俞凱成 王健鑫① 陶 詩(shī) 劉明華 蔣 然 劉雪珠 黃 備

(1.浙江海洋學(xué)院海洋微生物分子生態(tài)與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室 舟山 316022;2.浙江省舟山海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站 舟山 316021)

海洋沉積物覆蓋了超過(guò)地球表面2/3的面積,是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,更是地球上主要的微生物棲息地(Whitmanet al,1998)。由于海底沉積物的特殊地理環(huán)境,其中的微生物往往具有一些適應(yīng)其環(huán)境的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)上的特異性(戴欣等,2001),同時(shí)沉積物微生物還在整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用(K?steret al,2008),因此了解海洋沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性有著重要的意義。

東海是西太平洋構(gòu)造活動(dòng)帶中一個(gè)大型邊緣海,處于 21°54′—33°17′N,117°05′—131°03′E 之間,是西太平洋溝-弧-盆體系的典型發(fā)育地區(qū)(李家彪,2008)。東海不僅有著多樣的水文條件、顯著的物理化學(xué)梯度、顯著的季節(jié)差異,同時(shí)有很高的初級(jí)生產(chǎn)力,是碳和其它物質(zhì)在全球生物地球化學(xué)循環(huán)的重要場(chǎng)所,也是研究海底各種沉積作用和微生物群落多樣性的有利場(chǎng)所(王健鑫等,2012)。東海陸架沉積環(huán)境微生物多樣性的研究多集中在細(xì)菌(宋志剛等,2006;Zenget al,2007;王健鑫等,2012)和古菌(張林寶等,2010)等原核生物,對(duì)于真核微型生物多樣性的研究較少(Parket al,2008),同時(shí)分析方法也比較單一,導(dǎo)致對(duì)于東海沉積環(huán)境真核微型生物缺乏系統(tǒng)科學(xué)的了解。

在真核微型生物分子多樣性研究中,18S rDNA是最常使用的靶標(biāo)基因之一,既可針對(duì)保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),又可根據(jù)可變區(qū)來(lái)區(qū)分不同種真核生物的差異(汪岷等,2009);另外核糖體基因間隔區(qū)(ITS區(qū))也是常用的靶標(biāo)基因,由于其進(jìn)化速率較快,被認(rèn)為比較適合在較小的分類階元層次進(jìn)行鑒定和多樣性分析(Rodríguezet al,2005)。在對(duì)真核微型生物分子多樣性進(jìn)行研究時(shí),應(yīng)根據(jù)各個(gè)靶標(biāo)基因的特點(diǎn)來(lái)綜合分析,以增加結(jié)果準(zhǔn)確性,雖然針對(duì)陸生環(huán)境已有部分不同引物擴(kuò)增效果的比較研究(Andersonet al,2003),但在海洋沉積環(huán)境中不同引物擴(kuò)增微型真核生物的相關(guān)比較研究尚未涉及。

本文以東海陸架DH-13站點(diǎn)沉積物為研究對(duì)象,選擇三對(duì)真核微型生物的通用引物(NS1/NS4、EF3/EF4、ITS1/ITS4),通過(guò) 18S rDNA、ITS區(qū)的基因克隆和文庫(kù)構(gòu)建,進(jìn)行分類學(xué)、多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析,以期為海洋沉積物真核微型生物多樣性研究的引物選擇提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本文分析所用的沉積物樣品是2007年4—5月海洋調(diào)查項(xiàng)目所采集的DH-13號(hào)沉積物柱樣表層樣品,采樣點(diǎn)坐標(biāo)為(31°30.103′N,123°29.844′E),水深 40m,位于東海陸架長(zhǎng)江古河口區(qū)。樣品采集后立即將0—10cm的沉積物柱芯以3cm為單位分為4層,分裝于無(wú)菌樣品袋中,–20°C保存,后放置于實(shí)驗(yàn)室–80°C超低溫冰箱中長(zhǎng)期保存,沉積物以中細(xì)砂為主。

1.2 樣品總DNA的提取與純化

利用 FastPrep?-24 快速核酸提取儀(MP Biomedicals公司)和FastDNA spin kit for soil試劑盒進(jìn)行DNA提取,核酸蛋白檢測(cè)儀(Bio-Rad公司)測(cè)定DNA濃度和純度,純化后用于PCR擴(kuò)增。

