吳 湘 吳 昊 葉金云

(1.浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 湖州 313000;2.湖州市環(huán)境保護監(jiān)測中心站 湖州 313000)

由富營養(yǎng)化引起的水華作為一種全球性環(huán)境問題,近年來受到人們越來越多的關(guān)注(de Figueiredoet al,2004),利用水生植物產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)(化感物質(zhì))控制藻類水華已成為水環(huán)境研究領(lǐng)域的前沿和熱點課題( 啟鮮 鳴等,2005;胡洪營等,2006)。這是一種高效、安全、簡便的生物抑藻技術(shù),具有抑藻作用強、成本低、材料天然易得、無二次污染等優(yōu)點?；形镔|(zhì)通常在自然條件下易降解,在生態(tài)系統(tǒng)中不會積累,對特定的藻類具有顯著的抑制作用。因此,從水生植物中提取化感物質(zhì)施入水體進行藻類控制研究具有重要的環(huán)境和生態(tài)意義。

鑒于多數(shù)水華藻種均能產(chǎn)生一定量的藻毒素(Coddet al,2005),因此在利用水生植物化感物質(zhì)進行藻類控制研究的過程中,化感物質(zhì)的生態(tài)安全性即其對含毒藻種產(chǎn)生和釋放藻毒素的影響規(guī)律同樣值得研究和關(guān)注。根據(jù)Jones等(1994)的研究發(fā)現(xiàn),在利用有機鰲合銅類的化學(xué)殺藻劑抑制銅綠微囊藻生長過程中,水體中的微囊藻毒素(MC-LR)含量明顯上升,維持14天后才因微生物的降解作用而被逐漸減低。因此,利用化學(xué)殺藻劑抑制產(chǎn)毒藻細(xì)胞生長極易產(chǎn)生水質(zhì)安全隱患,而利用水生植物的化感物質(zhì)進行藻類水華控制是否會引發(fā)同樣的安全問題也必須得到應(yīng)有的重視和關(guān)注,但是目前相關(guān)方面的研究十分有限,仍有待系統(tǒng)、全面地研究。

本試驗的研究對象為經(jīng)作者前期研究(吳湘等,2007)發(fā)現(xiàn)的高效脫氮除磷的水生浮葉植物黃花水龍(Jussiaea stipulaceaOhwi),它具有適應(yīng)性強、生物量大、次生代謝物質(zhì)豐富等特點,通過分離提取其中的化感物質(zhì)進行藻類控制研究具有良好的應(yīng)用前景。由于半數(shù)以上的水華藻種都能夠產(chǎn)生藻毒素,且銅綠微囊藻又是最為常見的水華優(yōu)勢藻種(Chenet al,2004;王欣伊等,2005),因此本試驗選用銅綠微囊藻(FACHB-905)為受試藻類,以藍(lán)藻毒素中最為常見、毒性最大的微囊藻毒素(MC-LR)為代表。通過研究黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長的抑制作用,確定其最佳抑藻濃度范圍,同時闡明黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻藻細(xì)胞內(nèi)外MC-LR產(chǎn)生或釋放的影響規(guī)律,從而為水生植物化感物質(zhì)在實際抑藻應(yīng)用時的有效量化及其生態(tài)安全性評價提供一定的科學(xué)借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃花水龍采自浙江省湖州市鄉(xiāng)村河道,采集時間為7月上旬,選取個體均勻、生長良好的植株,全株洗凈后于60°C烘箱干燥48h,備用。實驗所用銅綠微囊藻(FACHB-905)購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫,實驗前使用BG-11培養(yǎng)基(李鋒民等,2007)預(yù)培養(yǎng)7—8d,使之處于對數(shù)生長期。

