周 燕，耿 毅，汪開毓，陽 磊，劉 丹，徐敬鈞，陳德芳，黃小麗

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，四川 雅安 625014)

似鲇高原鰍(Triplophysa siluroides)屬鯉形目，鰍科，條鰍亞科，高原鰍屬，冷水性魚類，體表花紋呈虎斑狀，俗稱“老虎魚”，主要分布于青海、四川、甘肅和寧夏的黃河干流及主要支流[1]。由于在自然分布區(qū)域被大量捕撈，從而導致資源量大幅度下降，目前僅在人煙稀少的高原地區(qū)有一定數(shù)量[2]。為更好保護與利用似鲇高原鰍，近年來在四川與青海等地逐漸開始了似鲇高原鰍的人工養(yǎng)殖與繁殖，但人為控溫、配合飼料使用與高密度養(yǎng)殖等改變及破壞了似鲇高原鰍的自然生活習性，致似鲇高原鰍抗病能力下降，不時有疾病的發(fā)生。

2012 年9 月，四川省雅安市某養(yǎng)殖場似鲇高原鰍暴發(fā)了以體表出血、明顯神經(jīng)癥狀和內(nèi)臟器官變性、壞死為特征的敗血性疾病，其累計死亡率達30 %以上。為明確其病原，本研究從患病似鲇高原鰍體內(nèi)分離鑒定到一株致病菌，并對其致病性進行了研究，為有效防控和診斷該病提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 患病似鲇高原鰍采自四川省雅安一水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體長10 cm，體質(zhì)量約20 g，具有明顯出血性敗血癥的個體13 尾，用于剖檢觀察、病料采集和病原菌分離。健康似鲇高原鰍100 尾，體質(zhì)量約20±2.5 g 購自未發(fā)病的養(yǎng)殖場。

1.2 病原菌的分離與純化 選取具有典型癥狀的似鲇高原鰍，無菌操作從肝臟和腎臟取樣，BHIA 平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)24 h～36 h 后，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌落進行純化。純化后獲得一株分離菌。

1.3 人工感染試驗 參考文獻[3]采用兩種感染方式進行。一種為腹腔注射1.0×106cfu/mL 菌液，每尾0.1 mL，同時以等量無菌生理鹽水對照，試驗觀察期14 d。另一種為浸泡感染，試驗魚浸泡于濃度為1.0×107cfu/mL 菌液1 h 后，轉(zhuǎn)入清水中，試驗觀察期21 d。

1.4 分離菌的鑒定

1.4.1 表型特征檢測 分離菌接種兔血BHIA 瓊脂平板、TSA 和普通瓊脂平板等，28 ℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察菌落生長與形態(tài)特性，同時革蘭染色觀察菌體形態(tài)與染色特征。按照《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]的方法進行主要生理生化特性檢測。

1.4.2 16S rDNA、gyrB 基因序列分析 以分離菌總DNA 為模板，PCR 擴增16S rDNA 的引物為：5'-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-TACGGCTACCTT GTTACGAC-3'[5]；PCR 擴增gyrB 基因引物為5'-GA AGTCATCATGACCGTTCTGCA-3'/5'-AGCAGGGTAC GGATGTGCGAGCC-3')[6]。PCR 反應條件：94 ℃5 min；94 ℃1 min、54 ℃1 min、72 ℃1 min，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，通過NCBI 中的Blast 進行序列分析，N-J 法構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 藥敏試驗 參照NCCLS 抗微生物藥物敏感性試驗[7]執(zhí)行標準采用紙片法進行。

1.6 病理學觀察 對收集的發(fā)病魚進行剖解，觀察各組織、器官的病理變化。取患病魚的組織樣品按常規(guī)方法制做病理組織切片，HE 染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察記錄。

2 結果

2.1 臨床病癥與剖解觀察 患病似鲇高原鰍主要表現(xiàn)為食欲減退，體表褪色，在養(yǎng)殖池中陣發(fā)性螺旋狀游動，體側(cè)壁、腹部、鰭條基部與下頜充出血，顱頂出血發(fā)紅，眼球外凸并伴有出血，腹部膨大，肛門紅腫。解剖可見病魚腹腔中有少量血色腹水，肝腫大，質(zhì)地較脆；脾顏色發(fā)黑；腎腫大，呈暗紅色；腸道充血、出血，腸腔內(nèi)有淡黃色水樣液體；腦腫脹，腦膜充血；鰓絲腫脹發(fā)黑伴有壞死。

