李永前(綜述)，王志平(審校)

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所 甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點實驗室甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，蘭州 73000)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在全世界男性惡性腫瘤排行中居第六位[1]。在我國膀胱癌的發(fā)病率一直高居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤首位，且其發(fā)病率還在逐年上升，其中90%～95%為移行上皮細胞癌。目前治療膀胱癌的效果都不令人滿意。研究顯示，表淺性膀胱癌經(jīng)過手術(shù)化療后復(fù)發(fā)率為20%～30%，10%～20%的患者進展為浸潤性膀胱癌[2]。而浸潤性膀胱癌的預(yù)后不佳，其5年生存率僅為50%[3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們通過構(gòu)建選擇復(fù)制性溶瘤腺病毒載體治療膀胱癌讓人們看到了希望，在這項技術(shù)中組織特異性啟動子調(diào)控溶瘤腺病毒治療膀胱癌成為了研究熱點。

1 特異性啟動子調(diào)控溶瘤腺病毒治療膀胱癌的原理

溶瘤腺病毒又稱為條件復(fù)制性腺病毒，是由腺病毒進行基因改造后得。溶瘤腺病毒感染腫瘤細胞后，首先突破腫瘤細胞的防御系統(tǒng)，進入細胞后在細胞內(nèi)大量復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡破碎，使其內(nèi)的病毒釋放出來，繼續(xù)作用于周圍的腫瘤細胞，以此循環(huán)，直到腫瘤細胞被全部裂解，因為溶瘤腺病毒自身缺陷只能在腫瘤細胞內(nèi)選擇性復(fù)制，而不能夠在正常細胞中復(fù)制，因此腫瘤細胞裂解完全后溶瘤腺病毒不能夠再次復(fù)制，隨后被免疫系統(tǒng)清除。由于溶瘤腺病毒具有條件復(fù)制性的特點使其能夠特異性溶解和殺傷瘤細胞，而不損傷正常組織[4]。在這基礎(chǔ)上加上特異性啟動子，溶瘤腺病毒具有更好的靶向性，并且增加了溶瘤腺病毒的溶瘤作用。

1.1腺病毒 腺病毒是直徑為70.90 nm的二十面體的無包膜雙鏈DNA病毒，能通過直徑為400～600 nm的腫瘤血管漏孔到達腫瘤細胞，其因具有嗜上皮細胞性(膀胱癌90%～95%是移行上皮性)、對人低毒性(安全，不良反應(yīng)小)、不整合到宿主染色體(無致癌和致突變的風(fēng)險)、病毒基因組發(fā)生重排較少(病毒基因穩(wěn)定，不會發(fā)生致命性突變)、同時表達多個基因(能夠插入幾個基因使其同時表達，發(fā)揮協(xié)同作用)、容易制備高滴度病毒等優(yōu)點，成為了在基因治療中應(yīng)用最廣泛的載體之一[5]。

1.2溶瘤腺病毒的構(gòu)建策略 目前認為腺病毒復(fù)制的必要條件是其感染的細胞從G1期進入S期。在腺病毒感染細胞后E1A最早被轉(zhuǎn)錄，它編碼的E1A蛋白與E2F-Rb復(fù)合體中的視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白結(jié)合，導(dǎo)致E2F-Rb復(fù)合體分離，E2F釋放后促使細胞由G1進入S期，與此同時細胞的自我防御機制也被激活，p53的降解受到抑制，隨著p53降解減少，p53在細胞內(nèi)積聚，并與p53反應(yīng)子結(jié)合激活細胞周期停滯基因和凋亡誘導(dǎo)基因，從而阻止細胞進入S期和誘導(dǎo)細胞凋亡。但是病毒早期蛋白質(zhì)E1B與細胞內(nèi)p53結(jié)合使之失活，使宿主細胞由G1期進入S期，保證了病毒復(fù)制周期的順利進行[6]。由此可以看出，E1A和E1B是腺病毒在正常細胞中必不可少的條件，而在此基礎(chǔ)上科研工作者通過改變或調(diào)控E1A和(或)E1B基因來構(gòu)建相應(yīng)的溶瘤腺病毒。目前構(gòu)建溶瘤腺病毒的策略主要有3個：①剔除腫瘤細胞復(fù)制不需要但是正常細胞需要的基因，如p53腺病毒[5]；②用腫瘤組織特異性啟動子調(diào)控腺病毒增殖所必須的基團；③改變腺病毒外殼的纖毛蛋白，達到特異感染腫瘤細胞的目的[7]。