1.2 實驗設(shè)置與方法

1.2.1 黃花水龍化感物質(zhì)的提取 稱取 20g黃花水龍干植物體(粉碎至50目),置于500mL錐形瓶中,加入400mL乙酸乙酯,超聲波常溫提取1h。提取結(jié)束后,用濾紙濾去提取液中的殘渣,并通過 0.22μm有機系濾膜除去顆粒物的干擾,之后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(100r/min,65°C)除去溶劑,獲得浸膏并稱重,最后用二甲基亞砜(DMSO)進行定容溶解,使得最高濃度組DMSO濃度小于1%,此濃度對銅綠微囊藻生長無影響(洪喻等,2008)。濃縮液在無菌條件下,通過0.22μm 無菌有機系濾膜除去微生物,于 4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃花水龍化感物質(zhì)的抑藻活性檢測及最佳抑藻濃度范圍的確定 采用培養(yǎng)液檢測法,通過搖瓶實驗對黃花水龍化感物質(zhì)進行抑藻活性檢測,并確定其最佳抑藻濃度范圍。將總體積為 200mL的藻類培養(yǎng)混合液(含5mL處于對數(shù)生長期的藻種液、一定量的經(jīng)121°C高溫滅菌30min的 BG-11培養(yǎng)液以及黃花水龍的化感物質(zhì))加入500mL錐形瓶中,其中黃花水龍化感物質(zhì)設(shè)置為5個濃度梯度,分別為0、25、50、75、150mg/L,每個濃度設(shè) 3個平行。將上述混合培養(yǎng)液置于溫度25°C,相對濕度70%,光照強度 50μmol/(m2·s),光暗比 14h︰10h的人工氣候室中培養(yǎng) 16d,每天通過顯微鏡計數(shù)法測定藻細(xì)胞密度,平行計3次,結(jié)果取均值。最后采用概率單位法擬合計算黃花水龍化感物質(zhì)的半效應(yīng)質(zhì)量濃度(EC50,7d),該數(shù)值越低,說明其抑藻效果越好。

1.2.3 黃花水龍化感物質(zhì)對MC-LR產(chǎn)生和釋放的影響測定 在 1.2.2實驗的基礎(chǔ)上,分別測定培養(yǎng)對數(shù)期(7d)和穩(wěn)定期(16d)時胞外培養(yǎng)液和藻細(xì)胞中的MC-LR含量以及藻細(xì)胞密度。采用固相萃取(SPE)聯(lián)合高效液相色譜(HPLC)法測定微囊藻毒素MC- LR的含量。在進行MC-LR的HPLC測定前,先將待測的銅綠微囊藻培養(yǎng)液參照宋立榮等(1999)方法進行預(yù)處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

根據(jù)藻密度計算黃花水龍化感物質(zhì)對藻細(xì)胞的相對抑制率:

其中IR為相對抑制率,N為加入化感物質(zhì)組的藻密度(ind./mL),N0為對照組的藻密度(ind./mL)。采用概率單位法擬合計算EC50,7d。所有樣品平行測定3次,實驗結(jié)果取其均值。利用Excel進行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻(FACHB-905)的生長抑制作用及其最佳抑藻濃度范圍的確定

黃花水龍化感物質(zhì)以不同濃度梯度(0、25、50、75、150mg/L)分別投放到定量的銅綠微囊藻培養(yǎng)液中,同時進行抑藻效果測定。圖1分別對應(yīng)各濃度組每天的藻密度變化及其相對抑制率(IR)。根據(jù)圖1a,在7d的培養(yǎng)期內(nèi),化感物質(zhì)對銅綠微囊藻的生長抑制作用隨著化感物質(zhì)濃度的增加而逐漸增強。采用概率單位法擬合計算求得黃花水龍化感物質(zhì)的 EC50,7d值為47mg/L,說明黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長具有較強的抑制作用。但在培養(yǎng)后期,各濃度組的抑制率均呈下降趨勢,說明化感物質(zhì)對藻細(xì)胞的生長抑制作用會隨著時間延長而逐漸減弱。這可能與化感物質(zhì)中有效抑藻成分存在降解或轉(zhuǎn)化作用(洪喻等,2009)有關(guān),具體機理有待進一步探討。