2.2 病原菌分離 從患病似鲇高原鰍腦、肝與腎取樣BHIA 平板劃線，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)36 h 獲得1 株G-短桿的優(yōu)勢菌，菌落直徑0.2 mm～0.3 mm，表面光滑，邊緣整齊，無色透明的圓形菌落。

2.3 人工感染試驗 分離菌經(jīng)腹腔注射和浸泡感染的方法均能使健康的似鲇高原鰍發(fā)病，并表現(xiàn)出自然感染相似的癥狀與病變。腹腔注射健康似鲇高原鰍在3 d～6 d 內(nèi)發(fā)病死亡，死亡率為80 %(12/15)；而浸泡感染發(fā)病則較為緩慢，在3 d 后開始出現(xiàn)食欲減退，5 d 后開始死亡，死亡主要集中在7 d～12 d，死亡率為66.7 %(10/15)，對照組均未見任何異常。同時，從人工感染發(fā)病魚體內(nèi)重新分離到菌株，其形態(tài)特征和主要生理生化特性與原分離菌株相同(圖1)。

圖1 細菌分離株不同人工感染途徑對似鲇高原鰍致死情況Fig.1 The mortality of the bacteria isolate to the fish via different inoculated routs

2.4 分離菌的鑒定

2.4.1 培養(yǎng)特性 分離菌在普通瓊脂上不生長；在TSA 培養(yǎng)基上生長不良，經(jīng)48 h 培養(yǎng)僅形成直徑約0.1 mm，表面光滑，無色透明的圓形菌落。在兔血BHIA 瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)β 溶血特性。

2.4.2 生理生化特性 分離菌對過氧化氫酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶顯示陽性，對氧化酶陰性；發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖，不利用棉籽糖、阿拉伯糖、纖維二糖、木糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、水楊苷；還原硝酸鹽；H2S 產(chǎn)氣。綜上可初步判定分離菌為鮰愛德華氏菌(Edwardsiell ictaluri)。

2.4.3 16S rDNA 與gyrB 基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析 分離菌的16S rDNA 和gyrB 基因經(jīng)PCR 擴增后，分別得到約1 500 bp 和1 200 bp 片段，Gen-Bank 登錄號分別為KF952599、KJ001821。將獲得片段經(jīng)測序后比對分析，結果表明，分離菌的16S rDNA 與gyrB 基因序列與E.ictaluri 的同源性均高達99 %以上。系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖2、3)顯示，分離菌與E.ictaluri 聚為一族，與來源于其他水生動物的E.ictaluri 同源性分別達96.4 %～99.4 %和97.8 %～99.0 %，結合形態(tài)、生理生化特性，分離菌株鑒定為E.ictaluri，并將其命名為GYQ 株。

圖2 16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of homology

圖3 gyrB 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequence of homology

2.5 藥敏試驗 分離菌對抗生素的敏感性試驗結果見表1。

表1 分離菌的藥物敏感試驗結果Table 1 The sensitivity of the pathogen to antibiotics

2.6 病理組織學觀察 肝：肝細胞出現(xiàn)嚴重的空泡變性(圖4A)；病變嚴重區(qū)域肝小葉內(nèi)見灶性壞死，肝細胞結構破壞，嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞與淋巴細胞浸潤(圖4B)；中央靜脈及小葉間血管壁增厚，淋巴細胞、巨噬細胞浸潤，表現(xiàn)為血管炎。胰腺腺細胞壞死，大量嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞浸潤(圖4C)。

腎：腎間質(zhì)嚴重出血，大量巨噬細胞、中性白細胞和淋巴細胞浸潤(圖4D)；腎小管上皮細胞變性、脫落，一些腎小管腔內(nèi)出現(xiàn)淡紅染的蛋白管型或含有脫落上皮細胞的混合管型，病變嚴重區(qū)域的腎小管管腔結構已完全破壞，腎小球腫大，毛細血管擴張充血，血管內(nèi)皮細胞與網(wǎng)狀細胞增生(圖4E)。

