費(fèi)群勤，秦一禾，楊孟伽，鐘 梁，胡 冰，孫 怡*，曾曉雄

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me體外抑制α-葡萄糖苷酶活性

費(fèi)群勤，秦一禾，楊孟伽，鐘 梁，胡 冰，孫 怡*，曾曉雄

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為研究烏龍茶粗多酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-epigallocatechin gallate，EGCG）、甲基化EGCG（epigallocatechin3-O-（3-O-methyl）gallate，EGCG3’Me）對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，采用酶動(dòng)力學(xué)和紫外吸收光譜方法，探究并比較了三者的抑制活性及類型。結(jié)果表明：烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶均有較強(qiáng)的抑制作用，半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）依次為0.178、0.040、0.064 mg/mL；Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖顯示烏龍茶粗多酚和EGCG的抑制類型為非競爭抑制，而EGCG3’Me為競爭性抑制；紫外吸收光譜實(shí)驗(yàn)表明烏龍茶多酚樣品能夠使α-葡萄糖苷酶的吸收光譜發(fā)生藍(lán)移，推測酶蛋白的構(gòu)象有所變化。EGCG與EGCG3’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響和抑制類型的不同可能是由于EGCG的一個(gè)羥基被甲氧基取代所引起的。

烏龍茶粗多酚；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；甲基化表沒食子兒茶素沒食子酸酯；α-葡萄糖苷酶；紫外吸收光譜

茶多酚是茶葉的主要活性成分，主要包括表兒茶素（（-）-epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（（-）-epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（（-）-epicatechin gallate，ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-epigallocatechin gallate，EGCG）等，占茶葉干質(zhì)量的20%～35%，具有降血脂、降血糖、抗氧化等多種生物功能[1-5]，其中EGCG含量最高。在半發(fā)酵茶烏龍茶中還具有其他茶類少有的甲基化EGCG（epigallocatechin 3-O-（3-O-methyl）gallate，EGCG3’Me），結(jié)構(gòu)式見圖1，其酯溶性、穩(wěn)定性以及吸收率較EGCG均有所提高[6]。

圖1 EGCG和EGCG3’’Me的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of EGCG and EGCG3’Me

α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）是一種存在于小腸絨毛黏膜細(xì)胞刷狀緣的酶類，可以通過α-1,4糖苷鍵還原淀粉和其他多糖中的葡萄糖[7]。抑制α-葡萄糖苷酶的活性能夠減緩葡萄糖的生成，從而降低餐后血糖峰值，有效預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥[8]。近年來，多種α-葡萄糖苷酶抑制劑已被成功用于Ⅱ型糖尿病的治療，如市售的阿卡波糖和米格列醇等[9]。但這些化學(xué)合成的抑制劑，常具有多種毒副作用，如造成病人腹瀉、腸絞痛及腸紊亂等[10-11]。因此，從天然食源性材料中尋找高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要的研究意義[12-14]。

研究表明，茶多酚能夠有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并可以減緩血糖的快速升高[15-18]。Yilmazer-Musa等[15]報(bào)道了綠茶、白茶及其單體EGCG等對(duì)α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制作用；全吉淑等[17]研究表明綠茶提取物具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶多酚能夠顯著降低兔小腸刷狀緣囊泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力。烏龍茶中含有豐富的多酚類物質(zhì)，但相關(guān)抑制α-葡萄糖苷酶作用的研究甚少，因此研究烏龍茶多酚及其單體對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)具有重要實(shí)踐意義。

前期本課題組建立了茶葉兒茶素包括EGCG3’Me的分離、純化以及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析方法[19-21]，并采用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)與熒光原位雜交技術(shù)，評(píng)價(jià)了EGCG和EGCG3’’Me對(duì)腸道微生物菌群生長的影響[22]。本實(shí)驗(yàn)以烏龍茶為原料提取總多酚類物質(zhì)，并分離純化出EGCG和EGCG3’Me單體，進(jìn)一步研究三者對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性及可能機(jī)制，為天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏龍茶 市售。

