王遠(yuǎn)微，張誠民，索化夷，岳 華，李 鍵，湯 承,*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中馬克斯克魯維酵母菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

王遠(yuǎn)微1，張誠民1，索化夷2，岳 華1，李 鍵1，湯 承1,*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

對川西北部分牧區(qū)的10 份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品進(jìn)行酵母菌的分離，通過常規(guī)形態(tài)特征和26S rRNA基因測序分析鑒定出16 株馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。同源性分析顯示16 株分離菌與已知馬克斯克魯維酵母的同源性高達(dá)99.3%～100%。16 株分離菌中形成明顯的兩種序列類型，其中10 株分離菌與另外6 株分離菌相比在擴(kuò)增片段的第537位點(diǎn)上發(fā)生堿基缺失、第554位點(diǎn)上堿基由G突變?yōu)锳、第564位點(diǎn)上堿基由A突變?yōu)門。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示兩種序列類型的分離株也形成兩個獨(dú)立進(jìn)化分支。

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶；馬克斯克魯維酵母；分離鑒定；系統(tǒng)發(fā)育分析

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶是由青藏高原地區(qū)牧民采用傳統(tǒng)方法制作而成，其營養(yǎng)價值很高，蛋白質(zhì)和脂肪含量分別達(dá)到4.91%和6.89%[1-4]，且含有大量的揮發(fā)性脂肪酸[5]，并富有良好的風(fēng)味。其在維持腸道菌群生態(tài)平衡、促進(jìn)腸道蠕動、促進(jìn)消化、抗衰老、抗癌、提高人體免疫力等方面有很好的效果[6]。它是牧區(qū)非常傳統(tǒng)的奶制食品，也是牧民重要的經(jīng)濟(jì)收入來源。

牦牛酸奶是由牦牛乳經(jīng)傳統(tǒng)發(fā)酵方法制得，其發(fā)酵過程受海拔地理環(huán)境、氣候環(huán)境、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、制作方法、文化及奶源的影響，因此牦牛酸奶中微生物菌群非常復(fù)雜。Zhang Heping等[3]報道青海地區(qū)牦牛酸奶與其他發(fā)酵酸奶相比含有更多的乳酸菌和酵母菌，其中青海西北部的高原牦牛酸奶和青海東部的環(huán)湖牦牛酸奶中乳酸菌是優(yōu)勢菌，而青海南部的環(huán)湖牦牛酸奶中酵母菌是優(yōu)勢菌。Wu Xiaohe等[4]研究發(fā)現(xiàn)：3 種乳酸菌以及5 種酵母菌是西藏不同海拔地區(qū)牦牛酸奶中主要發(fā)酵菌群，其中發(fā)酵乳桿菌是優(yōu)勢菌。Koichi[7]對蒙古不同動物的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶的中乳酸菌和酵母菌的分離研究中發(fā)現(xiàn)，牦牛等動物酸奶中乳酸菌數(shù)量明顯高于酵母菌數(shù)量。從以上研究結(jié)果中可以看出牦牛酸奶中的微生物菌群盡管比較復(fù)雜，但是都含有乳酸菌和酵母菌，這也符合牦牛酸奶為典型的IV型發(fā)酵乳的特征，這種類型的發(fā)酵乳中優(yōu)勢微生物除乳酸菌外還有酵母菌[8]，只是有的地區(qū)的牦牛酸奶的優(yōu)勢菌是乳酸菌，有的是酵母菌，而且優(yōu)勢的乳酸菌和酵母菌的種類也有所不同。

隨著對傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中酵母菌研究的深入，越來越多的酵母菌種屬在各種乳制品中被檢出，克魯維酵母就是其中之一。有報道在開菲爾酸奶、蒙古酸馬奶、蘇丹發(fā)酵乳Rob、匈牙利發(fā)酵乳、意大利牛乳、水牛乳、山羊乳以及希臘的山羊干酪中都分離到該屬菌株[9-11]。馬克斯克魯維酵母是克魯維酵母屬中重要的一個種，該菌株被認(rèn)為是開菲爾酸奶和蘇丹發(fā)酵乳Rob中的優(yōu)勢酵母菌[12-13]。國內(nèi)Bai Mei等[14]也分別從青海地區(qū)和西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中分離出馬克斯克魯維酵母，但對川西北高原牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中馬克斯克魯維酵母菌的分離報道比較少。