1.3治療膀胱癌的溶瘤腺病毒的特異性啟動子 溶瘤腺病毒治療膀胱癌時，病毒攜帶的目的基因不可避免地在膀胱癌外多種組織表達，殺傷膀胱癌組織之外的正常組織，因此如何解決溶瘤腺病毒的靶向性問題成為其中的關(guān)鍵點，組織特異性啟動子解決了此類問題，它們僅在靶組織細胞中具有活性，從而使溶瘤腺病毒特異性地在膀胱癌細胞中表達，在其他組織中不表達，避免了對其他組織的不良反應(yīng)。目前在研究的啟動子主要有3類：①調(diào)控腺病毒中的E1A基因的啟動子，如人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcript-tase,hTERT)啟動子、環(huán)加氧酶2(cyclo-oxygenase 2,COX-2)啟動子、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)啟動子、肝素結(jié)合細胞因子(midkine,MK)啟動子、人UroplakinⅡ(human uroplakinⅡ,hUPⅡ)啟動子；②調(diào)控腺病毒中E1B基因的啟動子，如缺氧啟動子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)；③其他，如UPⅡ啟動子驅(qū)動腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、ORE(Oct-3/4 response element)結(jié)合CMVmini啟動子、Survivin驅(qū)動抑癌基因LRIG1啟動子。

2 特異性啟動子調(diào)控溶瘤腺病毒治療膀胱癌

2.1特異性啟動子調(diào)控E1A基因的腺病毒治療膀胱癌 COX-2是一種前列腺素合成酶，高表達于多種癌前病變以及惡性腫瘤中，包括膀胱癌。Shirakawa等[8]在2004年以此構(gòu)建了腺病毒AdE3-COX2-327，該病毒由COX-2作為啟動子控制E1A，體外試驗顯示AdE3-COX2-327能夠在COX-2和腺病毒受體(coxsackievims-adenovims receptor，CAR)的雙表達的膀胱癌細胞5637、A549和KK47中復(fù)制并且表現(xiàn)出細胞毒性作用，而在表達COX-2、不表達CAR的T-24以及只表達CAR而不表達COX-2的H358、Colo320中不復(fù)制、也無細胞毒性作用，體內(nèi)動物實驗結(jié)果證實AdE3-COX2-327能夠抑制腫瘤細胞KK47的生長。

2006年，Melquist等[9]構(gòu)建了由BSP作為啟動子控制E1A基因的溶瘤腺病毒Ad-BSP-E1A,對其進行研究發(fā)現(xiàn)Ad-BSP-E1A對BSP和CAR陽性的膀胱癌細胞敏感，感染腫瘤細胞后對細胞具有殺傷作用。MK在包括膀胱癌在內(nèi)的幾種腫瘤細胞內(nèi)過度表達，但是在正常細胞中幾乎不表達。Terao等[10]在2007年根據(jù)其特性構(gòu)建了MK啟動子控制E1A基因的溶瘤腺病毒Ad-MK-E1A，該研究發(fā)現(xiàn)Ad-MK-E1A在5637、KK47和A549三種MK高表達的細胞中比在H891和T24這兩種MK低表達的細胞T24、H891中的復(fù)制能力更強；Ad-MK-E1A不能抑制H891的生長，但能抑制T-24、A549、KK47、5637腫瘤細胞的生長，抑制作用隨著細胞表達MK信使RNA的增多逐漸增強。在動物模型體內(nèi)，Ad-MK-E1A注入明顯抑制腫瘤生長KK47。

在尿路上皮細胞中存在的糖Uroplakins蛋白是整合薄膜蛋白組中的一種，僅表達于尿路上皮，在其他組織幾乎不表達，UPⅡ是其中一種，具有膀胱特異性，在膀胱移行上皮細胞癌中幾乎100%表達。He等[11]構(gòu)建了UPⅡ啟動子控制E1A的腺病毒Ad-UPⅡ-E1A，在將重組腺病毒Ad-UPⅡ-E1A感染膀胱癌細胞BIU-87后應(yīng)用Western blot檢測細胞中EIA蛋白為陽性，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]實驗表明，重組腺病毒Ad-UPⅡ-E1A明顯抑制膀胱癌細胞BIU-87的生長。田俊強等[12]隨后研究了一氧化氮(nitric oxide,NO)對Ad-UPⅡ-E1A轉(zhuǎn)染膀胱癌腫瘤的影響，結(jié)果顯示，NO能夠促進溶瘤腺病毒Ad-UPⅡ-E1A轉(zhuǎn)染膀胱腫瘤細胞的效率,但不同濃度NO對溶瘤腺病毒的溶瘤效果具有雙向調(diào)節(jié)作用,其中低劑量的NO能夠下調(diào)重組病毒E1A的表達促進腫瘤細胞增殖,高劑量的NO通過上調(diào)E1A的表達發(fā)揮溶瘤效應(yīng)。

