孫 芳，王紅揚(yáng)，王 潔，李 星，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

鴨心蘋果酸脫氫酶功能基團(tuán)的研究

孫 芳，王紅揚(yáng)，王 潔，李 星，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

分別用對(duì)氯汞苯甲酸、苯甲基磺酰氟、N-溴代琥珀酰亞胺、琥珀酸酐、乙酰丙酮、溴代乙酸、N-乙酰咪唑、二巰基蘇糖醇、氯胺-T等化學(xué)修飾劑對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶進(jìn)行修飾。結(jié)果表明：半胱氨酸巰基、色氨酸側(cè)鏈吲哚基和絲氨酸羥基是鴨心細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶和線粒體蘋果酸脫氫酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán)；而甲硫氨酸的硫醚基、組氨酸的咪唑基、精氨酸胍基、二硫鍵、酪氨酸的酚羥基、賴氨酸的ε-氨基與鴨心蘋果酸脫氫酶活性不直接相關(guān)，不是酶活性中心的必需基團(tuán)。

鴨心；蘋果酸脫氫酶；功能基團(tuán)；化學(xué)修飾

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH，EC 1.1.1.37）是生物體進(jìn)行糖代謝的關(guān)鍵酶之一，主要催化草酰乙酸和蘋果酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，因組織差異、輔助因子、生理功能等的不同而具有多種同工酶形式[1-2]。目前，MDH廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品及發(fā)酵工業(yè)等領(lǐng)域[3]，已對(duì)多種來源的MDH進(jìn)行了研究[4]，如牛心[5]、玉米[6]、葡萄[7]等，但未見鴨心MDH的詳細(xì)研究報(bào)道。

鴨心MDH屬于萘乙酰胺-依賴型MDH，在鴨心內(nèi)以兩種同工酶的形式存在，即細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶（c-MDH）和線粒體蘋果酸脫氫酶（m-MDH），由于帶電氨基酸殘基數(shù)量的不同，導(dǎo)致兩者等電點(diǎn)不同，便于分離和研究。鴨心MDH在鴨的生長代謝中占有重要作用，是三羧酸循環(huán)及細(xì)胞質(zhì)代謝的重要酶類。酶的側(cè)鏈基團(tuán)可構(gòu)成酶蛋白的各種次級(jí)鍵，在維持酶的空間結(jié)構(gòu)與酶活性中占有重要地位。當(dāng)采用化學(xué)方法修飾這些側(cè)鏈基團(tuán)時(shí)，會(huì)破壞酶的次級(jí)鍵，從而引起酶蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。因此，通過測定修飾后的酶活性是否發(fā)生變化，就可判斷該側(cè)鏈基團(tuán)是否是酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán)[8-9]。

由于家禽體內(nèi)的MDH從未得到研究，本實(shí)驗(yàn)選取鴨心MDH為研究對(duì)象，以分離純化得到的鴨心c-MDH和m-MDH為實(shí)驗(yàn)材料，通過化學(xué)修飾法對(duì)其功能基團(tuán)進(jìn)行研究，旨在確定兩同工酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán)，為深入研究家禽類動(dòng)物體MDH的結(jié)構(gòu)及功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的電泳純鴨心c-MDH和m-MDH純品為實(shí)驗(yàn)材料[10]。

對(duì)氯汞苯甲酸（p-chloromercuribenzoate，PCMB）美國Sigma公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF） 美國Merck公司；N-溴代琥珀酰亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）、琥珀酸酐（succinic anhydride，SUAN）、乙酰丙酮（acetylacetone，AA）、溴代乙酸（bromoacetic acid，BrAc）、N-乙酰咪唑（N-acetylimidazole，NAI）、二巰基蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、氯胺-T（chloramine-t）以及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

分別將化學(xué)修飾劑PCMB、氯胺-T、BrAc、AA、DTT、NAI、SUAN用100 mmol/L pH 7.5的PBS緩沖液稀釋成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L一系列濃度梯度；將NBS用100 mmol/L pH 7.5的PBS緩沖液稀釋成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L一系列濃度梯度；將PMSF用100 mmol/L pH 7.5的PBS緩沖液稀釋成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mmol/L一系列濃度梯度后，分別加入鴨心c-MDH和m-MDH，在25 ℃條件下作用30 min后，測定與化學(xué)修飾劑作用后的酶活力。

