王 陶，李 文，陳宏偉，李同祥*，趙天蘭

（徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221008）

氮離子注入蛹蟲草選育高效富硒菌株的研究

王 陶，李 文，陳宏偉，李同祥*，趙天蘭

（徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221008）

為了更好地開發(fā)蛹蟲草資源，對蛹蟲草菌株富集微量元素硒的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇最佳參數(shù)的低能離子束注入蛹蟲草，通過石墨爐原子吸收光譜法檢測注入前后菌絲體中硒元素的含量。結(jié)果表明：蛹蟲草發(fā)酵富硒的最優(yōu)培養(yǎng)條件為蛋白胨質(zhì)量濃度3 g/100 mL、葡萄糖質(zhì)量濃度3 g/100 mL、亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為8 μg/mL、pH值為7，此時，富硒率為21.58%。離子束最佳注入?yún)?shù)為：注入離子為N+，注入能量10 keV，注入劑量1.82×1015ions/cm2，選育出富集微量元素硒較高的10 株菌株，最高富硒率為30.97%，比出發(fā)菌株提高了近42%。

蛹蟲草；硒；低能離子束；富集；注入

硒是人體必需的微量元素，它通過谷胱甘肽過氧化物酶、輔酶Q與VE維持自由基的正常代謝來維持人體正常生理機能[1-3]，具有增強免疫能力，防止糖尿病，防止克山病、大骨節(jié)病、關(guān)節(jié)炎，防治肝病、保護(hù)肝臟，解毒排毒等功能[4-5]。中國營養(yǎng)學(xué)會制定硒的日供應(yīng)量1 歲以內(nèi)為15 μg，1～3 歲為20 μg，4～6 歲為40 μg，5 歲至成年人為50 μg。然而我國成人硒的攝入量僅為26.6 μg，屬于低硒水平[6]。有機硒的補劑由于在毒理安全性、生理活性及吸收率的優(yōu)越性，已經(jīng)成為廣泛關(guān)注的熱點[7-10]。開發(fā)生物源有機硒食品或食品添加劑是給機體提供硒源的有效途徑。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北蟲草、蛹草、北冬蟲夏草，屬子囊菌亞門、核菌綱、球殼菌目、麥角菌科、蟲草屬，含有蟲草多糖、蟲草素等核苷類化合物、多種氨基酸、糖醇和甾醇、多種維生素等，其藥理作用與冬蟲夏草相似，能顯著地提高機體的免疫力，有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、抗放療，以及延緩衰老的功效[11-14]。蛹蟲草對微量元素具有明顯的富集作用，并能夠?qū)o機態(tài)轉(zhuǎn)化為有機態(tài)，使其吸收利用率大大提高，并能降低其毒性。

低能離子束生物學(xué)效應(yīng)自1995年由余增亮研究員發(fā)現(xiàn)以來[15]，已廣泛運用于多種農(nóng)作物、工業(yè)微生物的誘變育種中[16]。在VC、L-乳酸、檸檬酸生產(chǎn)菌等方面也有重要的研究結(jié)果[17-19]。但未見利用低能離子束作用蛹蟲草菌株進(jìn)行微量元素硒富集的報道，因此本實驗擬通過低能離子注入修飾蛹蟲草菌株，優(yōu)化最佳注入?yún)?shù)，并在微量元素硒最佳發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件下，大量篩選突變體菌株，以期找到微量元素硒富集率高的菌株，從而提高蛹蟲草的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草（Cordyceps militaris）13號菌株：徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院實驗室保存，通過反復(fù)優(yōu)化培養(yǎng)，其生物量是實驗室現(xiàn)有菌株中最多的。