酵母、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG） 美國Sigma公司；EGCG、ECG、EGC、EC標(biāo)品 日本Funakoshi公司；EGCG3’’Me標(biāo)品 本實(shí)驗(yàn)室自制；阿卡波糖 拜耳醫(yī)藥保健有限公司；聚酰胺樹脂 無錫臨江化學(xué)試劑廠；Toyopearl HW-40S 日本Tosoh公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；Synergy-2酶標(biāo)儀 美國Biotek公司；Genius 3旋渦混勻器 德國IKA公司；Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；HL-2B數(shù)顯恒流泵、BS-100A自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 烏龍茶粗多酚的制備及EGCG、EGCG3’Me的分離純化

稱取適量的烏龍茶粉，以料液比1∶20（m/V）在96 ℃的熱水中恒溫振蕩浸提40 min，室溫條件下4 500×g離心15 min，取上清液[22]，茶渣用同樣方法再次浸提，合并上清液并濃縮、凍干，得到烏龍茶粗提物。將凍干樣加水溶解后，過膜（0.45 μm），上樣于聚酰胺層析柱（1.6 cm×30 cm）。先用超純水洗脫2 BV以去除雜質(zhì)，后用80%的乙醇洗脫2 BV，洗脫液濃縮、凍干，得到烏龍茶粗多酚。將烏龍茶粗多酚溶解適量，上樣于Toyopearl HW-40S柱（5.0 cm×50 cm），然后用80%的乙醇洗脫收集（10 mL/管），HPLC檢測其中兒茶素的組成，合并所需組分，濃縮、凍干，得到EGCG和EGCG3’’Me單體樣品。

1.3.2 烏龍茶粗多酚含量測定及EGCG、EGCG3’Me純度的檢測

茶多酚含量采用Folin-Ciocalteu法測定[23-24]，EGCG和EGCG3’’Me純度采用HPLC外標(biāo)法檢測。色譜條件：TSKgel ODS-100Z色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；檢測波長280 nm；梯度洗脫（流動(dòng)相A：CH3COOH，pH 2.5；流動(dòng)相B：CH3OH）；洗脫時(shí)間15 min，流動(dòng)相A的比例由82%降至40%，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶活性測定

參照Li Ting等[25]的方法并稍作改進(jìn)：用pH 6.8的0.1 mmol/L磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配制一系列不同濃度梯度的硝基酚溶液，測定其在405 nm波長處的吸光度，繪制產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用PBS緩沖溶液分別配制0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶和2.5 mmol/L PNPG溶液。在96 孔板中先加20 μL 0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，再加120 μL PBS混勻后，于37 ℃水浴15 min，然后加入30 μL 2.5 mmol/L PNPG溶液作為底物，混勻后于37 ℃反應(yīng)15 min，加入80 μL的飽和 Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定其在405 nm波長處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出酶活力。α-葡萄糖苷酶活力單位定義為pH 6.8、37 ℃條件下每分鐘釋放1.0 μmol硝基酚為1 個(gè)活力單位（U）。

1.3.4 烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

在96 孔板中加入10 μL不同質(zhì)量濃度的烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’’Me水溶液，按1.3.3節(jié)所述方法加入α-葡萄糖苷酶和底物溶液反應(yīng)，測定酶活力。以PBS緩沖液為空白對(duì)照，相同濃度阿卡波糖為陽性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按公式（1）計(jì)算不同樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A1、A2分別為空白對(duì)照和不同樣品溶液在405 nm波長處的吸光度。

以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線，通過線性擬合計(jì)算不同樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

1.3.5 烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型的確定

選取各抑制劑質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL，加入不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 U/mL）的酶溶液，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行反應(yīng)，測定吸光度，確定反應(yīng)速率。以酶濃度對(duì)反應(yīng)速率作圖，以確定抑制類型。

選取抑制劑質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，酶濃度為0.5 U/mL，改變底物溶液的濃度（0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 mmol/L），進(jìn)行反應(yīng)并測定吸光度，繪制Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線圖，確定其動(dòng)力學(xué)特征及其最大反應(yīng)速率（Vmax）、米氏親和常數(shù)（Km）、解離常數(shù)（Ki）。對(duì)照組采用PBS替代抑制劑，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)通過公式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：[I]為抑制劑的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；α通過公式（3）確定。