1.3 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物回收

將上述總DNA在梯度PCR儀(Biometra公司)中進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增采用通用引物ITS1/ITS4、NS1/NS4和EF3/EF4,見(jiàn)表1所示。50μL PCR擴(kuò)增體系:DNA模板 2μL,順?lè)匆?10μmol/ L)各 1μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,10×PCR buffer(含 MgCl2,1.5mmol/L)5μL,rTaq 聚合酶(5U/μL)1μL,雙蒸水補(bǔ)足至 50μL。PCR擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性4min;94°C變性30s,50°C退火 30s,72°C 延伸 60s,循環(huán) 35次;最后 72°C 延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果,并用DNA膠回收試劑盒(QIAGEN公司)回收產(chǎn)物。

1.4 克隆和測(cè)序

PCR回收產(chǎn)物與pMD-18T vector(TaKaRa公司)在 16°C連接過(guò)夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化子,挑選陽(yáng)性克隆,重新擴(kuò)增插入片斷,將含有合適大小插入片段的克隆送上海美季生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 三對(duì)通用引物的詳細(xì)信息Tab.1 Particular information of three universal primers

1.5 序列分析

將序列提交到RDP(ribosomal database project)Ⅱ數(shù)據(jù)庫(kù),利用在線工具CHECK- CHIMERA檢測(cè)嵌合體;應(yīng)用 BLASTN程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索相似性序列,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用ClustalX(Version 1.8)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析,通過(guò)MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Kumaret al,2004),采用 Neighbor-joining建樹(shù)方法,建樹(shù)結(jié)果進(jìn)行bootstrap1000次系統(tǒng)檢驗(yàn);利用 Phylip軟件包中DNASIS程序計(jì)算距離矩陣,利用 DOTUR計(jì)算OTU(Schlosset al,2005)。引物 ITS1/ITS4、EF3/EF4、NS1/NS4擴(kuò)增的部分序列在 GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的接受號(hào)分別為 KM067396—KM067409、KM067410—KM067425、KM067426—KM067449。

2 結(jié)果與分析

2.1 三對(duì)引物的真核微型生物文庫(kù)數(shù)據(jù)分析與對(duì)比

將測(cè)序返回的序列經(jīng)拼接去載體后,三對(duì)引物ITS1/ITS4、EF3/EF4和NS1/NS4分別獲得94、100和129個(gè)有效克隆子。通過(guò) DOTUR軟件將相似性大于97%的克隆子歸類為同一個(gè)OTU,ITS1/ITS4序列屬于35個(gè)OTU;EF3/EF4序列屬于61個(gè)OTU;NS1/NS4序列屬于80個(gè)OTU。三對(duì)引物克隆文庫(kù)的多樣性指數(shù)見(jiàn)表2 ,通過(guò)DOTUR軟件制作稀釋性曲線見(jiàn)圖1。

文庫(kù)分析結(jié)果表明:ITS1/ITS4、EF3/EF4、NS1/NS4三對(duì)引物克隆文庫(kù)的Chao 1指數(shù)、ACE豐富度指數(shù)和 Shannon-Weiner指數(shù)依次遞增,而Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)則依次遞減,4個(gè)指數(shù)都說(shuō)明三個(gè)文庫(kù)的多樣性以 NS1/NS4最高,EF3/EF4其次,ITS1/ITS4最后。從稀釋性曲線上可以看出,多樣性由高到低排列依次為NS1/NS4、EF3/EF4、ITS1/ITS4,與多樣性指數(shù)分析結(jié)果相一致;隨著克隆抽樣次數(shù)的增加,稀釋性曲線的斜率都有一定程度的變小,三對(duì)引物克隆文庫(kù)的 OTU類型都有一定程度的飽和,但I(xiàn)TS1/ITS4曲線相較于NS1/NS4和EF3/EF,明顯趨于平坦,說(shuō)明用于ITS1/ITS4多樣性分析的取樣數(shù)量要明顯少于其它兩對(duì)引物,相對(duì)較少的克隆子可以反映多數(shù)微型真核生物的物種信息。

表2 東海陸架表層沉積物真核微型生物多樣性指數(shù)Tab.2 The microeukaryotic diversity from the surface layer sediments of the East China Sea

圖1 三個(gè)文庫(kù)的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of three clone librares