亞硒酸鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

離子注入機 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院；TSA-990原子吸收儀、TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HYG搖瓶柜 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：SDAY培養(yǎng)基（葡萄糖4 g/100 mL、蛋白胨1 g/100 mL、酵母浸膏1 g/100 mL、瓊脂2 g/100 mL）；種子培養(yǎng)基：SDY培養(yǎng)基（去掉瓊脂的SDAY培養(yǎng)基）；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨3 g/100 mL、酵母浸膏3 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL、KH2PO40.1 g/100 mL、無水氯化鈣0.01 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL、Na2SeO310 μg/mL；篩選培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 150 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、硫酸鋅1 g、瓊脂30 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1 g、蒸餾水1 000 mL。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 斜面培養(yǎng)

將接種后的斜面于22 ℃培養(yǎng)7 d。

1.4.2 種子培養(yǎng)

于22 ℃、122 r/min，培養(yǎng)3 d。裝液量：250 mL三角瓶裝入50 mL液體培養(yǎng)基。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

于接種量5%、22 ℃、122 r/min振蕩培養(yǎng)5～7 d。

1.5 微量元素硒富集方法

在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過L9（34）正交試驗考察碳源質(zhì)量濃度、氮源質(zhì)量濃度、pH值和亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對蛹蟲草微量元素硒富集的相互影響，并確定蛹蟲草菌絲體富集微量元素硒的最佳工藝參數(shù)。

1.6 誘變方法

1.6.1 樣品的前期準(zhǔn)備

在含玻璃珠的三角瓶內(nèi)放置50 mL生理鹽水，再裝入由培養(yǎng)7 d的斜面上刮取的孢子塊，搖勻、打散，后經(jīng)雙層滅菌紗布過濾3 次，再在振蕩器上振蕩混勻，即成單孢懸液。

把孢子懸液，按照10-1稀釋后取0.1 mL孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，于超凈工作臺風(fēng)干后進(jìn)行離子注入。

1.6.2 離子注入條件

注入靶室的真空度為10-3Pa，束流量為1 mA。注入能量：5、10、15、20、25、30 keV，注入劑量：（10、30、50、70、90、110、130、160、190）×2.6×1013ions/cm2。注入離子種類：N+。

1.6.3 突變菌株的篩選

經(jīng)離子注入處理后的樣品用1 mL磷酸緩沖液洗脫下來，10 倍稀釋法稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基上分離，于恒溫培養(yǎng)箱22 ℃培養(yǎng)7 d。挑取長勢較好的單菌落中心附近直徑0.5 cm同等大小菌絲體接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，種子液中培養(yǎng)5 d，再接種于正交優(yōu)化后的最佳硒富集發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。測定微量元素硒的含量，篩選富硒蛹蟲草菌株。

1.7 分析檢測方法

1.7.1 生物量的測定

通過低溫離心分離收集菌體，將菌體冷凍干燥至恒質(zhì)量，稱量得生物量。

1.7.2 無機硒的去除

通過低溫離心分離收集菌體，將菌體冷凍干燥至恒質(zhì)量，稱量得生物量。稱取1 g樣品，放在煮開的透析袋中，進(jìn)行流水透析，時間為36 h，去除菌絲體表面的無機硒（無機硒通過流水透析已去除，以下用石墨爐原子吸收光譜法檢測到的都是有機硒）。

1.7.3 微波消解

將透析好的樣品于消解罐中，移取7 mL濃硝酸滴入其中溶解，放入微波消解儀中消解。消解完后用超純水將所得的消解液定容至50 mL。

1.7.4 石墨爐原子吸收法測定硒含量

將定容好的樣品吸取10 μL加入石墨爐中，利用石墨爐原子吸收法進(jìn)行硒含量的測定。設(shè)定的工作參數(shù)為：波長213.9 nm，灰化溫度500 ℃，原子化溫度1 900 ℃，消化溫度2 000 ℃。

1.7.5 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用移液管分別移取0.1 mg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行稀釋，配制硒質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、600 ng/mL。以硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=0.000 9x+0.004 4（R2=0.999 2）。

1.7.6 富集率的計算

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對蛹蟲草富集硒元素能力的影響

2.1.1 碳源對硒富集的影響

表1 碳源種類對菌絲體生物量和富硒率的影響Table 1 Effects of different carbon sources on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