酶活力測定具體方法是：MDH在催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸的同時(shí)，將NADH氧化為NAD，使得NADH在340 nm波長處吸光度不斷降低，連續(xù)測定酶反應(yīng)過程中340 nm波長處吸光度的變化即可測出酶活。酶活力單位定義：25 ℃時(shí)，1 min氧化1 μmol的NADH所需的酶量為1個(gè)酶活力單位[10]。同時(shí)以不加修飾劑，而加入等量100 mmol/L pH 7.5的PBS緩沖液的酶液所測得的酶活力為100%，計(jì)算各種修飾條件下的相對(duì)酶活力，分析不同濃度的修飾劑對(duì)兩種同工酶活性的影響，以研究兩種同工酶的功能基團(tuán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCMB對(duì)半胱氨酸巰基的化學(xué)修飾

圖1 PCMB對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.1 Effect of PCMB on the activity of MDH from duck heart

在酸性條件下，對(duì)PCMB能專一作用于半胱氨酸殘基中巰基側(cè)鏈基團(tuán)，因此成為蛋白質(zhì)分子中巰基的常用修飾劑[11]。PCMB對(duì)鴨心c-MDH和m-MDH的酶活力有很強(qiáng)的抑制作用（圖1），當(dāng)PCMB濃度小于2.0 mmol/L時(shí)，酶活力迅速下降，當(dāng)PCMB濃度達(dá)到2.0 mmol/L時(shí)，酶活力就幾乎降為零。說明半胱氨酸中的巰基是兩種同工酶發(fā)揮酶活力的必需基團(tuán)。

2.2 NBS對(duì)色氨酸殘基的修飾

在酸性條件下，NBS可以選擇性地將色氨酸吲哚基團(tuán)氧化。隨著修飾劑NBS濃度的增大，對(duì)鴨心c-MDH和m-MDH抑制作用就增強(qiáng)；當(dāng)濃度達(dá)到5.0 mmol/L時(shí)，剩余酶活力還不到30%，并且還有下降的趨勢（圖2）。因此可以說明NBS對(duì)鴨心MDH具有較強(qiáng)的抑制作用，色氨酸殘基能夠影響兩種同工酶的活性，是兩者發(fā)揮活性的必需基團(tuán)。

圖2 NBS對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.2 Effect of NBS on the activity of MDH from duck heart

2.3 PMSF對(duì)絲氨酸殘基的化學(xué)修飾

在偏堿性條件下，PMSF可特異性的修飾蛋白質(zhì)分子中的絲氨酸羥基[12]。本實(shí)驗(yàn)將鴨心c-MDH和m-MDH與不同濃度的化學(xué)修飾劑PMSF作用，結(jié)果如圖3所示。隨著PMSF濃度的增大，鴨心MDH的活性逐漸受到抑制，說明PMSF對(duì)酶的活性有影響，絲氨酸殘基是鴨心MDH發(fā)揮活性的必需基團(tuán)。

圖3 PMSF對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.3 Effect of PMSF on the activity of MDH from duck heart

2.4 氯胺-T對(duì)甲硫氨酸殘基的化學(xué)修飾

氯胺-T能在堿性條件下特異性地修飾甲硫氨酸的硫醚基[13]。在堿性條件下，用不同濃度的氯胺-T修飾鴨心c-MDH和m-MDH，結(jié)果如圖4所示。在一定濃度下，氯胺-T對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶的酶活性幾乎沒有影響，當(dāng)氯胺-T的濃度達(dá)到4.0 mmol/L時(shí)，酶活力還高達(dá)90%以上，說明甲硫氨酸的硫醚基不是鴨心MDH發(fā)揮活性的必需基團(tuán)，沒有參與兩種同工酶活性中心的構(gòu)成。