2.2 三對(duì)引物的克隆文庫(kù)OTUs物種類群總述

應(yīng)用 BLASTN搜索相似性序列,顯示東海陸架DH13站點(diǎn)176個(gè)OTU可分為4界24個(gè)類群,如圖2所示。其中原生生物界(Protist,125個(gè)OTU)具有顯著的優(yōu)勢(shì)種群地位(占71%),包含絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa,64個(gè)OTU)、橫裂甲藻綱(Dinophyceae,25個(gè)OTU)、不等鞭毛門(mén)(Stramenopiles,13個(gè) OTU)、纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora,11個(gè) OTU)、無(wú)根蟲(chóng)門(mén)(Apusozoa,5個(gè)OTU)、頂復(fù)門(mén)(Apicomplexa,3個(gè)OTU)、囊泡蟲(chóng)總門(mén)(Alveolata,2個(gè)OTU)、隱藻門(mén)(Cryptophyta,1個(gè)OTU)和眼蟲(chóng)門(mén)(Euglenozoa,1個(gè)OTU)等9個(gè)類群。真菌界(Fungi)共有 35個(gè) OTU(占 19.9%),包含子囊菌門(mén)(Ascomycota,13個(gè) OTU)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota,11個(gè)OTU)、真菌類(Fungi environmental samples,8個(gè)OTU)、毛霉亞門(mén)(Mucoromycotina,2個(gè)OTU)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota,1個(gè)OTU)等5個(gè)類群。動(dòng)物界(Metazoa,13個(gè) OTU,占 7.4%)包含了環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida,4個(gè)OTU)、腕足動(dòng)物門(mén)(Brachiopoda,3個(gè)OTU)、扁形動(dòng)物門(mén)(Platyhelminthes,1個(gè)OTU)、線蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)(Nematoda,1個(gè)OTU)、軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca,1個(gè)OTU)、輪形動(dòng)物門(mén)(Rotifera,1個(gè)OTU)和刺胞動(dòng)物門(mén)(Cnidaria,1個(gè)OTU)等8個(gè)類群。豐度最少的植物界(Plantae,3個(gè) OTU,占 1.7%)則是包含綠藻門(mén)(Chlorophyta,1個(gè)OTU)和維管植物門(mén)(Tracheophyta,1個(gè)OTU)2個(gè)類群。

2.3 三對(duì)引物的克隆文庫(kù)OTUs物種類群比較

將三對(duì)引物ITS1/ITS4、EF3/EF4和NS1/NS4所獲得的克隆文庫(kù)(OTU分型)結(jié)果,以“門(mén)”為基準(zhǔn),比較三個(gè)文庫(kù) OTU的物種多樣性,分類標(biāo)準(zhǔn)以 NCBI Taxonomy上的分類為基礎(chǔ),結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4、圖5。

綜合分析圖3、圖4、圖5結(jié)果表明:三對(duì)引物的克隆文庫(kù)OTUs都至少包含了原生生物界(Protist)、真菌界(Fungi)、植物界(Plantae)三大界,且原生生物界(Protist)占據(jù)了很大的比重,均超過(guò)了 50%,而特異的是 NS1/NS4同時(shí)還有相當(dāng)多類群的動(dòng)物界(Metazoa)OTUs。

ITS1/ITS4克隆文庫(kù)分為4界11個(gè)類群(見(jiàn)圖3),其中主要為原生生物界(57.1%)和真菌界(34.3%)。原生生物界涵蓋了:橫裂甲藻綱(Dinophyceae,9個(gè)OTU),纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora,7個(gè) OTU),無(wú)根蟲(chóng)門(mén)(Apusozoa,1個(gè)OTU),絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa,1個(gè)OTU),不等鞭毛門(mén)(Stramenopiles,1個(gè) OTU)以及囊泡蟲(chóng)總門(mén)(1個(gè) OTU)。真菌界分為 3類群,子囊菌門(mén)(Ascomycota,10個(gè)OTU)含量最高,另有少量擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota,1個(gè) OTU)和真菌類(Fungi,2個(gè)OTU)。除此之外,動(dòng)物界的刺胞動(dòng)物門(mén)(Cnidaria,1個(gè) OTU)和植物界的綠藻門(mén)(Chlorophyta,1個(gè) OTU)也有被檢測(cè)到類似序列的存在。

