—22°C。微生物侵染實(shí)驗(yàn)中,設(shè)置對(duì)照組和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)刺激組。鰻弧菌作為本研究中革蘭氏陰性菌的代表,廣泛存在于養(yǎng)殖環(huán)境,是海水魚、蝦、貝類的常見細(xì)菌性病原(Egidius,1987)。藤黃微球菌是一種典型的革蘭氏陽性菌,屬條件致病菌,目前有文獻(xiàn)報(bào)道其在水體以及水生生物體內(nèi)都有分布(Spanggaardet al,2001;彭彬等,2011)。對(duì)照組不做任何處理,隨機(jī)取6只蛤仔,采集閉殼肌、外套膜、肝胰腺、鰓和血淋巴細(xì)胞五種組織。侵染組菲律賓蛤仔分別浸泡于含有 1×107CFU/mL鰻弧菌和藤黃微球菌的海水中,于6、12、24、48 h每組隨機(jī)采集6只蛤仔血淋巴樣品。血淋巴樣品于4°C,3000r/min離心5 min收集血淋巴細(xì)胞,加入1mL Trizol(Invitrogen公司)后置于超低溫冰箱,其余組織放入預(yù)先裝有1mL Trizol的離心管中充分研磨,在4°C,5000r/min離心5min,取上清置于超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 菲律賓蛤仔LITAF基因的克隆 采用Trizol提取菲律賓蛤仔各組織以及鰻弧菌和藤黃微球菌侵染后的血淋巴細(xì)胞總RNA,用Dnase I(Promega公司)消化殘留DNA,然后用M-MLV(Promega公司)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的菲律賓蛤仔cDNA文庫獲得LITAFEST序列,并分別設(shè)計(jì)3′和5′ Race特異性引物(表1),以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,按 Race試劑盒(Clonetech公司)說明步驟分別擴(kuò)增該基因的 3′和 5′端。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到pMD18-T載體上(TaKaRa公司),轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F感受態(tài),PCR檢測(cè)陽性克隆后測(cè)序。

1.2.2 菲律賓蛤仔VpLITAF基因生物信息學(xué)分析序列同源性比對(duì)和相似性搜索利用 NCBI在線軟件BLAST進(jìn)行分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast),多序列比對(duì)采用 CLUSTAL W 多重比對(duì)程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/);信號(hào)肽查找用 SingalP 3.0 Server 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/);同時(shí)運(yùn)用 MEGA 5.0軟件包(Tamuraet al,2011)的Neighbor-joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(Saitouet al,1987)。

1.2.3 菲律賓蛤仔VpLITAF基因表達(dá)分析 采用PCR Sybrgreen Master Mix(TaKaRa)試劑盒,使用ABI公司7500Fast型熒光定量 PCR儀分析VpLITAF基因的組織分布特征以及在鰻弧菌和藤黃微球菌感染下的時(shí)序表達(dá)規(guī)律。根據(jù)擴(kuò)增獲得的VpLITAF基因序列,設(shè)計(jì)熒光定量引物VpLITAF-QF和VpLITAF-QR,以β-actin為內(nèi)參照(引物信息見表1),采用相對(duì)定量方法檢測(cè)VpLITAF基因的表達(dá)特征。PCR反應(yīng)條件:第一步:50°C 2min,第二步:95°C 10min,第三步:95°C 15s,60°C 1min,共40個(gè)循環(huán),反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析:95°C 15s,60°C 20s,然后緩慢升溫至95°C,連續(xù)記錄熒光信號(hào)的變化,將溫度的變化與熒光信號(hào)的變化求負(fù)倒數(shù)后對(duì)溫度作圖,可得到產(chǎn)物的Tm值。實(shí)驗(yàn)過程中,每個(gè)反應(yīng)均設(shè)3個(gè)重復(fù),并在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析確保產(chǎn)物的特異性。數(shù)據(jù)處理首先用β-actin作為內(nèi)標(biāo)基因?qū)pLITAF基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,計(jì)算ΔCT值。組織分布研究將閉殼肌組織的樣品作為參照因子(calibrator),其倍數(shù)變化為1,對(duì)于其它組織樣本,目標(biāo)基因表達(dá)差異相對(duì)于參照因子基因表達(dá)的倍數(shù)為2–ΔΔCT。菌刺激樣品VpLITAF基因相對(duì)表達(dá)水平用微生物處理組的表達(dá)量與海水對(duì)照組表達(dá)量的比值來計(jì)算(Zhanget al,2011)。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行t-test統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 菲律賓蛤仔VpLITAF基因序列分析

通過5′和3′ RACE方法獲得菲律賓蛤仔VpLITAF基因 cDNA序列(GenBank注冊(cè)號(hào) HQ174259),如圖1 所示。該cDNA序列長(zhǎng)為725 bp,含有393 bp的開放閱讀框序列(Open Reading Frame,ORF),編碼130個(gè)氨基酸殘基,該多肽的理論分子量為 14.39 kDa,等電點(diǎn)為 7.47。VpLITAFcDNA 序列 5′非編碼區(qū)(5′-UTR)為 23 bp,3′非編碼區(qū)(3′-UTR)為 309 bp,包含一個(gè)加尾信號(hào)(AATAAA)和典型的 polyA尾巴。利用SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)VpLITAF不具有信號(hào)肽序列。