碳源分別為3 g/100 mL的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糊精、淀粉對蛹蟲草生物量和硒富集率的影響見表1。葡萄糖為碳源時，生物量最高為2.178 g/100 mL，可能由于葡萄糖是單糖，蛹蟲草對單糖提供的碳源更易吸收，而蔗糖，乳糖和麥芽糖是二糖，糊精和淀粉是多糖，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入二糖或多糖時影響菌體的生長，生物量不高。當(dāng)葡萄糖作為碳源時，蛹蟲草菌絲體富硒率最高為19.60%。由此說明碳源種類為葡萄糖時，蛹蟲草生長較好，同時富硒能力強，因此，葡萄糖為最適碳源。

2.1.2 氮源對硒富集的影響

表2 氮源種類對蛹蟲草生物量和硒富集率的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

氮源分別為3 g/100 mL的尿素、蛋白胨、大豆粉、玉米粉、硝酸鉀、硫酸銨對蛹蟲草生物量和硒富集率的影響見表2。尿素、蛋白胨、大豆粉、玉米粉是有機氮源，硝酸鉀和硫酸銨屬于無機氮源。由表可知，培養(yǎng)基有機氮源的比無機氮源的生物量高很多，其中蛋白胨的生物量為最大，為3.134 g/100 mL。加入氮源為蛋白胨時，蛹蟲草菌絲體富硒率最大為16.85%。由此說明氮源種類為蛋白胨時，蛹蟲草富硒能力強，則蛋白胨為最優(yōu)氮源種類。

2.1.3 pH值對硒富集的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，不同pH值對蛹蟲草菌絲體的生物量和富硒率的影響可見表3。隨著pH值的增長，生物量先增加后降低，在pH 6.5時，生物量達(dá)到最大，蟲草菌絲體的富硒能力最大，其富硒率為18.64%。這樣的pH值使蛹蟲草更易生長，使蛹蟲草的富集能力增強。過酸過堿的環(huán)境都抑制蛹蟲草的生長。

表3 不同pH值對菌絲體生物量和富硒率的影響Table 3 Effect of different medium pH values on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

2.1.4 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對硒富集的影響

表4 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對菌絲體生物量和富硒量的影響Table 4 Effect of different Na2SeO3concentrations on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

在基本培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉，對蛹蟲草的生物量和富硒率的影響見表4。亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10 μg/mL時，生物量達(dá)到最大為3.106 g/100 mL。加入的亞硒酸鈉質(zhì)量濃 度為10 μg/mL時，蟲草菌絲體的富硒能力最大，達(dá)到19.87%。在基本培養(yǎng)基中加入的亞硒酸鈉質(zhì)量濃度過低，蛹蟲草富硒未達(dá)到飽和，而加入的亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度過高，抑制了蛹蟲草的生長，富集能力也有所降低。

2.1.5 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

結(jié)合前面的單因素試驗，選擇碳源質(zhì)量濃度、氮源質(zhì)量濃度、pH值以及亞硒酸鈉的加入量為影響因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗，因素水平表及正交試驗結(jié)果如表5所示。各因素對微量元素硒富集的影響次序為B＞A＞D＞C，即蛋白胨添加量＞葡萄糖添加量＞亞硒酸鈉添加量＞pH值，其最優(yōu)方案為B2A2D1C3。最佳富集硒元素的培養(yǎng)條件為蛋白胨添加量3 g/100 mL、葡萄糖添加量3 g/100 mL、亞硒酸鈉添加量為8 μg/mL、pH值為7。最優(yōu)條件下，硒的富集率達(dá)21.58%。最優(yōu)方案為B2A2D1C3在試驗組合中，不需做驗證實驗。