EF3/EF4克隆文庫(kù)分為3界6個(gè)類群(見(jiàn)圖4),同樣以原生生物界(70.5%)和真菌界(27.9%)為主。原生生物界均為絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa,43個(gè)OTU)。真菌界分為4個(gè)類群,以壺菌門(mén)(Chytridiomycota,7個(gè)OTU)和真菌類(Fungi,5個(gè) OTU)為主,另有子囊菌門(mén)(Ascomycota,3個(gè)OTU)和毛霉亞門(mén)(Mucoromycotina,2個(gè) OTU)。植物界則是唯一的維管植物門(mén)(Tracheophyta,1個(gè)OTU)。

圖2 DH13站點(diǎn)中176個(gè)OTU的物種分類示意圖Fig.2 Species classification for 176 OTUs from station DH-13

圖3 ITS1/ITS4引物克隆文庫(kù)的OTU類群比例Fig.3 Ratio of OTU groups from clone library of primer pairs ITS1/ITS4

NS1/NS4克隆文庫(kù)展現(xiàn)了最高的多樣性,共含4界 19個(gè)類群(見(jiàn)圖5),原生生物界(占 77.5%)仍是最主要的優(yōu)勢(shì)種群,其中絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa,20個(gè)OTU)、橫裂甲藻綱(Dinophyceae,16個(gè)OTU)和不等鞭毛門(mén)(Stramenopiles,12個(gè) OTU)為主要的三個(gè)門(mén),此外還有眼蟲(chóng)門(mén)(Euglenozoa,1個(gè) OTU)、隱藻門(mén)(Cryptophyta,1個(gè) OTU)、無(wú)根蟲(chóng)門(mén)(Apusozoa,4個(gè)OTU)、纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora,4個(gè) OTU)、頂復(fù)門(mén)(Apicomplexa,3個(gè) OTU)以及囊泡蟲(chóng)總門(mén)(Alveolata environmental samples,1個(gè)OTU)。真菌界(占6.25%)以壺菌門(mén)(Chytridiomycota,4個(gè)OTU)為主。與其它兩對(duì)引物克隆文庫(kù)不同的是,NS1/NS4中動(dòng)物界(15%)占到了第二位,且多樣性較高,具有 7個(gè)類群:環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida,4個(gè) OTU)、扁形動(dòng)物門(mén)(Platyhelminthes,1個(gè)OTU)、線蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)(Nematoda,1個(gè)OTU)、腕足動(dòng)物門(mén)(Brachiopoda,3個(gè)OTU)、軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca,1個(gè)OTU)、輪形動(dòng)物門(mén)(Rotifera,1個(gè)OTU)和刺胞動(dòng)物門(mén)(Cnidaria,1個(gè)OTU)。植物界則以綠藻門(mén)(Chlorophyta,1個(gè)OTU)為代表。

圖4 EF3/EF4引物克隆文庫(kù)的OTU類群比例Fig.4 Ratio of OTU groups from clone library of primer pairs EF3/EF4

圖5 NS1/NS4引物克隆文庫(kù)OTU類群比例圖Fig.5 Ratio of OTU groups from clone library of primer pairs NS1/NS4

2.4 三對(duì)引物的克隆文庫(kù)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

2.4.1 三對(duì)引物的真菌克隆文庫(kù)系統(tǒng)發(fā)育分析分別從三對(duì)引物克隆文庫(kù)中選取代表性O(shè)TUs構(gòu)建真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7、圖8所示。

ITS1/ITS4克隆文庫(kù)構(gòu)建的真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)主要含子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)2個(gè)類群(圖6)。子囊菌門(mén)(Ascomycota)中的代表性基因型 DH132F36-A與一株來(lái)自于云南水稻根性寄生的未培養(yǎng)克隆子 R3-6有高同源性(99%),基因型DH132F27、DH132F14與地毯草(Axonopus compressus)根圈中分離的未培養(yǎng)土壤真菌克隆子 FITS_HRP1_W16具有高同源性(99%),基因型DH132F17-c與用于分解芒草和甘蔗細(xì)胞壁的Phaeosphaeriopsissp.TMS-2011有高同源性(99%),基因型 DH134F09與白黃筍頂孢霉(Acrostalagmus luteoalbusisolate L03)有高同源性(99%),此類霉菌同樣在深海環(huán)境中被發(fā)現(xiàn),并用于細(xì)胞毒素的研究(Wanget al,2012)。擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)中的代表性基因型 DH132F30-B與夏威夷海域的銀耳目(Tremellales)LM477有較高同源性(95%)。