本實(shí)驗對川西北地區(qū)的紅原、若爾蓋、康定等地的10 份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品進(jìn)行酵母菌的分離鑒定，并對分離菌進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，以期對川西北高原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中蘊(yùn)含的大量原始微生物菌種資源的保護(hù)及研究提供菌株，為該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中微生物組成研究以及馬克斯克魯維酵母菌的遺傳多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣本采自川西北地區(qū)的四川省阿壩洲紅原縣（3 份）、若爾蓋縣（3 份）和甘孜州康定縣（4 份），樣本置于4 ℃樣品箱運(yùn)到實(shí)驗室，立即進(jìn)行分離培養(yǎng)。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，yPD）培養(yǎng)基、革蘭氏染液 杭州微生物制劑有限公司；Taq DNA聚合酶、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑、DNA Marker、dNTPs 日本TaKaRa公司；瓊脂糖 美國Oxoid公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；AXy prepTMDNA Gel extraction kit 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCyclerTMPCR儀、Powerpac UniversalTM核酸電泳儀、VerSa Doc2000凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；超純水儀Milli-Q 法國Millipore公司；HR40- ⅡA2 生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；AR2130/C型精密電子天平 梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離與純化

吸取1 mL牦牛酸奶置于裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩使其混勻。將混合后牦牛酸奶進(jìn)行梯度稀釋，稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、 10-7。選取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75 個稀釋度，吸取1 mL 樣液采用涂布法均勻涂布于yPD培養(yǎng)基上，將制備好平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄菌落特征，挑取菌落較大，呈白色或乳白色的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)胞形態(tài)，呈圓形或橢圓形、臘腸狀且細(xì)胞較大者，再將其接種于yPD培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，重復(fù)幾次純化酵母菌，直至鏡檢結(jié)果為同一細(xì)胞形態(tài)后，將其接種于yPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，加入30%的滅菌甘油，混勻后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

將上述純培養(yǎng)菌株接種于yPD培養(yǎng)基斜面，置28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢菌體形態(tài)。

1.3.3 酵母菌的26S rRNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

1.3.3.1 PCR模板DNA的制備

將上述純化的酵母菌接種于yPD液體培養(yǎng)基中置于28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細(xì)菌基因組DNA，作為本實(shí)驗的PCR模板。

1.3.3.2 PCR引物

PCR擴(kuò)增的目的片段在酵母菌的大亞基26S rRNA的D 1/D 2可變區(qū)域內(nèi)，引物序列N L-1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，NL-4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’[15]，擴(kuò)增的目的片段大小在500～600 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3.3 PCR方法

PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系：DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol）、 4×dNTPs（10 mmol/L）2 μL、Taq酶（5 U/uL）0.125 μL、Mg2+3 μL（10 mol/mL）、10×PCR buffer 2.5 μL，超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR 程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min、52℃ 1 min、72 ℃1.5 min，36 個循環(huán)；72 ℃溫浴10 min，降至室溫后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3.4 目的片段的純化回收及測序

按照1.3.4.3節(jié)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件擴(kuò)增100 μL PCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳后按照回收試劑盒操作說明進(jìn)行目的片段的純化回收，回收后再2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將電泳檢測后的回收產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3.5 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將上述測序得到的26S rRNA基因序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，選擇同源性大于99%的10 個酵母序列的片段，同時調(diào)取GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的克魯維菌屬的18 個種的32 株酵母的相同區(qū)段基因序列，使用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多序列匹配比對，通過Mega4.1軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建分離酵母的同源序列系統(tǒng)進(jìn)化樹和克魯維酵母屬內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用自舉分析進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為3 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征

從四川紅原、若爾蓋、康定等地的10 份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品中分離到的16 個優(yōu)勢菌株，菌落形態(tài)呈圓形，表面光滑濕潤，顏色呈乳白色，表面凸起、邊緣整齊、不透明（圖1）。顯微鏡下細(xì)胞染色為藍(lán)紫色，形態(tài)為圓、橢圓、卵圓等，無性繁殖為芽殖，一端出芽，細(xì)胞形態(tài)符合酵母菌特征（圖2）。

圖1 分離菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolates

圖2 分離菌的細(xì)胞形態(tài)（1 000×）Fig.2 Cell morphology of isolates (1 000×)

2.2 酵母菌26S rRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

按照PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測結(jié)果顯示酵母26S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約587 bp左右處出現(xiàn)一條明亮的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖3）。

圖3 分離菌的26S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of 26S rRNA genes from 16 isolates

2.3 酵母菌26S rRNA基因測序同源比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)26S rRNA基因序列測定，擴(kuò)增序列長度為586～588 bp，與Genbank中同源性較高的菌株進(jìn)行同源性比對。結(jié)果顯示，分離的16 株酵母菌與Genbank中馬克斯克魯維酵母的同源性最高，相似度為99.3%～100%。序列分析顯示其中10 株分離菌與另外6 株分離菌形成明顯的兩種序列類型，10 株分離菌在擴(kuò)增片段的第537位點(diǎn)上發(fā)生堿基缺失、第554位點(diǎn)上堿基由G突變?yōu)锳、第564位點(diǎn)上堿基由A突變?yōu)門。