式中：Vmax為未加入抑制劑的最大反應(yīng)速率/（mg/（mL·min））；V*max為加入抑制劑的最大反應(yīng)速率/（mg/（mL·min）），均可以通過上述酶抑制動(dòng)力學(xué)測定獲得。

1.3.6 紫外吸收光譜分析

烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶的紫外吸收光譜分析采用孟麗艷等[26]的方法并稍作修改。移取3.0 mL的不同質(zhì)量濃度（0.06、0.13、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的烏龍茶粗多酚、EGCG、EGCG3’’Me溶液、PBS溶液及0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液于石英比色池中，測定其200～300 nm波長處的紫外吸收光譜。再在0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液中分別加入300 μL上述不同質(zhì)量濃度的烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’’Me溶液，混勻，放置3 min后測定其200～300 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析，根據(jù)t檢驗(yàn)確定其顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏龍茶粗多酚的制備及EGCG、EGCG3’Me的分離純化

采用聚酰胺層析柱對(duì)1.3.1節(jié)所得到的烏龍茶浸提物進(jìn)行了初步純化，得到多酚含量為83.92%的烏龍茶粗多酚，其HPLC色譜見圖2B。烏龍茶粗多酚的主要成分為EGCG、EGCG3’Me、GCG、EC、ECG和CG，其中EGCG和EGCG3’Me含量占總多酚含量的27.58%和14.30%（表1）。通過Toyopearl HW-40S層析柱對(duì)烏龍茶粗多酚進(jìn)一步分離，可得到EGCG、EGCG3’’Me單體組分，其HPLC色譜圖分別見圖2C和圖2D，其純度均高于95%。

圖2 烏龍茶粗多酚及其純化組分的HPLCFig.2 HPLC chromatograms of crude extract of oolong tea and its purif i ed fractions

表1 烏龍茶茶多酚的兒茶素組成與含量Table1 Major polyphenols components and contents in oolong tea

2.2 烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

圖3 烏龍茶茶多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of oolong tea polyphenols on α-glucosidase activity

IC50可表征樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用強(qiáng)弱，IC50越小，抑制作用越強(qiáng)。由圖3可知，烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me的IC50均明顯小于阿卡波糖，表明烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果均強(qiáng)于市面所售的降血糖藥品阿卡波糖。

烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me三者之間比較可以看出EGCG的抑制效果最好，EGCG3’Me其次，粗多酚效果最弱，表明EGCG與EGCG3’’Me是烏龍茶茶多酚中抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要成分。此外，EGCG與EGCG3’’Me結(jié)構(gòu)不同，兩者產(chǎn)生的抑制效果也有所不同。EGCG的抑制效果優(yōu)于EGCG3’’Me，這可能是由于EGCG的一個(gè)羥基（OH）被甲氧基（OCH3）取代所引起的[27-28]。

2.3 烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型

圖4 烏龍茶粗多酚、EGCG、EGCG3’’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型Fig.4 Inhibition types of oolong tea polyphenols, EGCG and EGCG3’’Me on α-glucosidase

圖5 烏龍茶粗多酚（A）、EGCG（B）、EGCG3’Me（C）對(duì)α-葡萄糖苷酶的可逆抑制類型Fig.5 Reversible inhibition types of oolong tea polyphenols (A), EGCG (B), and EGCG3’Me (C) on α-glucosidase

酶的抑制類型分為可逆和不可逆抑制?？赡嬉种祁愋陀挚煞譃楦偁幮?、非競爭性、反競爭性抑制類型。由圖5可知，粗多酚和EGCG組與無抑制劑組都交于雙倒數(shù)圖像的x軸，可判斷其抑制類型為非競爭性可逆抑制類型。而EGCG3’Me組與無抑制劑組交于y軸，說明為競爭性可逆抑制類型。通過公式計(jì)算得出各樣品的Vmax、Km和Ki值，見表2。

表2 粗多酚、EGCG、EGCG3’Me的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table2 Kinetic parameters of oolong tea polyphenols, EGCG and EGCG3’Me

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同酚類對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型有所不同，如石榴皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用類型為反競爭性抑制[29]，蘋果多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶為非競爭性抑制類型[30]。這可能與其主要抑酶活性成分的組成和結(jié)構(gòu)以及與酶活性中心的結(jié)合部位和結(jié)合方式等的不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中EGCG3’’Me與EGCG的抑制類型的不同可能由其甲基化基團(tuán)導(dǎo)致。

