陳建華 于仁成 孔凡洲 高 巖 羅 璇 王云峰 周名江

(1.中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室 青島 266071;2.中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

海洋中的部分有毒藻類能夠產(chǎn)生藻毒素,這些藻毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異很大,致毒機理也不相同。在聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization,FAO)、政府間海洋學(xué)委員會(Intergovernmental Oceanographic Commission,IOC)和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)聯(lián)合召開的海洋生物毒素會議上,按照藻毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu),將其分為 8類(Toyofuku,2006),即原多甲藻酸類(Azaspiracids,AZAs)、短裸甲藻毒素類(Brevetoxins,BTXs)、環(huán)亞胺類(Cyclic imines,CIs)、軟骨藻酸類(Domoic acid,DAs)、大田軟海綿酸類(Okadaic acid,OAs)、扇貝毒素類(Pectenotoxins,PTXs)、石房蛤毒素類(Saxitoxins,STXs)和蝦夷扇貝毒素類(Yessotoxins,YTXs)。在這些藻毒素中,除石房蛤毒素類和軟骨藻酸類之外,均為脂溶性毒素。這些脂溶性藻毒素易于在濾食性貝類體內(nèi)累積,人們食用染毒貝類后,會出現(xiàn)各種急性和慢性中毒癥狀(Daranaset al,2001;Creppyet al,2002;Itoet al,2002;Dragunowet al,2005)。

貝類沾染脂溶性藻毒素是沿海國家常見的水產(chǎn)品食品安全問題之一(Shumway,1990;Hallegraeff,1993;Zhouet al,1999)。因脂溶性藻毒素沾染導(dǎo)致的中毒事件在日本、美國和歐洲等國家時有報道(Picotet al,2011)。近年來,對中國沿海貝類樣品中的毒素調(diào)查結(jié)果顯示,脂溶性藻毒素沾染問題也同樣不容忽視(表1)。2011年5月25—31日,在福建寧德和浙江寧波兩地就發(fā)生了因食用被腹瀉性貝毒沾染的紫貽貝引起的中毒事件,中毒人數(shù)多達200人。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),貝類中主要的毒素成分是OA和DTX1(Liet al,2012a)。其他脂溶性毒素在中國沿海的貝類中也時有檢出,通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法,在我國北海的緣齒牡蠣中發(fā)現(xiàn)了環(huán)亞胺類毒素 GYM(劉仁沿等,2008),在大連海域的蝦夷扇貝中發(fā)現(xiàn)了YTXs(高春蕾等,2010),在我國北方海域貝類中檢測到了PTXs毒素(Liet al,2010;Liuet al,2011)。此外,脂溶性毒素SPX和AZA1在我國貝類中也有檢出報道(姚建華等,2010a)。

表1 中國沿海貝類中脂溶性藻毒素的檢出情況Tab.1 Lipophilic phycotoxins detected in shellfish samples collected along the coast of China

對于常見脂溶性藻毒素的檢測,通常采用生物毒性測試法或化學(xué)分析法。小鼠生物測試法是最為常用的毒性測試方法,對于OA、PTX、YTX等脂溶性藻毒素成分,小鼠生物測試法仍然是毒性初篩的重要方法。但是,生物學(xué)測試方法存在特異性低、靈敏度差、假陽性率高、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性低等問題。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法是最具應(yīng)用潛力的藻毒素分析方法,依靠質(zhì)譜強大的定性和定量分析能力,可以實現(xiàn)多類脂溶性毒素的同步分析。Quilliam(2003)最早應(yīng)用酸性的水/乙腈流動相進行梯度洗脫,建立了多類脂溶性毒素的同步分析方法,但是,由于采用了陽離子模式進行檢測,這個方法不能對YTX類毒素進行分析。Stobo等(2005)采用了含有醋酸銨的中性(pH 6.8)水/乙腈流動相進行梯度洗脫,能夠?qū)W盟標(biāo)準(zhǔn)中提及的所有毒素進行分離,并獲得了更好的分離效果。Fux等(2007)發(fā)展了一種UPLC方法,采用含有甲酸銨和甲酸的水/乙腈梯度洗脫流動相,結(jié)合質(zhì)譜的快速極性轉(zhuǎn)換,可以在6.6分鐘內(nèi)實現(xiàn)對21種脂溶性藻毒素的分離。Gerssen等(2009)則提出了堿性流動相洗脫方法,結(jié)合質(zhì)譜的快速極性轉(zhuǎn)換,能夠得到更好的色譜分離效果,特別適合于多類脂溶性毒素的同步分析。