（4）某植物夏日晴天中午12：00時葉片的光合速率明顯下降，其原因是進(jìn)入也有細(xì)胞的（填“O2”或“CO2”）_______不足。

圖4 分離株和同源性較高菌株的26S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenic tree of Kluyveromyces marxianus and 16 isolates based on 26S rRNA gene sequences

圖5 克魯維菌屬26S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenic tree of Kluyveromyces based on 26S rRNA gene sequences

圖4為16株分離菌與Genbank中同源性最高的7 株馬克斯克魯維酵母的序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖4可知，與序列分析顯示的兩種序列類型的結(jié)果相同，16 株酵母分離株也成兩個大的分支，其中6 株分離菌與Genbank中的7株馬克斯克魯維酵母聚在一個分支，另外10 株分離菌聚在另一個大的分支上。

圖5為16 株分離菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的克魯維菌屬的18 個種的32 株酵母菌的相同區(qū)段基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖5可知，克魯維菌屬的18 個種的菌株分在不同的分支上，16 株分離菌與3 株馬克斯克魯維酵母和3 株乳酸克魯維酵母分在一個大的分支上，3 株乳酸克魯維酵母形成一小的分支，6 株分離株與3株馬克斯克魯維酵母形成一個小的分支，另外10 株分離菌單獨(dú)形成一個小的分支，這也與序列分析顯示的兩種序列類型的結(jié)果相同。

3 討 論

Kuttzman等[15]測定了大約500 種酵母的大亞基26S rRNA基因的D1/D2可變區(qū)的序列，包括假絲酵母和其他有性型及無性型子囊菌酵母幾乎所有已知種的模式菌株，發(fā)現(xiàn)用這段序列（500～600 bp）可以將絕大部分種區(qū)分開，同一種內(nèi)不同菌株間D2區(qū)的核苷酸差異不超過1%。這些序列均已公布在GenBank 等國際核酸序列數(shù)據(jù)庫中，給酵母菌的分子鑒定提供了很大方便。本實(shí)驗擴(kuò)增了16 株分離菌的26S rRNA基因的D1/D2可變區(qū)進(jìn)行測序分析，對分離菌進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 株酵母菌與馬克斯克魯維酵母的同源性最高，相似度為99.3%～100%，按照Kuttzman的同一種內(nèi)不同菌株間D2區(qū)的核苷酸差異不超過1%的結(jié)論，因此將16 株分離菌鑒定為馬克斯克魯維酵母。本實(shí)驗為川西北高原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中原始微生物菌種資源的保護(hù)及研究提供了菌株。

本實(shí)驗從川西北地區(qū)采集的10 份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品中均分離到了馬克斯克魯維酵母菌，分離率很高，共獲得了16 株分離菌，可見馬克斯克魯維酵母在該地區(qū)牦牛酸奶中是一種廣泛存在的菌株。本實(shí)驗為該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶的微生物組成研究提供參考。馬克斯克魯維酵母是克魯維酵母屬的一個成員，因其具有多種生物學(xué)作用[16]，得到了國內(nèi)外相關(guān)專家廣泛的關(guān)注和研究。發(fā)酵乳制品具有獨(dú)特的風(fēng)味是因為在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量的芳香化合物，馬克斯克魯維酵母可以產(chǎn)生芳香化合物，因此在某些乳制品中分離到馬克斯克魯維酵母可能是其具有獨(dú)特風(fēng)味的原因。有相關(guān)報道在發(fā)酵可可的時候添加馬克斯克魯維酵母可以改變可可的風(fēng)味[17]。馬克斯克魯維酵母還可以減少食品中的乳糖含量，在哺乳動物奶汁里，乳糖的含量達(dá)99.8%以上，但是除了新生兒之外，成人體內(nèi)的乳糖酶的活性都很低，“乳糖不耐受”人群體內(nèi)的乳糖酶活力尤其低，因此成人攝取的乳制品中的乳糖含量過多不但不能成為營養(yǎng)物質(zhì)，還可以引起高血糖和肥胖等癥狀。馬克斯克魯維酵母具有減少食品中的乳糖含量的作用，對乳制品的營養(yǎng)組成和人類的健康都有很大的意義。而且馬克斯克魯維酵母通過發(fā)酵分解乳糖，可以產(chǎn)生多種羰基化合物和揮發(fā)性脂肪酸，這些芳香物質(zhì)也是形成乳制品獨(dú)特的風(fēng)味的主要原因之一。馬克斯克魯維酵母在該地區(qū)牦牛酸奶中分離率很高，因此對該地區(qū)牦牛酸奶的風(fēng)味和營養(yǎng)價值研究具有重要的參考價值。

26S rRNA基因是核糖體RNA基因中的一員，具有進(jìn)化速率慢、序列保守性高的特點(diǎn)，但同時由于各種原因其基因序列中又具有一定的突變，而這些突變的序列具有種屬的差異，使其作為一種良好的生物分類鑒定材料而受到廣泛的重視，被作為種屬的鑒定以及分子分型的工具[18-19]。本實(shí)驗中對分離酵母的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示16 株分離菌其中10 株分離菌與另外6 株分離菌形成明顯的兩種序列類型，10 株分離菌在擴(kuò)增片段的第537位點(diǎn)上發(fā)生堿基缺失、第554位點(diǎn)上堿基由G突變?yōu)锳、第564位點(diǎn)上堿基由A突變?yōu)門，構(gòu)建的進(jìn)化樹中兩種序列類型的分離菌也形成兩個獨(dú)立分支，說明馬克斯克魯維酵母在遺傳進(jìn)化過程中具有一定多樣性，為馬克斯克魯維酵母菌的遺傳多樣性研究提供參考。發(fā)生變異的3 個堿基位點(diǎn)可能是在一定的條件下該種酵母產(chǎn)生的特異突變，推測其可能是這10 個分離株的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，而作為分子分型的遺傳標(biāo)記。形成獨(dú)立分支的10 株分離菌出現(xiàn)以上堿基的變異，可能是由于在四川紅原、若爾蓋、康定等高原地區(qū)的高海拔環(huán)境條件下經(jīng)過漫長的選擇進(jìn)化造成的，也可能是在牦牛酸奶低溫發(fā)酵條件下長期的選擇進(jìn)化引起的。發(fā)生3 個堿基位點(diǎn)變異有可能引起10 株馬克斯克魯維酵母分離菌表型特性的變異，例如發(fā)酵特性、耐熱、耐酸等特性的變化。如果該10 個分離株發(fā)生表型變異而具有特殊的表型特征，那這3 個SNP位點(diǎn)則可能作為具有該特殊表型的馬克斯克魯維酵的遺傳標(biāo)記，用于該類馬克斯克魯維酵的篩選和鑒定。以上的推測還需要進(jìn)一步實(shí)驗用更多的分離菌株進(jìn)行驗證，但該結(jié)果為馬克斯克魯維酵母的遺傳多樣性研究、分子分型研究以及遺傳標(biāo)記研究提供一定的參考。

從川西北地區(qū)的紅原、若爾蓋、康定等地的10 份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品中分離鑒定出16 株馬克斯克魯維酵母。序列分析顯示16 株馬克斯克魯維酵母分離株形成兩種不同的序列類型，系統(tǒng)進(jìn)化分析分離株也形成兩個獨(dú)立進(jìn)化分支。本實(shí)驗為川西北高原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中蘊(yùn)含的大量原始微生物菌種資源的保護(hù)及研究提供菌株，為該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中微生物組成研究以及馬克斯克魯維酵母的遺傳多樣性研究提供參考。

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Isolation, Identification and Phylogenetic Analysis of Kluyveromyces marxianus Strains from Traditional Fermented Yak Yoghurt

WANG yuan-wei1, ZHANG Cheng-min1, SUO Hua-yi2, yUE Hua1, LI Jian1, TANG Cheng1,*
(1. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Based on the conventional morphological and 26S rRNA gene sequencing analysis, 16 stains of Kluyveromyces marxianus were isolated and identified from 10 samples of traditional fermented yak yogurt in the northwest of Sichuan province. The 16 isolates had 99.3%-100% nucleotide sequence homology with that of K. marxianus available in GenBank. Two quite different sequence types were observed in 16 isolates; one had 10 isolates, the other contained 6 isolates. Compared with the 6 isolates, the 10 isolates had a base deletion at position 537, a point mutation G-A at position 554, and a point mutation A-T at position 564 in the amplified fragments. In the phylogenetic tree, two different sequence types of K. marxianus isolates fell into two distinct groups. Therefore, these results can provide useful information for understanding the microbial composition of traditional fermented yak yogurt and genetic diversity of K. marxianus.

traditional fermented yak yoghurt; Kluyveromyces marxianus; isolation and identification; phylogenetic analysis

TS201.3；TS252.54

A

1002-6630（2014）15-0216-05

10.7506/spkx1002-6630-201415044

2013-08-22

王遠(yuǎn)微（1982—），男，助教，碩士，研究方向為分子生物學(xué)。E-mail：18782269822@139.com

*通信作者：湯承（1965—），男，教授，博士，研究方向為分子生物學(xué)。E-mail：tangcheng101@163.com