2.4 烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me對(duì)α-葡萄糖苷酶紫外吸收光譜的影響

由圖6可知，α-葡萄糖苷酶的最大吸收峰在280 nm波長處。隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增加，α-葡萄糖苷酶的最大吸收波長略有減小，發(fā)生藍(lán)移，說明氨基酸所處環(huán)境的疏水性增加。蛋白質(zhì)波長的變化與所處的環(huán)境極性有關(guān)，可由波長的變化判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[31]。因此可推斷波長藍(lán)移是因?yàn)闉觚埐璐侄喾?、EGCG和EGCG3’Me樣品與α-葡萄糖苷酶結(jié)合導(dǎo)致了酶構(gòu)象的變化。

多酚類與酶等蛋白質(zhì)類相互作用主要是通過氫鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的復(fù)合物。氫鍵是由多酚類的羥基與蛋白質(zhì)以氫鍵形式多點(diǎn)結(jié)合[32-33]，烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me可通過酚羥基與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，從而改變酶的構(gòu)象，但因?yàn)镋GCG的甲基化而減少了一個(gè)酚羥基，從而削弱了甲基化EGCG的抑制效果，并改變了其抑制類型。

3 結(jié) 論

本研究從烏龍茶中分離制備了粗多酚及單體EGCG和EGCG3’’Me，并探究了其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3’Me的抑制效果明顯強(qiáng)于市面所售α-葡萄糖苷酶抑制藥物阿卡波糖，且抑制類型均為可逆抑制；EGCG和EGCG3’’Me的抑制效果明顯強(qiáng)于粗茶多酚，表明在抑制過程中，茶多酚各兒茶素組分中EGCG和EGCG3’’Me兩個(gè)單體發(fā)揮了主要作用；EGCG的一個(gè)羥基被甲氧基取代形成EGCG3’Me，導(dǎo)致它們的抑制效果和抑制類型均有所不同。茶多酚與酶的結(jié)合引起酶紫外吸收光譜的變化，形成比較穩(wěn)定的復(fù)合物，有效地改變了酶的活性基團(tuán)結(jié)構(gòu)，造成疏水性、酶活性等功能的降低，從而有效地影響了酶的生物活性功能。本研究為探究烏龍茶多酚作為天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

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in vitro Inhibitory Effects of Oolong Tea Polyphenols, EGCG and EGCG3”Me on α-Glucosidase Activity

FEI Qun-qin, QIN Yi-he, YANG Meng-jia, ZHONG Liang, HU Bing, SUN Yi*, ZENG Xiao-xiong
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The inhibitory effects of oolong tea polyphenols, EGCG and EGCG3”Me on α-glucosidase were comparatively investigated by enzyme kinetics and UV absorption spectroscopy, and the possible mechanisms involved were explored. The results showed that oolong tea polyphenols, EGCG and EGCG3”Me all had inhibitory effects on the activity of α-glucosidase, and the half inhibitory concentration (IC50) values were 0.178, 0.040 and 0.064 mg/mL, respectively. The Lineweaver-Burk double reciprocal plot indicated that the inhibition type of oolong tea polyphenols and EGCG was non-competitive inhibition, whereas EGCG3”Me was competitive inhibition. Furthermore, oolong tea polyphenols could induce a blueshift in the UV absorption maximum of α-glucosidase, suggesting the possible change in enzyme conformation. The differences in inhibitory effects and inhibition types between EGCG and EGCG3”Me may be due to their structural difference (the hydroxyl group in EGCG substituted by methoxy group to form EGCG3”Me).

oolong tea polyphenols; (-)-epigallocatechin gallate (EGCG); epigallocatechin3-O-(3-O-methyl) gallate (EGCG3’Me); α-glucosidase; UV absorption

TS272；TS201.3

A

1002-6630（2014）21-0010-06

10.7506/spkx1002-6630-201421003

2014-06-04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30871743）；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2013313）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

費(fèi)群勤（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2012108066@njau.edu.cn

*通信作者：孫怡（1966—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)化學(xué)與功能性食品開發(fā)。E-mail：sunyi01@njau.edu.cn