北黃海海域是我國蝦夷扇貝的主要增養(yǎng)殖區(qū),以往蝦夷扇貝中曾檢測到脂溶性藻毒素成分,個別樣品甚至出現(xiàn)了毒素含量超標(biāo)情況(楊莉等,2006;雷芳,2009)。然而,已有研究中大多采用了小鼠法對毒性進行測試,存在假陽性和毒素成分不明確等缺點。本研究應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù),通過Gerssen等(2009)建立的堿性流動相方法,對北黃海海域蝦夷扇貝樣品中的脂溶性藻毒素進行了分析,以求了解北黃海海域貝類中脂溶性藻毒素的沾染狀況,為針對性地開展貝類質(zhì)量監(jiān)控和有毒藻類監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 樣品采集與保存

蝦夷扇貝樣品于2011年7月和8月采集于北黃海海域,具體采樣地點和貝類情況見圖1和表2;用海水沖洗去除貝類外殼附著物后,將樣品放入密封袋中,送回實驗室內(nèi),于–20°C冰箱中保存直至分析。

圖1 北黃海蝦夷扇貝樣品采集區(qū)域示意圖Fig.1 The sampling area of Patinopecten yessoensis in the northern Yellow Sea

表2 蝦夷扇貝樣品描述Tab.2 Sample specifications of scallops Patinopecten yessoensis collected from the northern Yellow Sea

1.2 儀器與試劑

儀器:帶有二元梯度泵和自動進樣器的美國安捷倫高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent 1200,USA)、美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(API 4000,Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)、美國 Waters公司的 C18反相色譜柱(Waters,X-Bridge C18,5μm,3mm×150mm)、德國Sigma臺式高速冷凍離心機(sigma 3-16K)、Philips手持式攪拌機(Philips Viva Collection,hand blender,HR1613)、德國IKA高速組織勻漿機(IKA,homogenizer workcenter,T 10 B S25)、德國IKA旋轉(zhuǎn)震蕩器(IKA,MS1 Minishaker)、固相萃取儀(天健奧特賽恩斯儀器有限公司,ASE-12固相萃取儀)、固相萃取柱(Waters,HLB,30mg/mL)、美國Millipore Simplicity超純水機等。

試劑:甲醇、乙腈、氨水等試劑均為色譜純級,脂溶性藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(OA、PTX2、YTX、SPX1、AZA1和 GYM)購自加拿大國家研究院海洋生物科學(xué)研究所,脂溶性藻毒素DTX1標(biāo)準(zhǔn)品購自日本W(wǎng)ako公司。

1.3 毒素提取

冷凍貝樣于室溫下自然解凍后,用解剖刀將貝肉與貝殼分離,置于紗布上瀝水 5min,將貝肉分成閉殼肌、外套膜、內(nèi)臟團和性腺四部分,分別取適量貝組織于攪拌機內(nèi)攪碎、混勻。毒素提取參照 Gerssen等(2009)對貽貝的提取方法,稱取1g勻漿組織于5mL離心管內(nèi),并加入3mL甲醇,震蕩混勻1min后,放入離心機中2000g離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中。重復(fù)上述操作2次,合并上清液,并用甲醇定容至10mL,5000g離心1min后,經(jīng)0.22μm有機濾膜(ANPEL,SCAA-104,13mm,0.22μm)過濾。