2.2 VpLITAF同源性分析與進(jìn)化分析

經(jīng)BLASTP比對(duì)發(fā)現(xiàn)VpLITAF基因編碼的蛋白與文蛤(Meretrix meretrix)和竹蟶(Solen grandis)LITAF蛋白同源性最高,分別為96%和84%,與櫛孔扇貝(Chlamys farreri)、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、中華圓田螺(Cipangopaludina chinensis)和鮑(Haliotis discus discus)等貝類 LITAF也有 55%—67%的一致性。利用SMART軟件(http://cn.expasy.org)分析發(fā)現(xiàn),VpLITAF蛋白C端含有一個(gè)保守的LITAF結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)保守的 CXXC基序。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在該保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有 8個(gè)保守的半胱氨酸殘基(圖1,圖2),推測(cè)這些保守的半胱氨酸殘基可能在維持蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用。采用 Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn) LITAF蛋白首先分為脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物兩大類,菲律賓蛤仔 VpLITAF與海洋軟體動(dòng)物L(fēng)ITAF聚類在一起,然后再與魚類、鳥類及哺乳動(dòng)物的 LITAF蛋白聚在一起,這與生物進(jìn)化的遠(yuǎn)近關(guān)系基本一致(圖3)。

2.3 VpLITAF基因在菲律賓蛤仔組織中的分布特征

以β-actin為對(duì)照,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VpLITAFmRNA在菲律賓蛤仔鰓、肝胰腺、外套膜、血淋巴細(xì)胞和閉殼肌 5種正常組織中的表達(dá)情況(圖4);結(jié)果顯示,VpLITAFmRNA在5種組織中均可見不同豐度的表達(dá)。VpLITAF在肌肉中的表達(dá)量最低,血淋巴細(xì)胞、外套膜和鰓中VpLITAF的表達(dá)量相對(duì)較高,分別是閉殼肌組織中表達(dá)量的19.89、29.56和82.28倍。VpLITAF基因在菲律賓蛤仔肝胰腺中的表達(dá)量最高,為閉殼肌組織中表達(dá)量的315.90倍。

圖1 菲律賓蛤仔VpLITAF基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The complete nucleotide and deduced amino acid sequence of VpLITAF

圖2 VpLITAF與其它物種LITAF氨基酸序列的多序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of VpLITAF with LITAFs from other organisms

圖3 不同物種LITAF進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LITAF sequences from different organisms

圖4 VpLITAF在菲律賓蛤仔各組織中的相對(duì)表達(dá)情況Fig.4 Distribution of VpLITAF mRNA in different tissues of V.philippinarum

2.4 菌刺激后菲律賓蛤仔VpLITAF基因的時(shí)序表達(dá)特征

利用熒光定量 PCR方法,分析菲律賓蛤仔VpLITAF基因 mRNA在鰻弧菌和藤黃微球菌刺激后的時(shí)序表達(dá)情況(圖5)。其中,對(duì)照組樣品VpLITAF表達(dá)量在所檢測(cè)的時(shí)間范圍內(nèi)未出現(xiàn)明顯變化。鰻弧菌感染組菲律賓蛤仔VpLITAF基因表達(dá)量不斷變化,12h和48h的表達(dá)量有著顯著增加,分別為對(duì)照組的2.1倍和3.5倍。藤黃微球菌感染24h以內(nèi),VpLITAF基因 mRNA表達(dá)量有所升高,但與對(duì)照組表達(dá)水平并無顯著差異。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),VpLITAF基因表達(dá)水平在48h被鰻弧菌顯著誘導(dǎo),表達(dá)量為對(duì)照組的1.9倍。

圖5 菌刺激后菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞中VpLITAF的時(shí)序表達(dá)特征Fig.5 Temporal expression of VpLITAF in haemocytes of V.philippinarum after bacterial infection

3 討論

LITAF是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α的表達(dá)過程中起著非常重要的作用。迄今為止,在扇貝、牡蠣、文蛤和中華圓田螺等貝類中相繼報(bào)道了LITAF基因(Yuet al,2007;Liet al,2012;Yuet al,2012)。然而有關(guān)菲律賓蛤仔LITAF基因的相關(guān)研究則未見報(bào)道。本研究首次克隆了蛤仔的LITAF基因cDNA序列,并對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步研究。

