杜慶紅(綜述)，韓 琳，李衛(wèi)紅(審校)

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，北京 100029)

門靜脈高壓(portal hypertension，PHT)是肝硬化形成過程中和形成后的一個(gè)重要病理過程，并且引起很多嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。PHT的發(fā)病機(jī)制有前向血流和后向血流兩種學(xué)說。后向血流理論認(rèn)為，肝內(nèi)血管阻力升高是PHT形成的始動(dòng)因素，這是PHT形成的最經(jīng)典理論。前向血流理論的核心是，PHT后期內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)形成，內(nèi)臟血管舒張物質(zhì)增多，對(duì)血管收縮物質(zhì)反應(yīng)性下降，導(dǎo)致血管擴(kuò)張、門靜脈血流量增多，從而維持門靜脈高壓狀態(tài)[1-2]。研究表明，肝內(nèi)和肝外RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑調(diào)節(jié)失常參與PHT的形成。

1 RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑概述

RhoA蛋白屬于Ras蛋白超家族成員。在細(xì)胞代謝過程中，RhoA蛋白與鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)結(jié)合為活性狀態(tài)，與鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)結(jié)合為非活性狀態(tài)。通過GTP與GDP之間的轉(zhuǎn)換,從而觸發(fā)或終止細(xì)胞級(jí)聯(lián)活化反應(yīng)。通過磷酸化過程，RhoA-GDP轉(zhuǎn)換為RhoA-GTP；通過去磷酸化過程，RhoA-GTP轉(zhuǎn)換為RhoA-GDP，從而起到分子開關(guān)的作用。鳥苷酸交換蛋白或鳥苷酸交換因子控制Rho蛋白GDP與GTP的交換。從GDP結(jié)合形式到GTP結(jié)合形式為正調(diào)控，從GTP結(jié)合形式到GDP結(jié)合形式為負(fù)調(diào)控[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，參與正向調(diào)控的交換蛋白為GDP解離促進(jìn)蛋白，參與負(fù)向調(diào)控的交換蛋白為GDP解離抑制蛋白，通過正向調(diào)控和負(fù)向調(diào)控調(diào)節(jié)Rho蛋白的活性[5]。另外，GTP酶激活蛋白也參與調(diào)節(jié)Rho蛋白活性，使Rho蛋白從活性狀態(tài)變?yōu)闊o活性狀態(tài)。

1996年，Rho kinaseα/ROCK2和Rho kinaseβ/ROCK1被發(fā)現(xiàn)是Rho蛋白最主要的下游效應(yīng)蛋白。其中，ROCK1主要表達(dá)于炎性細(xì)胞，ROCK2表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞，參與血管平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖等[6]。研究證明，與PHT發(fā)病相關(guān)的主要是ROCK2[7]。ROCK2的分子結(jié)構(gòu)包括N端的催化結(jié)構(gòu)域、中央Rho結(jié)合的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和C端調(diào)節(jié)性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。激動(dòng)劑與細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，引發(fā)Rho蛋白GDP結(jié)合形式與GTP結(jié)合形式之間的轉(zhuǎn)換。Rho激酶接受RhoA傳遞的活化信號(hào)，繼而導(dǎo)致多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化，并介導(dǎo)其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)。

肌球蛋白磷酸酶(myosin phosphatase，MP)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)、ezrin/radxin/moesin家族、內(nèi)收蛋白、phosphatase and tensin homolog on chromosome 10、單絲氨酸蛋白激酶及蛋白激酶C抑制蛋白(protein kinase C-potentiated inhibitor protein，CPI-17)均屬于Rho激酶的底物。MP由3個(gè)亞單位組成，包括(110～130)×103肌球蛋白靶標(biāo)亞單位(myosin targeting subunit，MYPT1)、20×103功能不明的小亞單位和37×103催化亞單位?；罨腞ho激酶磷酸化MYPT1肽鏈的696位蘇氨酸，從而使MP失活。失活的MP失去將MLC脫磷酸化的作用，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)磷酸化的MLC水平提高，肌動(dòng)肌球蛋白交聯(lián)增加，從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合，血管收縮[8]。CPI-17與肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)結(jié)合后，掩蓋MLC催化亞單位，從而抑制MLCP的活性，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞收縮。目前，參與PHT形成的研究最多的Rho激酶底物是MP、MLC及CPI-17。