EF3/EF4克隆文庫(kù)構(gòu)建的真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中主要類群為壺菌門(mén)(Chytridiomycota)和子囊菌門(mén)(Ascomycota)2個(gè)類群(圖7)。壺菌門(mén)(Chytridiomycota)中的基因型DH133F27與法國(guó)湖泊Pavin和Aydat中的未培養(yǎng)壺菌 PA2009B6有較高同源性(95%),基因型DH131F01-a與紅根囊壺菌(Rhizophlyctis roseaJEL 318)有 93%的同源性,基因型 DH134F60、DH134F06、DH134F11與喜馬拉雅山脈、落基山脈的未培養(yǎng)壺菌克隆子有 90%的同源性,先前的研究顯示高海拔土壤真菌中壺菌占主導(dǎo)地位(Freemanet al,2009)。子囊菌門(mén)(Ascomycota)中的基因型DHE134-1與海洋中的二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidate,DQ520881)有高同源性(99%),該酵母被認(rèn)為是三疣梭子蟹乳化病的致病菌(Wanget al,2007)。此外基因型DHE132-10與一株未培養(yǎng)Fungus clone nco32b11c1有高同源性(99%)。

圖6 根據(jù)ITS1/ITS4克隆文庫(kù)構(gòu)建的真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of Fungi according to clone library of primer pairs ITS1/ITS4

NS1/NS4克隆文庫(kù)構(gòu)建的真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中基因型都為壺菌門(mén)(Chytridiomycota),如圖8所示?；蛐?DH1331F43與海洋藻類病原體菌株-壺菌polysiphoniae有 93%的同源性,基因型 DH1321F31與 EF3/EF4中的部分基因型(DH134F60,DH134F06,DH134F11)相同,與喜馬拉雅山脈、落基山脈的未培養(yǎng)壺菌克隆有較高同源性(94%)。

2.4.2 三對(duì)引物的原生生物克隆文庫(kù)系統(tǒng)發(fā)育分析分別從三對(duì)引物克隆文庫(kù)中選取代表性O(shè)TUs構(gòu)建原生生物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖9、圖10、圖11所示。

ITS1/ITS4克隆文庫(kù)構(gòu)建的原生生物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)主要分為囊泡蟲(chóng)總門(mén)(Alveolata)、不等鞭毛門(mén)(Stramenopiles)、無(wú)根蟲(chóng)門(mén)(Apusozoa)和絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa)四大類。而囊泡蟲(chóng)總門(mén)(Alveolata)中的纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora)和雙鞭毛蟲(chóng)門(mén)(Dinoflagellata)下的橫裂甲藻綱(Dinophyceae),兩者占到了ITS1/ITS4克隆文庫(kù)原生生物界的絕大多數(shù)(圖9)。纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora)基因型 DH133-5和海洋擬急游蟲(chóng)(Strombidinopsis Sopsis99-1)有著高相似度(98%),基因型DH131-1和急游蟲(chóng)屬(StrombidiumLLK-2005)有著較高相似度(94%),而基因型DH131-2則與中國(guó)大陸海洋魚(yú)類中分離到的刺激隱核蟲(chóng)(Cryptocaryon irritans)相似,但相似度不高(85%)。橫裂甲藻綱(Dinophyceae)基因型 DH134-12與異帽藻(Heterocapsa)相似(89%),基因型DH133-31與裸甲藻(Gymnodinium beii)高度相似(99%)?；蛐虳H131-23與 MAST-4類群的未培養(yǎng)不等鞭毛門(mén)克隆子 M_IND70.7有著較高相似度(94%),MAST-4被認(rèn)為是一個(gè) 低 進(jìn) 化 多 樣 性 的 類 群(Rodríguez-Martínezet al,2012)。無(wú)根蟲(chóng)門(mén)(Apusozoa)基因型DH131-7與海洋中分離的Apusomonas proboscidea相似,但相似度不高(87%)。絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa)基因型DH132F19與海洋絲足蟲(chóng)類Thaumatomastix克隆子有著較高相似度(93%)。

圖7 根據(jù)EF3/EF4克隆文庫(kù)構(gòu)建的真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of Fungi according to clone library amplificated with primer pairs EF3/EF4

圖8 根據(jù)NS1/NS4克隆文庫(kù)構(gòu)建的真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of Fungi according to clone library amplificated with primer pairs NS1/NS4