比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),VpLITAF氨基酸序列與其它貝類LITAF具有較高的相似性(Yuet al,2007,2012;Liet al,2012),都具有高度保守的LITAF結(jié)構(gòu)域。LITAF結(jié)構(gòu)域由N端的CXXC區(qū)、25個(gè)氨基酸長(zhǎng)的疏水區(qū)和C端的(H)XCXXC區(qū)組成,N端和C端的CXXC基序結(jié)合在一起,形成緊密結(jié)合的 Zn2+結(jié)構(gòu)(Pontinget al,2001),介導(dǎo)LITAF與DNA之間的結(jié)合啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄(Yuet al,2012)。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),VpLITAF首先與貝類 LITAF聚為一簇,然后與各類脊椎動(dòng)物 LITAF聚在一起,這與物種進(jìn)化的發(fā)生順序基本一致。綜上所述,同源比對(duì)、結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化分析均表明菲律賓蛤仔VpLITAF為L(zhǎng)ITAF家族一員。

研究表明LITAF基因主要表達(dá)于脊椎動(dòng)物外周血細(xì)胞、淋巴結(jié)和脾等淋巴組織中,在非淋巴器官中也有不同程度的表達(dá)(Bolcato-Belleminet al,2004;Tanget al,2005;Honget al,2006)。本研究中VpLITAF在菲律賓蛤仔所檢測(cè)組織中均有表達(dá),其中肝胰腺的表達(dá)量最高(圖4),這與LITAF基因在中華圓田螺和太平洋牡蠣中的組織分布情況類似(Yanget al,2012;Yuet al,2012)。牡蠣全基因組研究揭示許多免疫相關(guān)基因高度表達(dá)于消化腺中(Zhanget al,2012),這表明消化系統(tǒng)與血淋巴細(xì)胞一樣是軟體動(dòng)物對(duì)抗、清除病原體的重要一線防御器官(江靜波,1982;Parket al,2008;Zhanget al,2009),因此推測(cè)菲律賓蛤仔肝胰腺中高表達(dá)的 VpLITAF在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。然而,櫛孔扇貝和文蛤LITAF的組織分布情況則有所不同,二者的最高表達(dá)量分別發(fā)生在性腺和鰓組織中(Yuet al,2007;Liet al,2012),表明LITAF基因組織分布特征隨物種的不同而不同。

雖然本研究中VpLITAF在蛤仔血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量相較于其它組織來說偏低,然而血淋巴細(xì)胞在貝類固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用(王信超等,2012;劉世良等,2003),經(jīng)常作為研究免疫相關(guān)基因的組織材料(Zhanget al,2011;Liet al,2012),因此本研究選取血淋巴細(xì)胞研究VpLITAF基因表達(dá)與微生物感染的相關(guān)性。研究結(jié)果表明鰻弧菌和藤黃微球菌侵染在某些時(shí)段均可顯著誘導(dǎo)VpLITAF基因的表達(dá)水平(圖5),類似的結(jié)論在太平洋牡蠣、蝦夷扇貝、文蛤和珍珠貝中也有發(fā)現(xiàn)(Parket al,2008;Zhanget al,2009;赫崇波等,2012;Liet al,2012),表明LITAF參與了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)過程。鰻弧菌和藤黃微球菌侵染24 h,VpLITAF基因表達(dá)水平與12 h相比有所回落,這可能是因?yàn)殡S著微生物侵染時(shí)間的延長(zhǎng),蛤仔血淋巴系統(tǒng)中產(chǎn)生 VpLITAF的血細(xì)胞數(shù)量減少或轉(zhuǎn)移至微生物增殖的其它組織中,如外套膜、消化腺和鰓等。微生物感染下,類似的誘導(dǎo)-降低-再誘導(dǎo)的表達(dá)模式在貝類其它免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析中也有發(fā)現(xiàn),如盤鮑(Haliotis discus discus)抗菌肽(De Zoysaet al,2010)和菲律賓蛤仔谷胱甘肽過氧化物酶(Zhanget al,2011)。另外,本研究中鰻弧菌對(duì)VpLITAF基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于藤黃微球菌。鰻弧菌是一種革蘭氏陰性菌,其細(xì)胞外膜的主要結(jié)構(gòu)成分為L(zhǎng)PS ,目前已有諸多研究表明LPS可顯著誘導(dǎo)LITAF的轉(zhuǎn)錄水平(Bolcato-Belleminet al,2004;Honget al,2006;Yuet al,2007,2012)。藤黃微球菌是一種革蘭氏陽性菌,其細(xì)胞壁主要結(jié)構(gòu)成分為肽聚糖(peptidoglycan,PGN),研究表明PGN對(duì)櫛孔扇貝LITAF基因表達(dá)無顯著誘導(dǎo)作用(Yuet al,2007)。因此,不難理解菲律賓蛤仔VpLITAF基因表達(dá)對(duì)鰻弧菌感染更為敏感。藤黃微球菌侵染蛤仔48 h后,VpLITAF基因被顯著誘導(dǎo)的原因需進(jìn)一步深入研究?？傊?VpLITAF基因克隆與表達(dá)分析表明 VpLITAF參與了菲律賓蛤仔的先天性免疫反應(yīng),這為進(jìn)一步研究蛤仔分子水平的免疫防御機(jī)制研究提供了新的基礎(chǔ)資料。

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