2 RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑與鈣敏化

在平滑肌的收縮過程中，MLC的磷酸化水平是決定平滑肌收縮程度的一個(gè)重要因素。在正常的條件下，血管收縮物質(zhì)通過提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平及其敏感性促進(jìn)血管收縮。前者依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白，后者不依賴Ca2+，而是通過抑制MLCP的活性提高M(jìn)LC的磷酸化水平，促進(jìn)平滑肌收縮。即使Ca2+濃度不變，Ca2+敏感性的變化也會(huì)引起MLC磷酸化水平和平滑肌收縮的改變。研究發(fā)現(xiàn)，激活的Rho激酶磷酸化CPI-17，磷酸化的CPI-17與MLCP結(jié)合后，掩蓋肌MLC催化亞單位，從而抑制MLCP的活性，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的收縮，此即鈣敏化過程[9]。

3 RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑與PHT

3.1RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑在后向血流機(jī)制中的作用 PHT時(shí)肝內(nèi)血管阻力升高包括兩方面的因素，其中機(jī)械性因素占70%，功能性、可改變的因素占30%[10]。機(jī)械性因素主要表現(xiàn)為各種因素導(dǎo)致的肝組織纖維增生，肝內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)重建，門靜脈血液回流阻力增加；功能性因素一方面表現(xiàn)為肝內(nèi)收縮細(xì)胞數(shù)目增多，主要是活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，另一方面體現(xiàn)在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管活性物質(zhì)的不平衡，血管舒張物質(zhì)減少，收縮物質(zhì)增多，血管張力增加[11]。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷和HSC活化是PHT的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HSC位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的周圍，屬于另外一種肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。各種原因?qū)е碌母渭?xì)胞損傷，肝竇周圍的HSC經(jīng)歷形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上的變化，成為肌纖維母細(xì)胞樣的細(xì)胞?；罨蟮腍SC具有增強(qiáng)的纖維生成能力，能夠收縮，有免疫調(diào)節(jié)和遷移潛能[12]。HSC活化以后表達(dá)平滑肌樣蛋白，通過收縮使肝竇管徑變小，肝內(nèi)血管阻力增加，門脈壓力升高；分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，導(dǎo)致Disse間隙毛細(xì)血管化，肝細(xì)胞與血液不能充分進(jìn)行物質(zhì)交換，加重肝細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化時(shí)肝組織中RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑與HSC的活化有非常重要的關(guān)系[13-14]。

早在1999年，Kawada等[15]發(fā)現(xiàn)，Rho激酶的抑制劑Y-27632可抑制離體培養(yǎng)的HSC的MLC磷酸化水平，從而減弱HSC的遷移和收縮，降低HSC的能動(dòng)性。Zhou等[16]發(fā)現(xiàn)，在膽總管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)導(dǎo)致的PHT模型中肝臟RhoA和Rho激酶在基因和蛋白水平表達(dá)增加，肝硬化大鼠和肝硬化患者肝臟Rho激酶活性升高。靜脈注射Y-27632可降低離體灌流肝臟對(duì)血管收縮物質(zhì)的敏感性，降低門靜脈壓力，并且降壓效果與劑量相關(guān)[17]。然而,大劑量Y-27632在降低門靜脈壓力的同時(shí)，其在內(nèi)臟循環(huán)的血管擴(kuò)張作用也帶來了內(nèi)臟循環(huán)阻力降低和平均動(dòng)脈壓力降低的不良反應(yīng)。因此，開發(fā)專門針對(duì)肝臟Rho激酶的靶向抑制劑成為解決此問題的關(guān)鍵。Klein等[18]將Y-27632與載體結(jié)合，通過靶向抑制活化的HSC，抑制Rho激酶的活性，降低肝內(nèi)血管阻力，同時(shí)對(duì)體循環(huán)無不良反應(yīng)。Xu等[19]發(fā)現(xiàn)，丹參的有效成分丹酚酸B也可抑制RhoA和Rho激酶的活化，減弱內(nèi)皮素1誘導(dǎo)的HSC收縮，降低門靜脈壓力。Hennenberg等[20]發(fā)現(xiàn)，多激酶抑制劑sorafenib也可以抑制肝組織Rho激酶在蛋白和信使RNA水平的表達(dá)，降低Rho激酶的活性，從而降低肝內(nèi)血管阻力、降低門靜脈壓力，然而，sorafenib對(duì)于肝外血管阻力沒有影響。因此推測(cè)，在肝外血管還有其他機(jī)制調(diào)控Rho激酶的表達(dá)，這也是待解決的問題之一。