UPⅡ能表達于正常的膀胱上皮細胞，且復(fù)制能力較低。由此Wang等[13]在Ad-UPⅡ-E1A的UPⅡ啟動子前面加上前列腺干細胞抗原增強子(prostate stem cell antigen enhancer，PSCAE)構(gòu)建了腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A，隨后轉(zhuǎn)染不同組織來源細胞系并且與改造前進行對比，雄激素依賴實驗和裂解細胞T-24實驗結(jié)果顯示UPⅡ啟動子具有組織特異性，它能夠使其后的目的基因僅能夠高表達于膀胱癌中，PSCAE能夠增強UPⅡ啟動子的活性；膀胱癌雄激素受體激動劑僅在雄激素受體(androgen receptor,AR)陽性膀胱癌細胞中提高腺病毒活性，而雄激素受體阻斷劑只能夠阻斷部分PSCAE活性；溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A可以有效裂解膀胱癌細胞T-24。AR的表達抑制E1A的表達，但是將AR和E1A融合構(gòu)成E1A-AR并處于同一雄激素依賴性啟動子下游后可以提高雄激素依賴性啟動子的活性，增強溶瘤腺病毒的復(fù)制。Zhai等[14]構(gòu)建了溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR，體外研究顯示，病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR對膀胱腫瘤細胞(如EJ、5637、BIU87)有較的強殺傷作用，動物實驗證實其能顯著抑制裸鼠皮下膀胱癌移植瘤生長，延長荷瘤鼠的壽命。同時，Wang等[15]對溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A及Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR在小鼠體內(nèi)進行安全性檢測，結(jié)果顯示，注射病毒的小鼠體質(zhì)量、健康狀況及行為都未發(fā)現(xiàn)異常，血液學(xué)中淋巴細胞百分比、血小板數(shù)量無明顯改變，注射病毒后的小鼠體內(nèi)重要臟器(如心、腦等)未出現(xiàn)異常，腺病毒僅在膀胱移植瘤組織內(nèi)復(fù)制和表達，證實腺病毒的近期安全性。

2.2特異性啟動子調(diào)控E1B基因的腺病毒治療膀胱癌 膀胱癌細胞中hTERT轉(zhuǎn)錄水平升高，致使細胞端粒酶活性明顯增強。HIF-1在膀胱腫瘤細胞中表達，而在正常細胞中不表達[16]。胡建鵬等[17]構(gòu)建了由hTERT啟動子控制E1A基因，HIF-1啟動子控制E1B基因的雙調(diào)控攜帶超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A (staphylococcus enterotoxin A,SEA)基因的腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒SG502-SEA，體外細胞實驗證實攜帶SEA基因的hTERT/HIF雙調(diào)控溶瘤腺病毒可在鼠膀胱癌細胞內(nèi)復(fù)制、增殖并表達SEA基因，且其對腫瘤細胞有明顯殺傷作用。

2.3其他類型腺病毒治療膀胱癌 朱宏建等[18]將hUPⅡ啟動子和TNF-α克隆到腺病毒Ad5中，構(gòu)建重組體pAd-UPⅡ-TNF，研究表明BIU-87細胞經(jīng)重組腺病毒感染后可產(chǎn)生高水平的TNF-α,并降低BIU-87的生長速度，感染腺病毒的BIU-87培養(yǎng)液可抑制L929細胞的生長。裸鼠實驗顯示，膀胱灌注重組腺病毒48 h后,裸鼠尿液含高水平的TNF-α,4周后腺病毒組膀胱質(zhì)量和體積顯著低于對照組。Oct-3/4參與腫瘤的生長，在膀胱癌中大量表達，在正常細胞中檢測不到。由此，Wu等[19]構(gòu)建了E1B缺失腺病毒Ad.90C，該病毒由Oct-3/4反應(yīng)元件和CMVmini啟動子共同控制。實驗結(jié)果顯示，在Oct-3/4表達水平越高的細胞中Ad.9OC顯示出更強的細胞溶解效應(yīng)，特別是Oct-3/4陽性的轉(zhuǎn)移性膀胱癌，而在正常的細胞中無不良反應(yīng)。Survivin基因的表達產(chǎn)物Survivin蛋白具有抗凋亡作用，其在多種腫瘤中大量表達，包括膀胱癌，而在正常細胞中不表達。嚴澤軍等[20]由此構(gòu)建了腺病毒Ad-Surp-LRIG1，該病毒是將抑癌基因LRIG1導(dǎo)入腺病毒后在其前面加上Survivin啟動子控制其增殖，隨后對其進行純化，鑒定并測定其滴度，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了溶瘤腺病毒Ad-Surp-LRIG1，其可用于進一步研究。隨后蔣軍輝等[21]用該病毒對T24(人膀胱癌細胞株)進行轉(zhuǎn)染確定其增殖能力以及是否能影響T24細胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，其在T24中能夠增殖并且可使T24細胞的侵襲能力得到抑制。

3 結(jié)語和展望

自2003年以來，特異性啟動子溶瘤腺病毒治療膀胱癌取得了巨大的進步，在新病毒的探索等方面取得了巨大的成就，但是仍有些問題需要解決。①免疫問題：機體對溶瘤腺病毒的免疫清除作用影響著溶瘤腺病毒在機體內(nèi)的作用，特別是治療膀胱癌的轉(zhuǎn)移病灶時該問題更加明顯。②目前的研究都只是在體外的細胞實驗以及鼠模型上進行，其臨床效果還不得而知。③特異性啟動子溶瘤腺病毒的感染能力較低，有待進一步提高，其與傳統(tǒng)放、化療的相互作用有待研究。④溶瘤腺病毒的安全性還有待研究，特別是長遠影響，目前這方面還缺乏研究。隨著科學(xué)的進步，對膀胱癌和溶瘤腺病毒的研究將更加深入，以上問題也將逐漸得到解決，特異性啟動子調(diào)控的溶瘤腺病毒必將成為人類攻克膀胱癌的利器。

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