李小麗，李亞青，鐘亞莉，樊慧杰(綜述)，張明智，索振河(審校)

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，鄭州 450052)

丙酮酸是糖類、脂肪和氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐,細(xì)胞整體代謝狀態(tài)決定丙酮酸的代謝。有氧條件下，載體將丙酮酸從細(xì)胞基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體基質(zhì)，繼而被丙酮酸脫氫酶復(fù)合體轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A和二氧化碳；在無氧環(huán)境中，胞質(zhì)中丙酮酸經(jīng)無氧糖酵解形成乳酸并從細(xì)胞中轉(zhuǎn)出。線粒體丙酮酸載體(mitochondirial pyruvate carrier，MPC)是丙酮酸穿越線粒體膜過程中發(fā)揮重要作用的蛋白。此外，更重要的是腫瘤細(xì)胞即使在有氧的狀況下，也偏好糖酵解獲取能量。盡管科學(xué)屆已經(jīng)在多個(gè)世紀(jì)前就注意到這種現(xiàn)象，但其分子機(jī)制直至目前尚未明確。MPC近年來的研究為進(jìn)一步研究腫瘤、腫瘤干細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞干性調(diào)節(jié)帶來了新的契機(jī)。

1 MPC研究歷程

最初認(rèn)為，丙酮酸可以以非解離形式自由通過細(xì)胞內(nèi)膜。隨后對(duì)其生化特性評(píng)估發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)丙酮酸以離子形式存在，因此推測(cè)存在轉(zhuǎn)運(yùn)體易化丙酮酸進(jìn)出細(xì)胞膜[1-2]。后來利用無蛋白的脂質(zhì)體模型研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸有直接跨膜能力[3]。但是該實(shí)驗(yàn)中丙酮酸濃度為100 mmol，這比細(xì)胞積聚濃度高出1000倍[4]，而且人造膜并不具有線粒體內(nèi)膜的滲透性和其他特性。

1971年，Papa等[5]從大鼠肝臟中提純線粒體，用抑制劑進(jìn)行預(yù)處理后與放射物標(biāo)記丙酮酸混合，在HClO4硅油微梯度介質(zhì)中離心，觀察丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。該研究證實(shí)丙酮酸通過特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨越線粒體膜，首次提出MPC的概念，早期被命名為BRP44L和BRP44。BRP44L和BRP44分別是brain protein 44-like,brain protein 44,這是依據(jù)當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的蛋白表達(dá)位置命名的，而MPC是根據(jù)其功能命名的(分別代表MPC1和MPC2)，但后來證明該實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)體為輔酶Ⅰ(即NAD+)轉(zhuǎn)運(yùn)體，它的活性類似于丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[6]。

隨后發(fā)現(xiàn)，煮沸變性的線粒體依然能夠像正常線粒體一樣積聚一定濃度的丙酮酸[7]。這項(xiàng)研究推測(cè)丙酮酸可能只是吸附在膜上，并未發(fā)生跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，也就是可能不存在丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。但隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的逐步更新，對(duì)MPC的動(dòng)力學(xué)、調(diào)控機(jī)制和分子表達(dá)的認(rèn)識(shí)也在不斷深化，為MPC的鑒定和功能研究提供了重要的理論依據(jù)。

2 MPC認(rèn)知的發(fā)展

2.1MPC特異性抑制劑 Halestrap等[8]發(fā)現(xiàn),α-氰基-4-對(duì)羥基肉桂酸乙酯(α-cyano-4-hydroxycinnamate，CHC)能與線粒體膜上特定的蛋白結(jié)合，對(duì)其進(jìn)行鑒別證實(shí)CHC通過阻止線粒體丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制丙酮酸氧化。抑制劑在完整的線粒體中發(fā)揮阻礙轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝活動(dòng)的作用，對(duì)破裂的線粒體沒有影響。也就是說，抑制劑作用于線粒體膜，而不是作用于酶，證實(shí)了MPC的存在。其中，CHC類似物UK5099[alpha-cyano-beta-(1-phenylindol-3-yl)acrylate]，具有更強(qiáng)更特異的抑制作用。

Pande等[9]利用肉桂酸鹽抑制丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)。正常線粒體中積聚1 mmol丙酮酸即可發(fā)生氧化作用，但是在60 mmol丙酮酸中加入經(jīng)CHC預(yù)處理的線粒體，丙酮酸不能被氧化，表明CHC作為一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑抑制丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)60 mmol丙酮酸存在條件下，線粒體對(duì)CHC抑制產(chǎn)生抵抗作用。因此證明CHC作為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，高濃度丙酮酸(60 mmol)使細(xì)胞產(chǎn)生CHC抵抗。