3.2RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑在前向血流機(jī)制中的作用 在肝外方面，BDL大鼠胸主動(dòng)脈RhoA蛋白表達(dá)沒有變化。但在胸主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈，Rho激酶表達(dá)和活性下降，并且這種降低與主動(dòng)脈的收縮性下降有關(guān)[21]。Y-27632可顯著提高離體主動(dòng)脈環(huán)的收縮性[22]。Y-27632對(duì)假手術(shù)大鼠肝內(nèi)循環(huán)阻力幾乎沒有影響，但是能夠降低內(nèi)臟循環(huán)的血流阻力，并且這種效應(yīng)比在BDL大鼠更顯著。由此說明，在生理狀態(tài)下，RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑主要在于調(diào)節(jié)內(nèi)臟血管收縮、維持血液循環(huán)阻力。BDL大鼠內(nèi)臟組織Rho激酶表達(dá)下降是內(nèi)臟血管擴(kuò)張的原因之一。RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑升高肝臟血管阻力的效應(yīng)強(qiáng)于在內(nèi)臟降低血管阻力的效應(yīng)，所以Y-27632能夠降低門靜脈壓力。Hennenberg等[23]在另外的研究中發(fā)現(xiàn)，BDL大鼠胸主動(dòng)脈Rho激酶的底物MYPT1和CPI-17表達(dá)下降，使得胸主動(dòng)脈鈣敏化減弱，促進(jìn)動(dòng)脈擴(kuò)張。根據(jù)目前PHT高動(dòng)力循環(huán)的研究進(jìn)展，PHT時(shí)不只是胸主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈擴(kuò)張，血液匯入門靜脈的臟器血管均處于過度擴(kuò)張狀態(tài)。RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑在內(nèi)臟組織血管中的變化還不得而知。

4 小 結(jié)

RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑在纖維化肝組織和離體活化的HSC表達(dá)增加，促進(jìn)HSC收縮，導(dǎo)致肝內(nèi)門靜脈回流阻力增加。而在肝外組織，Rho激酶活性下降，促進(jìn)內(nèi)臟血管擴(kuò)張，導(dǎo)致PHT不斷惡化。并且，在PHT動(dòng)物模型，靶向抑制肝組織Rho激酶的活性可顯著降低門靜脈壓力。由此可見，RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑在調(diào)節(jié)肝內(nèi)和肝外血管阻力、升高門靜脈壓力方面發(fā)揮了重要作用。以該途徑為切入點(diǎn)，開發(fā)治療PHT的藥物將為解決目前PHT治療窘境提供一個(gè)新思路。

[1] Moleda L,Trebicka J,Dietrich P,etal.Amelioration of portal hypertension and the hyperdynamic circulatory syndrome in cirrhotic rats by neuropeptide Y via pronounced splanchnicvasoaction[J].Gut,2011,60(8):1122-1132.

[2] Hennenberg M,Trebicka J,Sauerbruch T,etal.Mechanisms of extrahepatic vasodilation in portal hypertension[J].Gut,2008,57(9):1300-1314.

[3] Somlyo AP,Somlyo AV.Signal transduction by G-proteins,Rho kinase and protein phosphatase to smooth muscle and non muscle myosin Ⅱ[J].J Physiol,2000,522(Pt 2):177-185.

[4] Bishop AL,Hall A.Rho GTPases and their effector proteins[J].Biochem J,2000,348:241-255.