圖4 氯胺-T對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.4 Effect of chloramine-T on the activity of MDH from duck heart

2.5 BrAc對(duì)組氨酸殘基的化學(xué)修飾

BrAc在偏酸性條件下可以專一地與蛋白質(zhì)分子中的組氨酸咪唑基發(fā)生反應(yīng)，生成羧甲基衍生物[14]。將鴨心c-MDH和m-MDH與不同濃度的修飾劑BrAc作用后，測定酶活力，結(jié)果如圖5所示。隨著修飾劑濃度的增大酶活力變化微小，說明組氨酸的咪唑基不是鴨心蘋果酸脫氫酶發(fā)揮酶活性的必需基團(tuán)，組氨酸的咪唑基修飾后對(duì)鴨心MDH的活性影響不大。

圖5 BrAc對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.5 Effect of BrAc on the activity of MDH from duck heart

2.6 AA對(duì)精氨酸胍基的化學(xué)修飾

在偏堿性條件下，AA能夠?qū)Ｒ恍缘匦揎椌彼釟埢械碾一?，改變?cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)[15]。將鴨心c-MDH和m-MDH與不同濃度的AA作用，結(jié)果如圖6所示。隨著修飾劑AA濃度的增加，酶活力變化很平緩。說明AA對(duì)鴨心MDH的酶活力基本沒有影響，精氨酸殘基不是酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán)。

圖6 AA對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.6 Effect of AA on the activity of MDH from duck heart

2.7 DTT對(duì)二硫鍵的化學(xué)修飾

DTT是一種巰基化合物，通過還原作用，它能特異性地作用于蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，并將其打開，生成半胱氨酸及相應(yīng)的二硫化合物[16]。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的DTT對(duì)鴨心c-MDH和m-MDH進(jìn)行化學(xué)修飾，結(jié)果如圖7所示。隨著修飾劑DTT濃度的增大，鴨心蘋果酸脫氫酶的酶活力變化不大，當(dāng)DTT濃度為4.0 mmol/L時(shí)，仍保留高達(dá)85%以上的酶活力，說明二硫鍵不是酶發(fā)揮活性作用必需的功能基團(tuán)。

圖7 DTT對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.7 Effect of DTT on the activity of MDH from duck heart

2.8 NAI對(duì)酪氨酸酚羥基的化學(xué)修飾

NAI在一定的條件下可以修飾酪氨酸酚羥基[17]，結(jié)果如圖8所示。隨著修飾劑NAI濃度的增大，鴨心c-MDH和m-MDH的酶活力有下降的趨勢，但變化不大，在NAI的濃度為4.0 mmol/L時(shí)，酶的活性仍保留80%以上，說明酪氨酸的酚羥基不是鴨心MDH發(fā)揮酶活力的必需基團(tuán)。

圖8 NAI對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.8 Effect of NAI on the activity of MDH from duck heart

2.9 SUAN對(duì)賴氨酸殘基的化學(xué)修飾

圖9 SUAN對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶活性的影響Fig.9 Effect of SUAN on the activity of MDH from duck heart

SUAN是常用的氨基修飾劑，能夠修飾賴氨酸殘基上的ε-氨基，與其共價(jià)結(jié)合或發(fā)生脫氨基作用，從而將氨基屏蔽起來[18]。用不同濃度的SUAN對(duì)鴨心c-MDH和m-MDH進(jìn)行化學(xué)修飾，結(jié)果如圖9所示。隨著SUAN濃度的增加，酶活力變化不明顯，說明賴氨酸殘基不是酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán)。

3 討 論

酶活力的展現(xiàn)需要有完整的酶分子構(gòu)象，酶活力的喪失往往先于其整體構(gòu)象的改變。探討酶活性中心的功能基團(tuán)，對(duì)研究酶的結(jié)構(gòu)、功能及酶的催化機(jī)理與固定化等具有重要的意義[19]。