Feinstein等[10]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噻唑烷二酮類(thiazolidinediones，TZDs)能夠直接影響線粒體功能，對(duì)細(xì)胞的呼吸存在特異性抑制作用。之后,Divakaruni等[11]也證實(shí),MPC是TZDs結(jié)合的特異性靶位點(diǎn)，TZDs的抑制作用能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝。

TZDs和UK5099均可作為MPC的化學(xué)抑制劑，兩者通過不同的途徑抑制線粒體丙酮酸的攝入，阻斷丙酮酸氧化作用。UK5099與MPC1的硫醇基特異性共價(jià)結(jié)合，該結(jié)合不可逆，MPC將永久被抑制[12]；TZDs通過與細(xì)胞核過氧化物酶增殖物激活受體γ結(jié)合，調(diào)控脂肪儲(chǔ)存、細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)及最重要的丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)[13-14]，而經(jīng)洗滌和透化作用后TZDs的抑制作用消失。

由于線粒體上其他轉(zhuǎn)運(yùn)體的存在和持續(xù)的新陳代謝，以及代謝產(chǎn)物對(duì)丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)也存在一定的影響作用，很難清楚地在整體環(huán)境中研究線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體的特性。如果能獨(dú)立重構(gòu)MPC基因和蛋白并實(shí)現(xiàn)生化提純，將有利于對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能做出進(jìn)一步研究。

2.2MPC的純化 Paradies[15]利用標(biāo)記14C的α-氰基肉桂酸與MPC作用后發(fā)現(xiàn)丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，因此認(rèn)定抑制劑、MPC和丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)之間存在直接聯(lián)系。另外，用UK5099浸泡線粒體30 min，再100倍稀釋線粒體，UK5099對(duì)MPC的抑制作用無法解除[16]。從此，人們根據(jù)該實(shí)驗(yàn)原理利用固化抑制劑的方法提純MPC。

Bolli等[17]利用羥基磷石灰層析和識(shí)別特異性蛋白的方法，建立了一套精確的重建MPC方法。實(shí)驗(yàn)中，使2-氰基-4-羥基肉桂酸與瓊脂糖共價(jià)結(jié)合。利用羥基磷石灰提純后，線粒體片斷通過肉桂酸柱，其中34×103和31.5×103的蛋白質(zhì)被留下來[17]。在牛的心臟和大鼠肝臟的研究中發(fā)現(xiàn)，(29～37)×103范圍大小的蛋白質(zhì)具有催化丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[18]。MPC提純技術(shù)的成熟，為載體獨(dú)立系統(tǒng)的構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，促進(jìn)MPC的認(rèn)知發(fā)展。

3 MPC的基因組成、蛋白結(jié)構(gòu)和功能

人MPC是由MPC1和MPC2組成的復(fù)合體。MPC1的基因組DNA全長(zhǎng)18 095 bp，含有5個(gè)外顯子，位于6q27；MPC2基因組全長(zhǎng)20 312 bp，含有5個(gè)外顯子，位于1q24.2。MPC1和MPC2在線粒體膜上擁有兩個(gè)跨膜α螺旋，兩者共同構(gòu)成的異質(zhì)二聚體組成具有丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，該復(fù)合體蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為150×103。

近期發(fā)表在科學(xué)雜志上的文章進(jìn)一步揭示了MPC的生物學(xué)特性。Bricker等[19]從高度保守的線粒體蛋白著手，剔除或沉默哺乳動(dòng)物MPC基因，細(xì)胞糖分解中間產(chǎn)物和丙酮酸增多，伴有乙酰輔酶A和三羧酸循環(huán)代謝物減少。Herzig等[20]針對(duì)細(xì)胞硫辛酸合成缺陷與纈氨酸和亮氨酸缺乏的生長(zhǎng)缺陷對(duì)MPC進(jìn)行識(shí)別和功能表達(dá)研究。這兩個(gè)方法和策略從完全不同的實(shí)驗(yàn)得出了相同的結(jié)論：MPC是由多種蛋白組成的復(fù)合體。

Bricker等[19]利用非變性凝膠電泳和免疫沉淀法證明載體蛋白相互作用形成大的復(fù)合物，但MPC1和MPC2的相對(duì)分子質(zhì)量不同。另外，從丙酮酸代謝缺陷患者中識(shí)別出兩處關(guān)鍵性基因突變[21]。測(cè)序研究顯示兩處突變發(fā)生在MPC1高度保守區(qū)域，代謝研究發(fā)現(xiàn)使表達(dá)野生型MPC1可以治愈丙酮酸代謝缺陷[22]。這些數(shù)據(jù)有力地證明了MPC1/MPC2復(fù)合體是線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的主要組成部分。