EF3/EF4克隆文庫(kù)構(gòu)建的原生生物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示均為絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa),這與 ITS1/ITS4和NS1/NS4顯示出的原生生物多樣性顯著不同,如圖10所示。基因型DH131F02-a與未培養(yǎng)絲足蟲(chóng)類4-E2相似(95%),DH131F03與未培養(yǎng)絲足蟲(chóng)類3b-F5相似(95%),兩個(gè)相似序列均來(lái)自于波羅的海的海雪(sea snow)中。基因型 DH132F33-a和 DH133F22分別與來(lái)自加拿大不列顛哥倫比亞省海洋底棲生物棲息地中的絲足蟲(chóng)類CC-2009c和CC-2009e相似,相似度為96%和94%?；蛐虳H131F04-a與廣泛分布于國(guó)內(nèi)外沿海浮游生物群落中的吞噬鞭毛蟲(chóng)(Ebria tripartiteisolate 2)有94%的相似度?；蛐虳H133F46和基因型 DH132F15-a分別與海洋絲足蟲(chóng)類的CryothecomonasAPCC MC5-1Cryo和ThaumatomastixCC002有較高相似度,相似度為97%和96%。

圖9 根據(jù)ITS1/ITS4克隆文庫(kù)構(gòu)建的原生生物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.9 Phylogenetic tree of Protist according to clone library amplificated with primer pairs ITS1/ITS4

圖10 根據(jù)EF3/EF4克隆文庫(kù)構(gòu)建的原生生物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.10 Phylogenetic tree of Protist according to clone library amplificated with primer pairs EF3/EF4

NS1/NS4克隆文庫(kù)表現(xiàn)出了豐富的原生生物多樣性,選取其中4個(gè)主要類群囊泡蟲(chóng)總門(mén)(Alveolata)、不等鞭毛門(mén)(Stramenopiles)、絲足蟲(chóng)總門(mén)(Cercozoa)和無(wú)根蟲(chóng)門(mén)(Apusozoa)的代表性O(shè)TUs構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖11)。

圖11 根據(jù)NS1/NS4克隆文庫(kù)構(gòu)建的原生生物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.11 Phylogenetic tree of Protist according to clone library amplificated with primer pairs NS1/NS4

囊泡蟲(chóng)總門(mén)(Alveolata)分為纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora)和雙鞭毛蟲(chóng)門(mén)(Dinoflagellata)下的橫裂甲藻綱(Dinophyceae)兩個(gè)類群,與 ITS1/ITS4相同,纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora)基因型 DH1311F40與韓國(guó)西部海岸的Strombidinopsis jeokjoSBNS0310HJ有高度同源性(99%),基因型 DH132F32與黃海的Paradiscoce-phalus elongatus克隆子有高相似度(98%)。橫裂甲藻綱(Dinophyceae)基因型 DH1331F18與海洋環(huán)境中的Euduboscquella克隆子有較高相似度(95%),基因型DH1311F04與Gonyaulax spinifera克隆子有較高相似度(95%),基因型DHY1與Alexandrium satoanum克隆子有高同源性(99%),基因型 DH1331F38與貧氧海洋環(huán)境中的未培養(yǎng)雙鞭毛蟲(chóng) CCW105有 90%的相似度。基因型DH132F81與韓國(guó)西部海岸的Woloszynskia cincta克隆子有高同源性(99%),基因型DH1331F29與Lepidodinium chlorophorum克隆子有較高相似度(96%),基因型 DH1341F07與異帽藻(HeterocapsaHE04)有高相似度(99%),基因型 DHR3與Gyrodinium fusiforme克隆子有較高相似度(94%)。

不等鞭毛門(mén)(Stramenopiles)有代表性基因型OTU6個(gè),其中基因型 DH1324B08與一株為未識(shí)別的類似Haliphthoros克隆子NJM 0034相似度為97%;基因型 DH1311F11與北太平洋海域的未培養(yǎng)不等鞭毛類 897st19-43有高相似度(99%);基因型DH1331F06與來(lái)自于紅海東北海岸一個(gè)貧營(yíng)養(yǎng)站點(diǎn)的未培養(yǎng)不等鞭毛類 RS.12f.10m.367有較高相似度(95%),該站點(diǎn)的海洋不等鞭毛門(mén)(Marine Stramenopiles)類群多樣性豐富,是第二大類群(OTUs 16.8%)(Acostaet al,2013);基因型1331F46與南極洲海域的Thalassiosira CCMP982有高相似度(99%);基因型1311F14與美國(guó)紐約長(zhǎng)島海域沉積物的一個(gè)未培養(yǎng)LabyrinthulidPJS101305_35有98%的相似度;基因型1311F38與AplanochytriumTs1有高相似度(99%)。

絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa)與 EF3/EF4非常相似,基因型DH1341F20和基因型DH132F92分別與海洋絲足蟲(chóng)類的CryothecomonasAPCC MC5-1Cryo和ThaumatomastixCC002相似,相似度為99%和94%,基因型DH1341F23的相似序列來(lái)自于加拿大不列顛哥倫比亞省海洋底棲生物棲息地中的絲足蟲(chóng)類克隆子,相似度為98%,基因型DH1321F11與波羅的海海雪中的未培養(yǎng)絲足蟲(chóng)類 CC-2009b,相似度為98%。

無(wú)根蟲(chóng)門(mén)(Apusozoa)基因型 DH1331F03與AmastigomonasJJP-2003有較高同源性(96%),基因型DH132F05與Apusomonas proboscideaHFCC47有91%的相似度。

3 討論

3.1 真核微型生物多樣性研究中的引物選擇

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,越來(lái)越多的引物被設(shè)計(jì)應(yīng)用于真核微型生物分子生態(tài)學(xué)研究,除了本文使用的三對(duì)引物外,Euk1A/Euk516r(鮑磊等,2008)、nu-SSU-0817/nu-SSU-1196 or 1536(Bornemanet al,2000)、18S-42F or 82F/18S-1498R or 1520R(Takishitaet al,2006)、Euk-A/Euk-B(Koidet al,2012)等也同樣被應(yīng)用于真核微型生物的研究。

本文使用的三對(duì)引物最初被設(shè)計(jì)用于子囊菌、小麥根系等陸地真核微型生物多樣性的研究(Whiteet al,1990;Bernieret al,1994;Smitet al,1999),后來(lái)也被用于海洋環(huán)境真核微型生物研究,如 Lai等(2007)應(yīng)用ITS1/ITS4引物對(duì)南海深海甲烷水合沉積物中真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究,擴(kuò)增得到的大多數(shù)真菌可歸類為Ascomycota和Basidiomycota;Gao等(2008)應(yīng)用ITS1/ITS4、EF3/EF4等8對(duì)引物擴(kuò)增夏威夷海綿共附生真菌;Nagano等(2010)應(yīng)用 ITS1/ITS4引物擴(kuò)增到了深海沉積物中新的真菌類群;高遠(yuǎn)等(2012)應(yīng)用 ITS1/ITS4對(duì)鄂霍次克海冷泉沉積物真核微型生物多樣性進(jìn)行研究;Singh等(2012)分別使用NS1/NS4和ITS1/ITS4對(duì)深海沉積物中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)兩種形式的真菌進(jìn)行了擴(kuò)增。

但上述多數(shù)研究?jī)H使用單一引物對(duì)環(huán)境中真核微型生物進(jìn)行分析,研究者們也逐漸發(fā)現(xiàn)僅用單一引物來(lái)研究復(fù)雜環(huán)境樣本中的真核微型生物多樣性存在著偏倚和局限性,如Smit等(1999)在分析了小麥根系樣本后認(rèn)為引物 EF3/EF4略微偏向于擴(kuò)增擔(dān)子菌和接合菌。因此采用多種引物進(jìn)行比較分析的相關(guān)研究在近些年也逐漸被研究人員關(guān)注(Andersonet al,2003),但是對(duì)于海洋沉積環(huán)境的相關(guān)比較分析還未發(fā)現(xiàn),本文研究結(jié)果對(duì)更深入地開(kāi)展海洋沉積環(huán)境真核微型生物的多樣性研究有著借鑒作用。

3.2 不同引物的擴(kuò)增特異性及其多樣性

本文三對(duì)引物擴(kuò)增得到的克隆文庫(kù)均包含了沉積物中真核微型生物的主要類群:原生生物(Protist)和真菌(Fungi),NS1/NS4克隆文庫(kù)還獨(dú)特的擴(kuò)增到了一些動(dòng)物界(Metazoa)類群。