酶的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成酶蛋白氨基酸殘基上的各個(gè)功能基團(tuán)，主要含有巰基、胍基、氨基、羧基、咪唑基、硫醚基、吲哚基、酚羥基、二硫鍵等。酶的化學(xué)修飾法是研究酶的活性中心功能基團(tuán)、改進(jìn)酶的理化性質(zhì)、提高酶催化性能的重要途徑。因此，可以采用化學(xué)修飾法來改變酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)，利用各種化學(xué)修飾劑對(duì)酶的特定氨基酸殘基進(jìn)行修飾，進(jìn)而影響酶的空間結(jié)構(gòu)與活性中心，以便于研究酶活性中心功能基團(tuán)的性質(zhì)。如果酶的某一基團(tuán)被修飾后，活力變化明顯，就說明該基團(tuán)位于酶的活性中心，是酶活性中心的必需基團(tuán)。反之，如果酶的活性沒有發(fā)生明顯的變化，就表明該基團(tuán)與酶的活性中心不直接相關(guān)，不是酶活性中心的必需基團(tuán)[20]。

本實(shí)驗(yàn)中選用PMSF、PCMB、NAI、SUAN、DTT、BrAc、BD、NBS等化學(xué)修飾劑對(duì)鴨心蘋果酸脫氫酶兩同工酶的氨基酸殘基進(jìn)行選擇性修飾，修飾過程中，讓修飾劑與酶分子充分作用，結(jié)果表明：有的化學(xué)修飾劑能強(qiáng)烈地抑制酶的活性，有的修飾劑卻對(duì)酶活力沒有明顯影響。這些修飾劑大體上對(duì)兩同工酶的作用相同，說明c-MDH和m-MDH在酶的結(jié)合位點(diǎn)上雖然存在著一定的差別，但是它們的活性位點(diǎn)卻高度保守，在活性中心功能基團(tuán)上具有相似性，并且具有通用的催化機(jī)制。

根據(jù)化學(xué)修飾結(jié)果可以判定：半胱氨酸巰基、色氨酸側(cè)鏈吲哚基、絲氨酸羥基是鴨心c-MDH和m-MDH發(fā)揮活性的必需基團(tuán)，參與了酶活性中心的構(gòu)成；而甲硫氨酸的硫醚基、組氨酸的咪唑基、精氨酸胍基、二硫鍵、酪氨酸的酚羥基、賴氨酸的ε-氨基與鴨心c-MDH和m-MDH發(fā)揮活性不直接相關(guān)，不是酶活性中心的必需基團(tuán)。本結(jié)果為鴨心蘋果酸脫氫酶兩同工酶空間結(jié)構(gòu)及固定化的研究提供參考。

近年來，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系多采用蛋白質(zhì)工程替換氨基酸的方法，在應(yīng)用定位突變替換氨基酸之前，通過化學(xué)修飾法確定必需氨基酸殘基的數(shù)目和性質(zhì)具有很大的必要性[21]，因此，研究酶蛋白功能基團(tuán)具有重要意義。

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Functional Groups of Malate Dehydrogenase from Duck Heart

SUN Fang, WANG Hong-yang, WANG Jie, LI Xing, TANG Yun-ming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The chemical modification of malate dehydrogenase (MDH) with p-chloromercuribenzoate, phenylmethyl sulfonyl fluoride, N-bromosuccinimide, succinic anhydride, acetylacetone, bromoacetic acid, N-acetylimidazole, dithiothreitol and chloramine-T showed that the cysteine sulfydryl, tryptophan side chain indole and serine hydroxyl groups involved in the composition of the enzyme active center could be considered as the essential functional groups of c-MDH and m-MDH from duck heart. However, the thioether group of methionine, the imidazole group of histidine, the guanidine group of arginine, disulfide bond, the phenol hydroxyl group of tyrosine and the epsilon-amino group of lysine were not directly related to the activity of the two MDH enzymes from duck heart, suggesting that they are not essential for the enzyme active center.

duck heart; malate dehydrogenase (MDH); functional groups; chemical modification

Q814.1

A

1002-6630（2014）15-0212-04

10.7506/spkx1002-6630-201415043

2013-07-27

重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（2011AB1027）

孫芳（1988—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：scncsfang@163.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn