楊 花，楊少奇，何 芳，胡建國，李 鵬1，

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內(nèi)科，銀川750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院NICU，銀川750004）

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常見的惡性腫瘤之一，病死率居世界第2位，嚴重危害人類的健康[1]。近年來研究表明，黑色素瘤抑制蛋白2（MIA2）表達異常與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。發(fā)揮著抑癌基因的作用，MIA2是近年發(fā)現(xiàn)的MIA家族的新成員，MIA家族的其他成員包括MIA、OTOR、TANGO[2-3]。Bosserhoff等[4]對人體和小鼠的研究表明MIA2特異性的表達于肝臟組織中，在睪丸組織中有極少量表達。Hellerbrand等[5]的研究顯示，MIA2是一個能夠抑制肝癌生長和侵襲的抑癌基因，肝癌組織中MIA2表達的缺失與肝癌生長和侵襲有關(guān)，而用MIA2基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞系和肝癌動物模型均顯示出抑制肝癌細胞的增殖和侵襲的作用。本研究擬用分子生物學技術(shù)，構(gòu)建pIRES2-Zs-Green1-MIA2慢病毒表達載體，觀察其下調(diào)肝癌細胞HepG2中MIA2表達的效率和細胞體外生長及遷移的改變，為后續(xù)深入MIA2在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制提供前期實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞2細胞由寧夏醫(yī)科大學凍存、PCR酶、限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；Marker IV、KB Ladder為Yr-bio公司自產(chǎn)。質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均為Yrbio公司；自產(chǎn)引物合成；測序均在上海英俊完成；本實驗所需的質(zhì)粒pDONR223-MIA2購自Yrbio基因庫。目的載體pLVX-IRESZsGreen1購自Clontech，引物合成、測序均在上海英俊完成。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑試劑購自美國Invitrogen公司；PCR儀購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 MIA2真核表達載體的構(gòu)建與鑒定 將質(zhì)粒pDONR223-MIA2用SpeⅠ、BamHⅠ酶切，用SpeⅠ、BamHⅠ將MIA2的PCR片段及目的載體pLVX-IRES-ZsGreen1雙酶切，然后進行連接，取10μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，再切膠回收目的片段，挑取克隆，提質(zhì)粒，進行鑒定，pLVX-IRESZsGreen1-MIA2構(gòu)建成功。將酶切鑒定正確的pLVX-IRESZsGreen1-MIA2送去測序。用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測HepG2細胞中MIA2的表達情況，MTT法檢測細胞增殖的情況。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HepG2細胞用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃飽和濕度、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁達80%～90%時，按3×105／mL的細胞密度接種于6孔板中。細胞轉(zhuǎn)染實驗分組：（1）陰性對照組：轉(zhuǎn)染pLVX-pIRES2-ZsGreen1空白質(zhì)粒；（2）實驗組：轉(zhuǎn)染pLVX-pIRES2-ZsGreen1-MIA2重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。轉(zhuǎn)染48h后，倒置熒光顯微鏡下觀察MIA2的表達量進而估算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 RT-PCR檢測各組細胞中目的基因的mRNA水平收集細胞后，采用Trizol法提取細胞總RNA，每組取1mg總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制20μL PCR反應(yīng)體系：無核酶水5.2μL，上下游引物各0.4μL，tagDNA聚合酶2.5μL，模板DNA 2.5μL，4種DNTP混合物5.0μL。引物設(shè)計以 GAPDH為內(nèi)參GAPDH-F452：上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，長度452bp；MIA2-501-r：上游5′-GGC AAA CTT ACC CTT TCT GT-3：下游5′-GGC AAA CTT ACC CTT TCT GT-3′，長度540bp。調(diào)整好反應(yīng)程序，將上述混合液稍加離心，立即置于PCR儀上，進行擴增。反應(yīng)程序：70℃5min；42℃60 min；70℃15min；共30個循環(huán)。

1.2.4 噻唑藍（MTT）實驗檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞的增殖取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HepG2細胞以每孔1×104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)基體積200μL。待HepG2細胞貼壁24h后，按照Invitrogen公司的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染步驟，將質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1和pIRES2-ZsGreen1-MIA2分別轉(zhuǎn)染 HepG2細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。各組細胞在檢測時間點時，每孔加20μL MTT溶液（5mg／mL），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h；小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸度（A）值。

1.2.5 克隆形成實驗檢測 轉(zhuǎn)染后HepG2細胞的體外增殖分別收集上述轉(zhuǎn)染后各組細胞制備成單細胞懸液，6孔板中每孔接種2mL，保持每孔細胞數(shù)目依次為400和800個；置37℃、5%CO2中培養(yǎng)10d，當出現(xiàn)肉眼可見克隆時，棄去培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，4%多聚甲醛固定30min，置空氣中干燥，用1%結(jié)晶紫染液染色30min，用PBS洗去染液，干燥后拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本資料的t檢驗，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MIA2PCR擴增產(chǎn)物 pDONR223-MIA2為模板，PCR擴增MIA2的CDS區(qū)片段，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并回收MIA2條帶。MIA2PCR擴增，重組質(zhì)粒陽性克隆的PCR鑒定和雙酶切、測序鑒定與Invitroger公司的序列一致。

2.2 慢病毒pLVX-IRES-ZsGreen1-MIA2質(zhì)粒載體構(gòu)建與鑒定 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中挑取克隆，提質(zhì)粒，進行鑒定SpeⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定結(jié)果如下切出一約2.0×103bp的條帶，見圖2。

圖2 慢病毒pLVX-IRES-ZsGreen1-MIA2質(zhì)粒載體構(gòu)建與鑒定

2.3 質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreen1-MIA2測序 將測序報告與欲得到的目的序列相比對，兩者完全一致，pLVX-IRES-Zs-Green1-MIA2構(gòu)建成功。

2.4 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染HepG2細胞MIA2的表達 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞36h后熒光顯微鏡下觀察，重組質(zhì)粒IRES-ZsGreen1-MIA2轉(zhuǎn)染效率為60%～70%，見圖3。

2.5 轉(zhuǎn)染HepG2細胞后MTT檢測結(jié)果 將質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1、pIRES2-ZsGreen1-MIA2分別轉(zhuǎn)染 HepG2細胞（4 μg／瓶）。在轉(zhuǎn)染4、24、48、72h后進行 MTT檢測。MTT 結(jié)果顯示，陰性對照組A值為0.71±0.03，而實驗組為0.48±0.02（P＜0.05）；計測定A值后求平均值，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖3 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染HepG2細胞MIA2的表達（×400）

圖4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞后MTT檢測結(jié)果

3 討 論

HCC是一種常見惡性腫瘤，尋找敏感而特異的腫瘤標志物對其早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和早期治療至關(guān)重要。MIA2是MIA家族的新成員，在人類的14q13.4號染色體的基因位點上[6]，MIA是肝細胞特異性表達的一種可溶性蛋白質(zhì)，其高表達于正常肝組織及肝纖維化組織，而在肝癌組織中低表達或不表達[7]。本研究利用分子生物學技術(shù)構(gòu)建慢病毒表達載體pLVX-IRES-ZsGreen1-MIA2，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染該載體后pLVX-pIRES2-ZsGreen1-MIA2轉(zhuǎn)染HepG2細胞后細胞增殖水平明顯低于陰性對照組，基于慢病毒表達載體的建立可用于探討MIA2在肝癌中的生物學作用，為進一步深入研究MIA2在肝癌中的分子生物學功能提供了重要基礎(chǔ)。

有研究顯示，MIA2在肝癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，如Bosserhoff等[7]研究表明 MIA2特異性的表達于肝臟組織中。Hellerbrand等[5]研究顯示，肝癌組織中 MIA2表達的缺失與肝癌生長和侵襲有關(guān)，而用MIA2基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞系和肝癌動物模型均顯示出抑制肝癌細胞的增殖和侵襲的作用，提示MIA2是一個能夠抑制肝癌生長和侵襲的抑癌基因。本研究組前期研究了MIA2蛋白在HCC中的表達，結(jié)果顯示肝癌組織中 MIA2表達明顯低于癌旁組織[8]，在研究HBV對肝癌細胞中MIA2表達的影響的實驗結(jié)果顯示MIA2蛋白在HBV陽性肝癌細胞中表達減低[9]。同時應(yīng)用甲基化酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷MIA2蛋白表達明顯增強，細胞增殖受到抑制，細胞早期凋亡增加[10]，這些研究均表明，MIA2與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)因此，深入探討特定MIA2分子在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的功能不僅對于闡明肝癌的發(fā)生機制，而且對于今后肝癌的臨床診斷和基因治療新靶標開發(fā)均具有重要意義。

本課題利用慢病毒表達載體pLVX-IRES-ZsGreen1-MIA2轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，通過 MTT實驗、克隆形成實驗、闡明MIA2在體外能夠抑制肝癌細胞HepG2的增殖，然而MIA2在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的確切機制仍不清楚，本研究將IRES-Zs-Green1-MIA2體外轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，MTT實驗和克隆形成實驗顯示肝癌細胞的體外生長受到明顯抑制。進一步提示MIA2在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著抑癌基因的作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建pLVX-IRES-ZsGreen1-MIA2慢病毒表達載體，并發(fā)現(xiàn)MIA2后可抑制人肝癌HepG2細胞的體外生長。這為筆者在后續(xù)研究中深入探討MIA2在肝癌細胞生長中的作用機制，以及基于MIA2的肝癌生物治療靶標開發(fā)提供了前期實驗基礎(chǔ)。

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