脾：脾明顯充血、出血，脾組織內(nèi)淋巴細胞壞死，數(shù)量顯著減少，巨噬細胞、中性白細胞及血細胞的數(shù)量明顯增多(圖4F)，同時可見多量含鐵血黃素沉積。

腦：腦膜疏松，增厚，大量巨噬細胞、淋巴細胞和是酸性粒細胞侵潤增；腦基質(zhì)水腫，神經(jīng)元腫脹，毛細血管周間隙增寬，表現(xiàn)為明顯的腦膜腦炎(圖4G)。

鰓：鰓上皮細胞壞死、脫落、溶解，鰓小片毛細血管裸露，甚至毛細血管斷裂、壞死，鰓小片間大量中性白細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞浸潤，表現(xiàn)為壞死性鰓炎(圖4H)。

腸道：腸絨毛粘膜上皮細胞嚴重壞死脫落，腸腔內(nèi)充滯大量壞死脫落的上皮細胞和炎性滲出物，固有膜增厚，大量炎性細胞浸潤(圖4I)，嚴重區(qū)域見腸絨毛斷裂、溶解，表現(xiàn)為壞死性-卡他性腸炎。

圖4 患病似鲇高原鰍組織病理變化Fig.4 Pathological changes of diseased catfish-like loach

3 討論

E.ictaluri 屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)愛德華氏菌屬(Edwardsiella)，革蘭陰性短桿菌，最早于1979 年由Hawke 從發(fā)病的斑點叉尾鮰體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)[8]，被認為是嚴重危害斑點叉尾鮰的重要細菌性傳染病“腸型敗血癥”的病原菌[8-9]，而后在其他魚類也有感染致病的報道[10]。在本研究中，從表現(xiàn)為敗血癥的自然發(fā)病似鲇高原鰍體內(nèi)分離鑒定了E.ictaluri，并通過人工感染試驗證實為似鲇高原鰍敗血癥的病原菌。似鲇高原鰍屬鯉形目，鰍科，高原鰍屬的冷水性魚類，到目前為止，還未見鰍科魚類感染E.ictaluri 的報道。本研究首次報道了E.ictaluri 可自然感染似鲇高原鰍并致病。研究表明，E.ictaluri 至少存在兩個血清學特性與質(zhì)粒構型不同的型[10]，而這些生物學特性的差異是否與感染特性，尤其是否與宿主范圍差異有關，還需要進行進一步的研究。

E.ictaluri 感染魚類的途徑主要是消化道、鰓和鼻腔，當其經(jīng)消化道或鰓感染時，細菌進入血液并迅速分布于機體各組織器官，引起各組織器官的充血、出血、炎癥、變性、壞死和潰瘍等典型的敗血癥癥狀，即急性型；但當其經(jīng)鼻腔侵入嗅球，再經(jīng)嗅球移行到腦，引起顱頂發(fā)紅、出血、潰爛的典型病變，則為慢性型[11]。在本研究中，在自然感染發(fā)病的似鲇高原鰍中也表現(xiàn)出了以上兩種臨床類型，與E.ictaluri 感染斑點叉尾鮰和黃顙魚等鲇形目魚類相似[11-12]。病理組織變化顯示，E.ictaluri 感染似鲇高原鰍致多組織、器官損傷，表現(xiàn)為明顯的變性、壞死與炎癥反應，尤其是肝、腎、脾、鰓、腸和腦的病變較為嚴重，從而導致多器官功能障礙綜合征，最終引發(fā)感染魚死亡。似鲇高原鰍感染E.ictaluri 的病理組織學損傷特點與斑點叉尾鮰和黃顙魚等感染E.ictaluri 相似，但對于這些損傷引發(fā)的原因是病原菌直接侵襲的結果，還是病原菌毒力因子作用的結果，還需要采用電鏡技術與免疫組化技術等對病原菌在體內(nèi)的分布與病理損傷的相關性進行研究，以進一步闡明鮰感染的致病機制。

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