Herzig等[20]從Pfam數(shù)據(jù)庫中識(shí)別出一個(gè)膜蛋白家族，它們對(duì)于把丙酮酸運(yùn)輸進(jìn)線粒體是充分而且必要的。此家族被重新命名為MPC家族。研究者從小鼠肝中識(shí)別了該家族的兩個(gè)成員——MPC1和MPC2。兩者均為線粒體內(nèi)膜蛋白，都擁有兩個(gè)跨膜α螺旋。小鼠MPC1和MPC2還與酵母菌線粒體內(nèi)膜的MPC1、MPC2和MPC3具有序列相似性。繼而以釀酒酵母菌為模式生物探討MPC家族蛋白質(zhì)的功能，發(fā)現(xiàn)MPC1缺失或者M(jìn)PC2和MPC3聯(lián)合缺失的酵母菌細(xì)胞在氨基酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)減慢，而表達(dá)MPC1基因可恢復(fù)其生長(zhǎng)速度。另外，研究者在乳酸乳球菌中共表達(dá)小鼠的MPC1和MPC2，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)丙酮酸的跨膜運(yùn)輸，并且這種促進(jìn)作用隨線粒體膜內(nèi)外的電化學(xué)梯度減小而減弱[20]。上述觀察結(jié)果有力地證明了MPC家族分子尤其是MPC1和MPC2對(duì)線粒體的丙酮酸運(yùn)輸起關(guān)鍵作用[20]。

線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)丙酮酸是葡萄糖氧化、脂肪生成、糖異生和一些氨基酸合成的基礎(chǔ)。大多數(shù)代謝酶存在于線粒體基質(zhì)中，而線粒體內(nèi)膜在代謝產(chǎn)物與基質(zhì)接觸過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，通道的缺乏將阻礙丙酮酸的代謝。MPC調(diào)控丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響糖代謝、能量產(chǎn)生和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

4 MPC功能表達(dá)異常相關(guān)的疾病

對(duì)三個(gè)無血緣關(guān)系的家庭進(jìn)行人類基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)患有乳酸酸中毒的兒童MPC1發(fā)生突變，使成纖維細(xì)胞表達(dá)野生型MPC1將修復(fù)丙酮酸依賴的細(xì)胞呼吸作用[22]。對(duì)具有代謝障礙疾病的患者M(jìn)PC基因進(jìn)行測(cè)序，有利于在臨床上選擇合適的飲食或藥物進(jìn)行治療。

數(shù)年來，對(duì)哺乳動(dòng)物MPC分子特性的認(rèn)識(shí)仍然很少，但多數(shù)研究探討了MPC與糖異生、激素和藥物的調(diào)控機(jī)制、甲狀腺功能亢進(jìn)、老化和糖尿病等病理狀態(tài)的聯(lián)系，證明了MPC的生理意義和調(diào)控機(jī)制。對(duì)于先天性代謝缺陷疾病的臨床研究發(fā)現(xiàn)，MPC缺陷和丙酮酸脫氫酶復(fù)合體突變的臨床表現(xiàn)相似[19,21]。對(duì)于那些懷疑丙酮酸脫氫酶復(fù)合體基因突變但酶活性正常的患者，很可能其MPC已經(jīng)發(fā)生了突變。MPC缺陷或被抑制的細(xì)胞出現(xiàn)丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，但通過添加甲基丙酮酸可以改變這一狀況，這也是區(qū)別丙酮酸脫氫酶復(fù)合體缺陷和MPC功能異常的方法[11]。

5 MPC與腫瘤關(guān)系

當(dāng)前對(duì)腫瘤代謝的研究熱點(diǎn)包括腫瘤細(xì)胞糖酵解、氧化磷酸化、脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)和低氧條件下細(xì)胞因子的表達(dá)等。但是，截至目前為止腫瘤丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)物模型還未見報(bào)道。有文獻(xiàn)提示，MPC缺陷不僅可以導(dǎo)致代謝障礙，也可導(dǎo)致腫瘤病理生理學(xué)意義上的代謝改變[22-24]。

SAGE數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，基因BRP44在前列腺癌組織的表達(dá)數(shù)據(jù)庫中高表達(dá),超過癌周圍正常組織的10倍。同時(shí)在人體所有腫瘤及正常組織中,BRP44在前列腺癌組織的表達(dá)強(qiáng)度最高；在雄激素依賴型的人前列腺癌(lymph node carcinoma of prostate，LNCaP)細(xì)胞系中高表達(dá)而在雄激素非依賴性人前列腺癌(prostate cancer-3，PC-3)細(xì)胞系中不表達(dá)。提示BRP44可能是一個(gè)與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因[25]。抑制BRP44在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)后,LNCaP細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)[24]。BRP44-PC3細(xì)胞較正常PC3細(xì)胞有更強(qiáng)的DNA合成能力、細(xì)胞分裂增殖能力和侵襲力[26]。研究證實(shí)，MPC缺陷促進(jìn)糖分解代謝。與正常肝臟細(xì)胞相比，艾氏瘤細(xì)胞的線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體活性極低，而糖分解較快，提示MPC表型發(fā)生改變[23]。艾氏腹水細(xì)胞、莫里斯肝癌44細(xì)胞和莫里斯肝癌3924A細(xì)胞與正常大鼠肝臟細(xì)胞相比，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體的最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率下降，參與呼吸作用的丙酮酸減少，跨膜pH梯度變小。因此認(rèn)為，載體減少引起轉(zhuǎn)運(yùn)體活性下降，造成丙酮酸代謝缺陷[27]。