[5] Bielnicki JA,Shkumatov AV,Derewenda U,etal.Insights into the molecular activation mechanism of the RhoA-specific guanine nucleotide exchange factor[J].J Biol Chem,2011,286(40):35163-35175.

[6] Mueller BK,Mack H,Teusch N.Rho kinase,a promising drug target for neurological disorders[J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(5):387-398.

[7] Kurosawa H.Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells[J].J Biosci Bioeng,2012,114(6):577-581.

[8] Antoniu SA.Targeting RhoA/ROCK pathway in pulmonary arterial hypertension[J].Expert Opin Ther Targets,2012,16(4):355-363.

[9] Sanderson MJ,Delmotte P,Bai Y,etal.Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+signaling and sensitivity[J].Proc Am Thorac Soc,2008,5(1):23-31.

[10] Bhathal PS,Grossman HJ.Reduction of the increased intrahepatic vascular resistance of the isolated perfused cirrhotic rat liver by vasodilators[J].J Hepatol,1985,1(4):325-337.

[11] Trebicka J,Hennenberg M,Schulze Probsting A,etal.Role of beta3-adrenoceptors for intrahepatic resistance and portal hypertension in liver cirrhosis[J].Hepatology,2009,50(6):1924-1935.

[12] Friedman SL.Seminars in medicine of the beth israel hospital,boston.The cellular basis of hepatic fibrosis:mechanisms and treatment strategies[J].N Engl J Med,1993,328(25):1828-1835.

[13] van Beuge MM,Prakash J,Lacombe M,etal.Reduction of fibrogenesis by selective delivery of a Rho kinase inhibitor to hepatic stellate cells in mice[J].J Pharmacol Exp Ther,2011,337(3):628-635.

[14] van Beuge MM,Prakash J,Lacombe M,etal.Increased liver uptake and reduced hepatic stellate cell activation with a cell-specific conjugate of the Rho-kinase inhibitor Y27632[J].Pharm Res,2011,28(8):2045-2054.

[15] Kawada N,Seki S,Kuroki T,etal.ROCK Inhibitor Y-27632 attenuates stellate cell contraction and portal pressure increase induced by endothelin-1[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,266(2):296-300.

[16] Zhou Q,Hennenberg M,Trebicka J,etal.Intrahepatic upregulation of RhoA and Rho-kinase signalling contributes to increased hepatic vascular resistance in rats with secondary biliary cirrhosis[J].Gut,2006,55(9):1296-1305.

[17] Anegawa G,Kawanaka H,Yoshida D,etal.Defective endothelial nitric oxide synthase signaling is mediated by Rho-kinase activation in rats with secondary biliary cirrhosis[J].Hepatology,2008,47(3):1-12.

[18] Klein S,Van Beuge MM,Granzow M,etal.HSC-specific inhibition of Rho-kinase reduces portal pressure in cirrhotic rats without major systemic effects[J].J Hepatol,2012,57(6):1220-1227.

[19] Xu H,Zhou Y,Lu C,etal.Salvianolic acid B lowers portal pressure in cirrhotic rats and attenuates contraction of rat hepatic stellate cells by inhibiting RhoA signaling pathway[J].Lab Invest,2012,92(12):1738-1748.

[20] Hennenberg M,Trebicka J,Stark C,etal.Sorafenib targets dysregulated Rho kinase expression and portal hypertension in rats with secondary biliary cirrhosis[J].Br J Pharmacol,2009,157(2):258-270.

[21] Trebicka J,Leifeld L,Hennenberg M,etal.Hemodynamic effects of urotensin Ⅱ and its specific receptor antagonist palosuran in cirrhotic rats[J].Hepatology,2008,47(4):1264-1276.

[22] Hennenberg M,Biecker E,Trebicka J,etal.Defective RhoA/Rho-kinase signaling contributes to vascular hypocontractility and vasodilation in cirrhotic rats[J].Gastroenterology,2006,130(3):838-854.

[23] Hennenberg M,Trebicka J,Biecker E,etal.Vascular dysfunction in human and rat cirrhosis:role of receptor-desensitizing and calcium-sensitizing proteins[J].Hepatology,2007,45(2):495-506.