原生生物類群在三對(duì)引物中比例都達(dá)到了 50%以上,ITS1/ITS4克隆文庫(kù)與NS1/NS4克隆文庫(kù)均包含了橫裂甲藻綱(Dinophyceae)、纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora)、絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa)、無(wú)根蟲(chóng)門(mén)(Apusozoa)和不等鞭毛門(mén)(Stramenopiles)5個(gè)類群,且橫裂甲藻綱(Dinophyceae)在兩個(gè)文庫(kù)中均為優(yōu)勢(shì)類群(45%和 25.8%),此外NS1/NS4擴(kuò)增到了獨(dú)有的 3個(gè)類群(Apicomplexa,Cryptophyta,Euglenozoa),在三對(duì)引物對(duì)原生生物的擴(kuò)增中展現(xiàn)了最高的多樣性。但 EF3/EF4克隆文庫(kù)中所有原生生物克隆子均為絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa),這可能是由于 EF3/EF4引物對(duì)海洋沉積物中原生生物類群擴(kuò)增具有局限性。

真菌方面,三對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果各異。ITS1/ITS4克隆文庫(kù)主要是子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota);EF3/EF4克隆文庫(kù)是子囊菌門(mén)(Ascomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)和毛霉亞門(mén)(Mucoromycotina);NS1/NS4克隆文庫(kù)則基本都是壺菌門(mén)(Chytridiomycota)。這些類群與國(guó)際上沉積物真菌多樣性研究中的主要類群基本一致(Laiet al,2007;Naganoet al,2010;Singhet al,2012)。值得注意的是,Smit等(1999)認(rèn)為EF3/EF4引物在培養(yǎng)生物和環(huán)境樣本的擴(kuò)增中輕微偏向于擴(kuò)增擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和接合菌門(mén)(Zygomycota),但這兩個(gè)類群在東海陸架表層沉積物中都未被擴(kuò)增到,這可能是由于小麥根系與海洋沉積物的環(huán)境差異性所導(dǎo)致的,而 Burgaud等(2013)應(yīng)用EF3/EF4引物對(duì)美國(guó)特拉華河河口沉積物的擴(kuò)增所得主要類群為子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和壺菌門(mén)(Chytridiomycota),與本文結(jié)果類似。

3.3 引物選擇對(duì)海洋原生生物多樣性研究的影響

雖然三對(duì)引物在國(guó)際上的研究中多被用于真菌多樣性的研究,但根據(jù)本文的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,三對(duì)引物都擴(kuò)增到了較多的原生生物類群,尤其是NS1/NS4引物,原生生物類群的多樣性在三對(duì)引物中是最高的。Park等(2008)應(yīng)用引物18S-82F/18S- 1520R擴(kuò)增東海表層沉積物的研究中顯示,90%的克隆序列為原生生物,主要類群為纖毛蟲(chóng)門(mén)(Ciliophora,18%)、雙鞭毛蟲(chóng)門(mén)(Dinoflagellata,19%)、不等鞭毛門(mén)(Stramenopiles,11%)和絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa,20%),與本文三對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果基本一致,且除領(lǐng)鞭毛蟲(chóng)門(mén)(Choanozoa)外,Park等(2008)文中所擴(kuò)增得到的原生生物類群本文同樣擴(kuò)增得到。因此本文推斷,ITS1/ITS4、NS1/NS4引物同樣可應(yīng)用于海洋沉積物原生生物多樣性的研究中,作為其進(jìn)一步的補(bǔ)充和延伸,而 EF3/EF4則由于其在絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa)擴(kuò)增上的相對(duì)專一性,可能更適用于絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa)下不同種屬多樣性的研究。

4 結(jié)論

本文選擇三對(duì)真核微型生物的通用引物(NS1/NS4,EF3/EF4,ITS1/ITS4),通過(guò)18S rDNA、ITS區(qū)的基因克隆和文庫(kù)構(gòu)建,對(duì)東海陸架DH-13站點(diǎn)沉積物真核微型生物類群進(jìn)行分類學(xué)、多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析,研究發(fā)現(xiàn)三對(duì)引物的選擇不同對(duì)真核微型生物多樣性的影響較顯著,尤其是在原生生物的擴(kuò)增上。本文的研究結(jié)果再次說(shuō)明了對(duì)特異性PCR引物進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)以適用于目的類群擴(kuò)增的重要性和迫切性,同時(shí)也說(shuō)明了單一引物擴(kuò)增的局限性,通過(guò)多種引物綜合使用來(lái)評(píng)估復(fù)雜環(huán)境中真核微型生物多樣性是必要的,未來(lái)的研究和分析應(yīng)更注重于綜合性的處理方法。

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