對(duì)線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)與腫瘤代謝兩者之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)很少，它們之間的關(guān)系和影響很有趣。腫瘤細(xì)胞常?；钴S地?cái)z取葡萄糖，進(jìn)行有氧糖酵解，即瓦伯格效應(yīng)[28]。這種消耗大量能量供應(yīng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方式是必需的，它為腫瘤細(xì)胞的不斷生長(zhǎng)提供能量和生物合成的原料。已有研究表明，多數(shù)腫瘤細(xì)胞都存在不同水平的糖酵解關(guān)鍵酶，如己糖激酶、磷酸果糖激酶，丙酮酸激酶和丙酮酸脫氫酶活性的異常[29-30]。這些異常與腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解即瓦伯格效應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。乳酸脫氫酶、M2型丙酮酸激酶和丙酮酸脫氫酶直接影響丙酮酸代謝，也間接地影響丙酮酸進(jìn)入線粒體的速度[31-33]。因此有理由推測(cè)，MPC在腫瘤相關(guān)的丙酮酸代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

6 MPC與腫瘤細(xì)胞的干性調(diào)節(jié)

目前對(duì)腫瘤細(xì)胞MPC的表達(dá)及其功能的研究還很有限。但是已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在低氧情況下可以通過上調(diào)其干性(stemness)獲取生存能力以及化療耐藥特性[34-36]。對(duì)前列腺癌和食管癌細(xì)胞系體外不同氧濃度下干細(xì)胞特性的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞在低氧情況下可以相應(yīng)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子，從而干細(xì)胞相關(guān)因子上調(diào)[35-36]。低氧的微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的干性維持密切關(guān)系，而低氧的條件也迫使細(xì)胞通過糖酵解的方式產(chǎn)生能量,提示其他迫使腫瘤細(xì)胞進(jìn)行糖酵解的途徑同樣可能會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的干性水平。然而前列腺癌LNCaP細(xì)胞系中MPC2高表達(dá)的報(bào)道提示，活躍的丙酮酸氧化磷酸化可能是腫瘤組織的特性之一[23]。在組織氧氣供應(yīng)正常情況下(多數(shù)腫瘤周邊的或者靠近血管的腫瘤細(xì)胞)，腫瘤細(xì)胞的MPC高表達(dá)，后者M(jìn)PC功能上揚(yáng)，從而腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍。然而，瓦伯格效應(yīng)不應(yīng)該是所有腫瘤細(xì)胞所具有的特性，而是某些腫瘤細(xì)胞，如腫瘤團(tuán)塊中心缺氧的部分或者遠(yuǎn)離血管的部分腫瘤細(xì)胞，以及當(dāng)腫瘤細(xì)胞在遭受化療/放療等打擊的情況下主動(dòng)關(guān)閉氧化磷酸化程序，并且開啟糖酵解途徑，從而獲取了更大的細(xì)胞干性，增強(qiáng)了細(xì)胞抵御極端環(huán)境因素打擊的那些腫瘤細(xì)胞的特有能力。如果該假設(shè)可以被進(jìn)一步證明的話，針對(duì)MPC和腫瘤干細(xì)胞的研究一定會(huì)有積極的意義。

7 結(jié) 語

MPC在葡萄糖氧化、脂肪生成、糖異生和部分氨基酸合成中發(fā)揮重要作用，主要是因?yàn)镸PC是丙酮酸在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)蛋白，決定丙酮酸代謝的去路。MPC缺陷能夠引起類似丙酮酸脫氫酶復(fù)合體基因突變的臨床表現(xiàn)，如乳酸酸中毒和早發(fā)性、退行性神經(jīng)變性病等。MPC表達(dá)異常也可導(dǎo)致腫瘤病理生理學(xué)意義上的代謝改變。近年來對(duì)MPC基因及其功能的進(jìn)一步研究提示，MPC在腫瘤組織的瓦伯格效應(yīng)中可能起著重要作用，而MPC的功能狀態(tài)也可能與腫瘤細(xì)胞的干性調(diào)節(jié)密切相關(guān)。因此，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)以及體外MPC的研究可能會(huì)揭示腫瘤干細(xì)胞治療新的途徑。

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