1.4 固相萃取

提取的毒素溶液以HLB固相萃取柱純化。固相萃取柱首先用1mL 甲醇活化,并以30%(V/V)甲醇溶液淋洗平衡。吸取1.2mL毒素提取液于5mL離心管中,加入2.8mL超純水后充分混勻,得到甲醇濃度為30%的提取液,并轉(zhuǎn)移至萃取柱中。用1mL 20%甲醇溶液清洗萃取柱,去除雜質(zhì)。再用1.2mL甲醇溶液(含0.3%氨水)洗脫待測物,并移至進樣瓶內(nèi)。實驗數(shù)據(jù)表明,該處理方法對幾種毒素的回收率分別為OA:91.%3±7.3%,DTX1:101.3%±1.8%,YTX:98.7%±25.9%,PTX2:52.5%±4.6%,AZA1:80.0%±3.4%,GYM:64.9%±5.1%,SPX1:40.9%±3.3%。考慮到毒素PTX2、GYM和SPX1等毒素的回收率較低,但回收率較為穩(wěn)定(RSD＜10%),因此最終毒素含量結(jié)果以檢測結(jié)果除以回收率計算。

1.5 毒素分析

參照 Gerssen等(2009)建立的多類脂溶性毒素同步分析方法,根據(jù)實驗室實際條件稍作修改。具體檢測條件簡述如下:采用兩相洗脫液,流動相A為100%超純水,流動相 B為 90%乙腈,兩者都含有6.7m mol/L NH4OH(pH 11.0)。采用梯度洗脫,洗脫梯度條件如表3所示,洗脫液流速 400μL/min,進樣量20μL,色譜柱溫為25°C。采用快速極性轉(zhuǎn)換方法,多反應(yīng)模式對毒素進行檢測,第0—5min采用陽離子掃描模式,主要分析檢測軟骨藻酸 DA,但是,由于本文采用的毒素提取方式對DA回收率過低,因此文中未對DA進行定量分析;第5—8.5min采用陰離子掃描模式,檢測OA、DTX1和YTX;第8.5—17min采用陽離子模式,檢測GYM、AZA1、PTX2和SPX1。分析前以標(biāo)準(zhǔn)毒素溶液對質(zhì)譜檢測器進行調(diào)諧,優(yōu)化質(zhì)譜檢測器的參數(shù),調(diào)諧后的質(zhì)譜參數(shù)為:陽離子監(jiān)測模式下電噴霧電壓 5500V,碰撞室入口電壓10V,碰撞室出口電壓 10V,幕簾氣壓 10Pa,碰撞氣壓8 Pa,離子源溫度500°C;在陰離子監(jiān)測模式下電噴霧電壓為–4500V,碰撞室出口電壓為–10V,其余參數(shù)與陽離子模式下相同。檢測離子及調(diào)諧后的相應(yīng)去簇電壓和碰撞能參數(shù)如表4。

表3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法分析脂溶性毒素的洗脫梯度Tab.3 Gradient elution in detection of marine lipophilic phycotoxin using HPLC-MS/MS

表4 脂溶性毒素的檢測離子及其相應(yīng)的去簇電壓和碰撞能Tab.4 The characteristic ions for detection of lipophilic phycotoxin and corresponding value of declustering potential and collision energy

2 實驗結(jié)果

2.1 蝦夷扇貝各組織中脂溶性毒素成分與組成

扇貝樣品中脂溶性毒素分析的色譜圖如圖2所示。在扇貝的閉殼肌、外套膜、內(nèi)臟團和性腺組織中均檢測到OA、DTX1、PTX2和YTX四種脂溶性藻毒素成分,毒素含量如表5所示,未檢出AZA1、SPX1和GYM毒素。在檢出的各種毒素中,YTX含量最高,在各組織中所占比例均達90%以上(96.21%,90.24%—99.49%)。同一地點扇貝樣品的各種組織之間,OA、DTX1和PTX2毒素的組成沒有明顯差別,而不同地點扇貝樣品之間毒素組成的差異較為明顯。在扇貝樣品2的各種組織中,OA和DTX1所占比例可達91%(87%—98%),而在樣品3的各種組織中,OA和DTX1毒素所占比例僅為61%(37%—72%)。