表5 正交試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal array design

2.2 低能離子注入最佳參數(shù)的確定

2.2.1 離子種類的選擇

離子的種類很多，不同離子注入對菌種的損傷效應(yīng)也各不相同，表現(xiàn)出來的敏感程度也不同。但就H+、N+和Ar+這3 種常用的注入離子來說，N+的誘變率最高[20]，因為N+是組成DNA堿基的重要元素之一，N+注入不僅可以直接引起DNA堿基分子結(jié)構(gòu)的變化，還可以參與細(xì)胞的重組和修復(fù)，產(chǎn)生較多突變，所以通常用于微生物和植物的誘變育種。因此，本實驗選擇N+作為注入離子。

2.2.2 注入能量的選擇

選擇注入劑量為1.3×1015ions/cm2，劑量率為2.6×1013ions/cm2，研究不同能量N+與菌株存活率之間的關(guān)系，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同能量N+對菌株存活率的影響Fig.1 Effect of N+energy on survival rate

由圖1可知，注入離子能量較低情況下，菌株的存活率呈緩慢下降的趨勢，當(dāng)注入能量增加到5 keV以上后其存活率急劇下降，當(dāng)注入能量繼續(xù)增加到10 keV以上時，其存活率下降速度又明顯減緩。為了確保在誘變選育時既有一定的存活率又有較多的正突變，本實驗選擇10 keV能量對蛹蟲草菌種進(jìn)行離子注入處理。

2.2.3 注入劑量的確定

在10 keV能量下，不同N+注入劑量對蛹蟲草菌種的存活率的影響見圖2，其存活曲線呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，屬于“馬鞍型”變化。這種特有的“馬鞍型”曲線被認(rèn)為是能量、動量作用下的損傷效應(yīng)和質(zhì)量、電荷作用下的保護(hù)和綜合刺激作用的結(jié)果[21]。當(dāng)注入劑量在0～2.6×1014ions/cm2時，存活率急劇下降，隨著劑量的增加，存活率又緩慢上升，當(dāng)劑量增加到70×2.6×1013ions/cm2時，存活率又開始緩慢下降。

因此，本實驗選擇離子最佳注入?yún)?shù)為：N+，能量10 keV，劑量70×2.6×1013ions/cm2峰值間的劑量，即60×2.6×1013～80×2.6×1013ions/cm2，這樣既保證一定的存活率，又有一定的正突變率。

圖2 N 2 N+注入菌株的存活率曲線Fig.2 Survival curve of the original strain after N+beam implantation

2.3 低能離子注入后篩選得到部分突變子照片

在最佳注入?yún)?shù)下，進(jìn)行了大批量的N+注入實驗，在PDA篩選培養(yǎng)基上得到了大量的單菌落，見圖3，并對長勢較好、菌落大的單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，進(jìn)而在前面優(yōu)化的蛹蟲草富硒發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)。

圖3 離子束注入后得到的單菌落Fig.3 Colonies after N+beam implantation

2.4 富硒蛹蟲草菌種的篩選

按照優(yōu)化后的富硒蛹蟲草發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件，對近160 個低能離子束修飾后的單菌落進(jìn)行微量元素硒的富集培養(yǎng)，利用石墨碳原子吸收法測定菌絲體中硒的含量。富硒率較高的10 株菌株見表6。離子注入前后蛹蟲草菌株的生物量有了比較大的變化，注入后生物量比對照提高最多達(dá)50%?？梢姷湍茈x子束的誘變效應(yīng)首先體現(xiàn)在對菌體生長上。通過最佳注入?yún)?shù)的低能N+修飾蛹蟲草菌株后，在最佳富集培養(yǎng)條件下，篩選得到了菌絲體中硒含量較高的菌株，最高達(dá)（309.684±0.010）μg/g干質(zhì)量，同時富集率達(dá)30.97%，比對照高了近42%。這可能是由于低能N+的質(zhì)量沉積、能量交換和電荷轉(zhuǎn)移三因子效應(yīng)的綜合作用的結(jié)果[21]，使得蛹蟲草中菌絲體細(xì)胞的通透性增加，從而有利于微量元素的富集。對高效富硒的菌株在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行了6 次傳代培養(yǎng)，每次檢測得到的硒含量均在300.000 μg/g干質(zhì)量左右，富硒率在30%與對照相比，增幅均在40%左右（表7），這些菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，可以進(jìn)行下一步的研究。