圖1b的結(jié)果表明,不同濃度組的黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長的影響作用也不同。其中對照組(0mg/L)隨著時間延長藻細(xì)胞數(shù)目迅速增加(圖1a);低濃度組(25mg/L)的化感物質(zhì)在試驗開始1—2d內(nèi)對藻細(xì)胞生長反而起促進作用,IR在-6.7%—5.2%之間,3d后才逐漸表現(xiàn)出對藻細(xì)胞生長的抑制作用,但是IR始終低于25%,抑藻效果較差。整個培養(yǎng)期內(nèi),除低濃度組外,其余濃度組對銅綠微囊藻均呈現(xiàn)出較顯著的生長抑制作用,這種低劑量促進、高劑量抑制和先促進后抑制的趨勢,之前已有相關(guān)文獻報道(何池全等,1999;劉光濤等,2011)。

圖1 不同濃度的黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻藻密度(a)和相對抑制率(b)的影響Fig.1 Influence of different concentrations of J.stipulacea allelochemicals on the algae density(a),the inhibition ratio(b)of M.aeruginosa

中濃度組(50mg/L)的黃花水龍化感物質(zhì)在藻細(xì)胞培養(yǎng)4d時對藻細(xì)胞的IR就已達到60%,但是培養(yǎng)后期IR下降較快,藻細(xì)胞生長恢復(fù)明顯。Nakai等(1999)研究發(fā)現(xiàn),在一次性投加大型植物浸提液抑制銅綠微囊藻生長時,藻細(xì)胞在培養(yǎng)8d后即開始恢復(fù)生長,抑藻作用明顯減弱,這與本研究得到的結(jié)果類似。而較高濃度組(75mg/L)和高濃度組(150mg/L)的黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻的生長抑制變化趨勢相類似,藻細(xì)胞培養(yǎng)3d時IR都已大于85%,培養(yǎng)后期IR雖有下降,但是較其他濃度組緩慢,化感物質(zhì)仍發(fā)揮較好的抑藻作用。由此可知,雖然濃度越高對藻細(xì)胞生長的抑制作用越顯著,但是當(dāng)濃度達到一定值時,濃度增加對提高IR影響不大,75mg/L和150mg/L的抑藻效果差異不顯著,出現(xiàn)了閾值效應(yīng),因此從節(jié)約原材料的角度考慮,75mg/L即可達到最好的抑藻效果。

綜上所述,黃花水龍化感物質(zhì)的最佳抑藻濃度范圍應(yīng)為 50—75mg/L,銅綠微囊藻在培養(yǎng) 4—7d內(nèi)其相對抑制率可達50%—95%?；形镔|(zhì)之所以能夠抑制藻細(xì)胞生長,估計與其能提高藻細(xì)胞的呼吸速率,降低光合作用速率,降低葉綠素a含量有關(guān)( 啟鮮鳴等,2005)。同時根據(jù)李鋒民等(2007)的研究報道,化感物質(zhì)在較低濃度時可以提高銅綠微囊藻的過氧化物酶、超氧化物歧化酶和脫氫酶的活性,而高濃度的化感物質(zhì)則顯著降低了這些酶的活性。抑制銅綠微囊藻的抗氧化酶體系并促進藻類葉綠素的降解可能是化感物質(zhì)的抑藻機理之一(Qianet al,2009)。本實驗同樣發(fā)現(xiàn),隨著黃花水龍化感物質(zhì)濃度的增加,且達到一定濃度范圍后,銅綠微囊藻單位藻細(xì)胞的葉綠素a含量迅速減少,與藻密度的變化趨勢一致,而葉綠素a含量與光合作用有關(guān),從另一角度間接反映了化感物質(zhì)的投加可以抑制藻類的光合作用,且化感物質(zhì)濃度的高低與其抑藻活性顯著相關(guān)。

2.2 黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻(FACHB-905)MC-LR產(chǎn)生和釋放的影響

2.2.1 黃花水龍化感物質(zhì)對MC-LR釋放的影響 投加黃花水龍化感物質(zhì)7d后胞外培養(yǎng)液中MC-LR的濃度參見表1,而16d后培養(yǎng)液中的MC-LR濃度均未被檢出,因此未列入表1。從表1可以看出,不論是對照組(0mg/L),還是其他濃度組(25—150mg/L),7d時胞外培養(yǎng)液中 MC-LR濃度都很低,小于 WHO推薦的飲用水體中MC-LR的最高限值1μg/L(Coddet al,2005);而藻細(xì)胞在培養(yǎng) 16d后開始進入生長穩(wěn)定期,胞外培養(yǎng)液中MC-LR濃度均低于檢測下限。這說明,在本試驗16d的培養(yǎng)期內(nèi),黃花水龍化感物質(zhì)的投加對銅綠微囊藻MC-LR的釋放無顯著影響。即使黃花水龍化感物質(zhì)的濃度達到最大值150mg/L時,整個培養(yǎng)期內(nèi)藻細(xì)胞向胞外釋放的藻毒素的量還是很少,有時甚至無法檢出。

表1 投加黃花水龍化感物質(zhì)7d后胞外MC-LR的濃度Tab.1 Concentrations of extracellular MC-LR after adding J.stipulacea allelochemicals for 7 days

Robilllot等(2000)研究認(rèn)為,無任何外界干擾情況下的藻細(xì)胞在培養(yǎng)前期胞外藻毒素濃度很低,可以忽略;進入穩(wěn)定期前胞外藻毒素濃度都會維持在較低水平。本試驗在藻細(xì)胞培養(yǎng)16d時即進入穩(wěn)定期,對照組依然未能檢測出胞外 MC-LR,意味著藻類在正常環(huán)境下向周圍水體釋放藻毒素的量并不多,而之所以目前存在許多藻毒素污染水體的問題,主要原因還是人們在施加化學(xué)殺藻劑時,引起死亡藻細(xì)胞內(nèi)藻毒素的大量釋放。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用硫酸銅化學(xué)殺藻劑處理銅綠微囊藻水華時,水體中的 MCLR(即胞外 MC-LR)含量明顯升高,嚴(yán)重威脅水域生態(tài)安全(Joneset al,1994)。而在本試驗中,黃花水龍化感物質(zhì)既能有效抑制銅綠微囊藻的生長,又不會引起藻細(xì)胞的胞內(nèi)藻毒素向外釋放,生態(tài)安全性高,因此可將黃花水龍化感物質(zhì)應(yīng)用至實際水華水體的處理中。

2.2.2 黃花水龍化感物質(zhì)對MC-LR產(chǎn)生的影響 根據(jù)圖2a,對照組(0mg/L)的單位藻細(xì)胞 MC-LR含量(用 106單位個數(shù)藻細(xì)胞內(nèi) MC-LR的質(zhì)量來表示)與Wiedner等(2003)的測定結(jié)果在同一水平。培養(yǎng)7d后,隨著黃花水龍化感物質(zhì)濃度的增加,銅綠微囊藻培養(yǎng)液中單位藻細(xì)胞 MC-LR含量也隨之增加,當(dāng)化感物質(zhì)濃度為50—150mg/L時,單位藻細(xì)胞MC-LR含量顯著升高。

圖2 不同濃度的黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻的胞內(nèi)MC-LR含量(a)、MC-LR產(chǎn)生總量(b)的影響Fig.2 Influence of different concentrations of J.stipulacea allelochemicals on the intracellular MC-LR(a)and total MC-LR(b)contents in M.aeruginosa

培養(yǎng)7d后,除低濃度組外,黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻產(chǎn)生了較強的化感抑制作用,藻細(xì)胞生長速率明顯減緩,藻密度一直維持在較低水平,且胞內(nèi)MC-LR含量顯著升高。由此可知,為了抵御化感物質(zhì)產(chǎn)生的脅迫作用,存活下來的藻細(xì)胞會合成更多的藻毒素(Janget al,2003)。Kearns等(2000)研究認(rèn)為,藻細(xì)胞的內(nèi)部能量一方面用于合成自身生長所需的營養(yǎng)物質(zhì),另一方面還可用于抵御外界環(huán)境脅迫的影響,例如銅綠微囊藻藻細(xì)胞在化感物質(zhì)的作用下會將更多的能量用于藻毒素的合成,從而導(dǎo)致自身生長速率變緩。

培養(yǎng)16d后,黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻的生長抑制作用減弱,藻細(xì)胞開始恢復(fù)生長,此時單位藻細(xì)胞中MC-LR含量的變化受化感物質(zhì)濃度的影響不顯著。因此可以認(rèn)為,培養(yǎng)16d后,黃花水龍化感物質(zhì)對培養(yǎng)液中銅綠微囊藻胞內(nèi)MC-LR產(chǎn)生的促進作用減弱,基本恢復(fù)到對照組水平。這可能與之前討論中提到的化感物質(zhì)存在天然降解和轉(zhuǎn)化作用有關(guān)。

根據(jù)表1所示,銅綠微囊藻在整個試驗期內(nèi)向胞外釋放的MC-LR含量極少,因此可不計入藻細(xì)胞MC-LR產(chǎn)生總量的計算中。單位藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR含量與相應(yīng)藻密度的乘積即可作為MC-LR產(chǎn)生總量的結(jié)果。圖2b的結(jié)果表明,隨著黃花水龍化感物質(zhì)濃度的增加,培養(yǎng)7d后藻細(xì)胞MC-LR產(chǎn)生總量逐漸降低,這可能是由于隨著化感物質(zhì)濃度的增加,雖然單位藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR的含量會有所升高,但是同時藻密度也在迅速降低,因而使得兩者結(jié)合產(chǎn)生的MC-LR總量依然呈現(xiàn)下降趨勢,可見影響MC-LR產(chǎn)生總量的主要因子應(yīng)為藻密度測定值。培養(yǎng)16d后,除最高濃度組外,培養(yǎng)液中MC-LR的產(chǎn)生總量隨化感物質(zhì)濃度的增加變化不顯著,和圖2a反映的結(jié)果一致。150mg/L處理組在培養(yǎng)7d、16d時MC-LR產(chǎn)生總量都是所有濃度處理組中最低的,這可能是因為化感物質(zhì)濃度越大,有效抑藻成分含量越多,即使到了16d,剩余的有效抑藻成分依然較其他濃度組多,對藻細(xì)胞生長還能發(fā)揮一定的抑制作用,從而使得MC-LR產(chǎn)生總量較其他濃度組要低。因此,在本實驗投加黃花水龍化感物質(zhì)抑制銅綠微囊藻生長過程中,隨著化感物質(zhì)濃度增加,不會使培養(yǎng)液中MC-LR產(chǎn)生的總量增大。

3 結(jié)論

(1)黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻(FACHB-905)具有較強的生長抑制作用,EC50,7d值為47mg/L。培養(yǎng)1周內(nèi),隨著黃花水龍化感物質(zhì)濃度的增加,其抑藻效果逐漸增強,但是隨著時間延長其抑藻效果也會逐漸減弱。黃花水龍化感物質(zhì)的最佳抑藻濃度范圍應(yīng)為 50—75mg/L,在此濃度下培養(yǎng) 4—7d對銅綠微囊藻生長的相對抑制率可達50%—95%。此濃度范圍可作為黃花水龍化感物質(zhì)實際抑藻應(yīng)用時一個有效劑量的參考值。

(2)整個培養(yǎng)期間,黃花水龍化感物質(zhì)對銅綠微囊藻MC-LR的胞外釋放無顯著影響。培養(yǎng)7d后,單位藻細(xì)胞內(nèi) MC-LR的含量隨化感物質(zhì)濃度的增加而升高,16d后無顯著影響。由此可知,黃花水龍化感物質(zhì)既能有效抑制銅綠微囊藻的生長,又不會引起藻毒素的向外釋放,生態(tài)安全性高,可應(yīng)用至實際水體處理中。

致謝衷心感謝中國科學(xué)院水生生物研究所、湖州市環(huán)境保護監(jiān)測中心站在提供銅綠微囊藻藻種(FACHB-905),以及微囊藻毒素(MC-LR)測定方面提供的一切指導(dǎo)與幫助！

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