2.2 蝦夷扇貝各組織中脂溶性藻毒素的含量

四種脂溶性毒素成分在各組織間的含量分布存在明顯差異(圖3)。毒素主要集中在內(nèi)臟團中,含量由高到低依次為內(nèi)臟團＞性腺＞外套膜＞閉殼肌。扇貝各組織中藻毒素含量如表5所示。內(nèi)臟團YTX的平均含量為2670μg/kg(825—6680μg/kg),性腺中平均含量為449μg/kg(146—915μg/kg),外套膜中含量為355μg/kg(32.5—1240μg/kg),在閉殼肌中含量最低,為140μg/kg(73.1—214μg/kg);OA在內(nèi)臟團中平均含量為12.30μg/kg(1.97—34.5μg/kg),在性腺中含量為 1.61μg/kg(0.37—2.27μg/kg),在外套膜中含量為 1.29μg/kg(0—3.75μg/kg),閉殼肌中含量為0.93 μg/kg(0.41— 1.34μg/kg);PTX2在內(nèi)臟團中平均含量為 16.90 μg/kg(1.12—50.10μg/kg),性腺中為 5.70 μg/kg(0.28—11.02μg/kg),在閉殼肌中含量只有0.60μg/kg(0.13—1.34μg/kg);DTX1在各組織中的含量分布表現(xiàn)為內(nèi)臟團＞性腺＞閉殼肌＞外套膜,內(nèi)臟團中含量為 26.50μg/kg(4.97—77.30μg/kg),性腺中為3.42μg/kg(2.51—4.32μg/kg),閉殼肌中為3.02μg/kg(0.65—6.45μg/kg),外套膜中含量最低,僅為 1.46μg/kg(0—5.07μg/kg)。

表5 北黃海海域蝦夷扇貝各組織中脂溶性毒素的組成與含量Tab.5 Profile and content of lipophilic phycotoxin in different tissues of scallops

圖3 蝦夷扇貝各組織中的脂溶性毒素含量情況Fig.3 Content of lipophilic phycotoxin in different tissues of the scallops

3 討論

3.1 北黃海蝦夷扇貝體內(nèi)的脂溶藻性毒素沾染狀況

我國是一個貝類養(yǎng)殖大國,藻毒素沾染問題在我國沿海貝類中普遍存在。北黃海是我國重要的貝類養(yǎng)殖區(qū),水產(chǎn)品食品安全狀況同樣受到藻毒素沾染的威脅。在以往研究中,通過小鼠生物測試法曾多次檢測到有毒貝類樣品。近年來,借助于液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù),不斷有新的脂溶性毒素被發(fā)現(xiàn),先后從北黃海海域的蝦夷扇貝、海灣扇貝、櫛孔扇貝、牡蠣等貝類樣品中檢測到了YTX、AZA1、PTX2和GYM等脂溶性毒素成分(高春蕾等,2010;姚建華等,2010a;Liuet al,2011;Liet al,2012a)。

在本研究中,應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),在北黃海海域蝦夷扇貝體內(nèi)檢測到了OA、DTX1、PTX2和YTX等四種毒素成分。應(yīng)當(dāng)指出的是,貝類樣品中可能還存在這四種毒素的同系物。但是,受到檢測能力和標(biāo)準(zhǔn)品的限制,本研究所采用的多類脂溶性毒素同步分析方法,沒有對各種藻毒素的同系物進行逐一分析。因此,在后續(xù)研究中,仍有必要針對DTX、PTX和YTX等各類脂溶性毒素的同系物進行詳細分析。

在檢測到的各種脂溶性毒素中,YTX是主要的毒素成分。2010年,高春蕾等首次在北黃海采集的蝦夷扇貝中檢測到了YTX毒素成分(25—41μg/kg);2012年,李愛峰等人再次從采自大連海域的蝦夷扇貝中檢測到Y(jié)TX(1578μg/kg)。本研究發(fā)現(xiàn),蝦夷扇貝內(nèi)臟團中YTX含量最高可達6680μg/kg,是其他脂溶性毒素含量總和的6—194倍。綜合這些結(jié)果可以看出,YTX應(yīng)當(dāng)是北黃海海域最為常見的脂溶性毒素成分。根據(jù)歐盟規(guī)定(Anonymous,2011),貝肉中脂溶性毒素YTXs含量不得超過1mg/kg,以此標(biāo)準(zhǔn)為參考,在所分析的幾個扇貝樣品中,大部分扇貝的內(nèi)臟團中YTX含量超出標(biāo)準(zhǔn),樣品3外套膜中的YTX含量也超出了歐盟標(biāo)準(zhǔn)。可見,北黃海海域YTX毒素的沾染問題值得密切關(guān)注。

除YTX外,本研究還從蝦夷扇貝中檢測到了OA、DTX1和PTX2毒素。OA和DTX1是腹瀉性貝毒的主要毒素成分,有促使腫瘤形成的作用;PTX2是一類大環(huán)聚醚化合物,有明顯的肝臟毒性效應(yīng),也被稱為肝損傷性貝毒。OA和DTX1類毒素在中國近海較為常見,在遼寧、天津、山東、江蘇、浙江、福建、廣東以及香港等地貝類中均有檢出(Zhouet al,1999;傅云娜等,2003)。PTX2以往也曾經(jīng)在煙臺的櫛孔扇貝(Chlamys farreri)、福建的蛤蜊(Mactra chinensis)及貽貝(Mytilus galloprovincialis)、大連海域的牡蠣(Crassostrea gigas)中檢出(Liet al,2012a;Liuet al,2011;姚建華等,2010a)。其中,2012年采自福建寧德和浙江寧波兩地貽貝(Mytilus galloprovincialis)中檢出OA,DTX1和PTX2(147μg/kg),可能與兩地發(fā)生的腹瀉性貝毒中毒事件有關(guān)。在北黃海海域的貝類樣品中,也曾多次檢測到OA、DTX1和PTX2毒素(表1)。但是,在北黃海蝦夷扇貝樣品中,PTX2 是首次檢測到。根據(jù)歐盟規(guī)定(Anonymous,2011),貝肉中脂溶性藻毒素OA、DTXs、PTXs的含量總和不得超過160 μg/kg,參照這一標(biāo)準(zhǔn),扇貝樣品3的內(nèi)臟團中OA、DTXs和PTXs總含量(162μg/kg)已超過歐盟的食用安全標(biāo)準(zhǔn)。因此,對于貝類中的OA類和PTX類毒素,也應(yīng)給予密切關(guān)注。

本文首次對北黃海蝦夷扇貝各組織中脂溶性藻毒素的分布情況進行了研究,結(jié)果表明,蝦夷扇貝各組織中脂溶性藻毒素的含量存在明顯差異,在一定程度上反映出各組織對脂溶性毒素富集能力的差異。在各個組織中,內(nèi)臟團的毒素含量最高,閉殼肌最低,各組織中脂溶性毒素含量依次為:內(nèi)臟團＞性腺＞外套膜＞閉殼肌。

3.2 蝦夷扇貝中脂溶性毒素來源淺析

以往研究表明,貝類中的OA、DTX1和PTX2毒素主要來自于甲藻中鰭藻屬和原甲藻屬的有毒藻種,包括Dinophysis fortii、D.acuminata、D.acuta、D.norvegica、D.mitra、D.rotundata、D.triposs,以及Prorocentrum lima、P.maculosum、P.redfield等(楊維東等,2005)。其中,鰭藻屬中D.fortii、D.acuta和D.acuminata是重要的產(chǎn)毒藻,在中國沿海也較為常見(王朝暉等,1998;張樹林等,2003;王金輝等,2006;Liet al,2012a)。對本研究同時采集的浮游植物樣品分析發(fā)現(xiàn)(詳細數(shù)據(jù)未給出),北黃海海域鰭藻細胞豐度較高,最高達 3100 cells/L,鰭藻優(yōu)勢種是漸尖鰭藻(D.acuminate)和倒卵形鰭藻(D.fortii),都是潛在的產(chǎn)毒藻種。羅璇研究了膠州灣海域鰭藻的產(chǎn)毒狀況,發(fā)現(xiàn)膠州灣的漸尖鰭藻能夠產(chǎn)生OA、DTX1和PTX2毒素;倒卵形鰭藻和圓形鰭藻也都能夠產(chǎn)生PTX2毒素,但產(chǎn)毒狀況有明顯差別(羅璇,2011)。因此,在北黃海海域貝類樣品中的脂溶性毒素 OA、DTX1和 PTX2應(yīng)主要來自該海域的有毒鰭藻。在研究中發(fā)現(xiàn),不同站位的扇貝樣品之間OA、DTX1和PTX2毒素組成有所差異,可能是由該海域產(chǎn)毒鰭藻的分布差異所致。除鰭藻之外,另外一種重要的產(chǎn)毒藻——利瑪原甲藻(Prorocentrum lima)在我國近海也有發(fā)現(xiàn)。南海海域有觀察到利馬原甲藻的報道(王朝暉等,1998;Liet al,2012b),北黃海大連海域也發(fā)現(xiàn)有原甲藻的存在(張樹林等,2003),但是否與蝦夷扇貝中的脂溶性毒素有關(guān),還需進一步研究。

YTXs是1987年Murata等人從蝦夷扇貝體中發(fā)現(xiàn)的一類藻毒素,YTXs主要來源于網(wǎng)狀原角藻、多邊舌甲藻和具刺膝溝藻(Hesset al,2007)。但是,這三種甲藻并不是常見的赤潮藻種,在赤潮監(jiān)測中常被人們忽視。北黃海海域的扇貝中檢出YTX,說明該海域存在著相應(yīng)的產(chǎn)毒藻種。2007年,中國海洋環(huán)境質(zhì)量公報指出我國韭山列島東部海域發(fā)生過具刺膝溝藻赤潮,此外,在黃渤海表層沉積物中曾發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀原角藻、多邊舌甲藻和具刺膝溝藻孢囊(高春蕾等,2010;邵紅兵等,2012)。今后應(yīng)加強對YTX產(chǎn)毒藻種的監(jiān)測工作。

GYM毒素目前只在我國廣東沿海的牡蠣(Crassostreagigas和C.ariakensis)中有檢出(姚建華等,2010a;Liuet al,2011),AZA1毒素在采自廣州的江珧(Atrinapectinata)和采自大連的櫛孔扇貝(Chlamys farreri)中有檢出(姚建華等,2010a),SPX1毒素僅在采自廣州的牡蠣(Crassostrea gigas)中有檢出(姚建華等,2010a),這些毒素的檢出率和含量并不高,本研究并沒有發(fā)現(xiàn)這些脂溶性藻毒素,這可能是因為北黃海海域不存在這些毒素的產(chǎn)毒藻種,也可能與各種藻毒素在不同貝類品種間的富集能力存在差異有關(guān),例如牡蠣對GYM的富集能力高于其它貝類,櫛江珧?qū)ZA1的富集能力較強等(姚建華等,2010b)。

4 結(jié)論

本研究通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法從北黃海海域蝦夷扇貝的閉殼肌、外套膜、內(nèi)臟團和性腺組織中檢出了OA、DTX1、PTX2和YTX四種脂溶性毒素,未檢出AZA1、SPX1和GYM毒素,其中從我國沿海蝦夷扇貝中檢測到PTX2系首次報道。毒素在四種組織中的含量由高到低依次為內(nèi)臟團＞性腺＞外套膜＞閉殼肌;不同組織間的毒素組成無明顯差別,以YTX含量最高,占脂溶性毒素總含量的90%以上,部分扇貝樣品內(nèi)臟團中的YTX含量超過歐盟安全食用標(biāo)準(zhǔn)。與扇貝樣品同期采集的浮游植物樣品中鰭藻密度較高,有可能是扇貝樣品中OA,DTX1和PTX2的潛在來源。為防范藻毒素對水產(chǎn)品消費者造成危害,應(yīng)該加強對北黃海海域貝類中藻毒素及海水中有毒藻類的監(jiān)測。

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