表6 離子束注入前后菌絲體生物量及富硒率Table 6 Biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia before and after ion beam implantation

表7 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性Table 7 Genetic stability of the mutant strain No. 3

3 結(jié) 論

采用能量為10 keV，不同劑量的N+注入蛹蟲草菌株的存活率呈比較典型的馬鞍型曲線，最佳注入劑量為1.82×1015ions/cm2，這樣既保證一定的存活率，又有一定正突變率。優(yōu)化蛹蟲草菌株富集微量元素硒的發(fā)酵條件：蛋白胨質(zhì)量濃度3 g/100 mL、葡萄糖質(zhì)量濃度3 g/100 mL、亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為8 μg/mL、pH值為7。在最佳注入?yún)?shù)下，經(jīng)過大量的N+注入發(fā)現(xiàn)：低能離子束對生物體的誘變效應(yīng)首先表現(xiàn)在對菌體生長上，生物量比對照提高。篩選得到了菌絲體中硒含量較高的菌株，最高達(dá)（309.684 ± 0.010）μg/g干質(zhì)量，同時富硒率達(dá)30.97%，比對照高了近42%。這些菌株生長性能較好，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，為綜合開發(fā)利用蛹蟲草資源奠定了一定的基礎(chǔ)。當(dāng)然，低能離子注入微生物體內(nèi)作用機理十分復(fù)雜，是質(zhì)量沉積、電荷轉(zhuǎn)移和能量交換三因子于一體的綜合過程。蟲草具有多種生物學(xué)功能，富硒能增強其功效，對于低能離子注入得到高效富硒蛹蟲草菌株僅僅做了初步的探索，關(guān)于低能離子束注入蛹蟲草菌株后的誘變效應(yīng)機理、富硒蛹蟲草中硒的存在形式以及蟲草素、蟲草多糖等生物活性成分還有待于進(jìn)一步的研究。

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Breeding of Cordyceps militaris Strain with High Selenium Enrichment by Low-Energy Ion Beam Implantation

WANG Tao, LI Wen, CHEN Hong-wei, LI Tong-xiang*, ZHAO Tian-lan
(Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

In the present study, investigations were carried out to optimize the medium components for enhanced enrichment of the dietary microelement selenium (Se) in Cordyceps militaris mycelia. The Cordyceps militaris strain No.13 preserved in our laboratory was improved by low-energy nitrogen ion beam implantation under optimal operating conditions to increase Se enrichment in the mycelia. The Se contents in the original and mutant strains were determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS). Results showed that the optimal medium components for Se enrichment in Cordyceps militaris mycelia were determined as follows: peptone 3 g/100 mL, glucose 3 g/100 mL and Na2SeO38 μg/mL at pH 7.0, resulting in a selenium enrichment rate of 21.58%. The optimal parameters for lowenergy nitrogen ion beam implantation were achieved at an energy of 10 keV and a dose of 1.82×1015ions/cm2. Ten mutant strains showing higher Se-enriching capacity were obtained. The highest Se enrichment rate of 30.97% was observed, nearly 42% higher than that of the original strain.

Cordyceps militaris; selenium; low-energy ion beam; enrichment; implantation

Q939.96

A

1002-6630（2014）15-0136-05

10.7506/spkx1002-6630-201415028

2013-06-28

國家自然科學(xué)基金面上項目（81273004；31270577）；江蘇省高校自然科學(xué)基金項目（10KJD180006）

王陶（1976—），男，副教授，博士，研究方向為離子束生物工程學(xué)和資源微生物學(xué)。E-mail：wangtaohf@126.com

*通信作者：李同祥（1966—），男，教授，博士，研究方向為生物工程及相關(guān)技術(shù)。E-mail：litx@xzit.edu.cn