牟 迪，王秀梅，初勝波，劉 琪，張萬江，劉思國*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物細菌病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001；3.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林 長春 130118)

腸球菌為一種革蘭氏陽性條件致病菌，不僅可引起人體尿路感染、皮膚軟組織感染，還可導致菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等嚴重感染[1]，也可引起多種家畜家禽等動物感染發(fā)病[2]。存在于肉品中的腸球菌，是人食物中毒的主要原因[3]。由于腸球菌是人和動物腸道中的正常菌群，并且很容易捕獲耐藥基因或耐藥質(zhì)粒，常被稱之為耐藥基因的“蓄水池”，因此存在隨食物鏈傳播耐藥基因的風險。

cfr 基因于1997 年Schwarz 首次發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的Cfr 蛋白為細菌核糖體23S rRNA 甲基化酶，通過甲基化23S rRNA 的A2503 位，導致酰胺醇類、林克霉素類、惡唑烷酮類、截斷側(cè)耳素類和鏈陽菌素A 藥物耐藥，并且cfr 基因介導的耐藥為惡唑烷酮類和截短側(cè)耳素類的第一種可轉(zhuǎn)移耐藥機制[4]。目前，已在動物和人源的多種細菌中檢測到cfr 基因。但關(guān)于cfr 基因在我國動物源腸球菌中的流行狀況和傳播方式研究還較少。本研究以廣東大型豬場分離的攜帶cfr 基因的腸球菌為研究對象，通過PFGE 和Southern 雜交對cfr 基因進行親緣關(guān)系分析和定位，初步研究cfr 基因在豬源腸球菌中的傳播方式，為臨床制定合理措施控制其快速傳播提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、臨床樣品及主要試劑 糞腸球菌ATCC29212 和沙門氏菌H9812 由本實驗室保存；1 800份鼻拭子和肛門拭子于2011 年采集自廣東某大型豬場；藥敏試驗所用藥物均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、LA Taq DNA 聚合酶、S1 核酸酶和蛋白酶K 均購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒中量提取純化試劑盒購自德國Qiagen 公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit 試劑盒購自Roche 公司。

1.2 cfr基因陽性腸球菌的分離鑒定 將鼻腔和肛門拭子直接置于含6.5 % NaCl 營養(yǎng)肉湯中，45 ℃培養(yǎng)后，劃線于含10 mg/L 氟苯尼考的腸球菌鑒定培養(yǎng)基(疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂)，37 ℃過夜培養(yǎng)；挑取疑似克隆，提取全基因組，用23S rRNA通用引物對氟苯尼考低敏感菌進行鑒定。根據(jù)Gen-Bank 已發(fā)布的目的基因序列設(shè)計合成cfr 基因特異引物，(cfr-F 5'-TAAGAAGTAATAATGAGC-3'，cfr-R 5'-TATAGAAAGTCTACGAGG-3')，進行PCR 擴增，預(yù)期大小為518 bp，反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s、52.5 ℃30 s、72 ℃40 s，32 個循環(huán)；72 ℃5 min。

1.3 分離株親緣關(guān)系分析 參照文獻[5]的方法進行脈沖凝膠電泳(PFGE)分型，將過夜培養(yǎng)的細菌用低熔點的金膠灌模，300 mg/L 蛋白酶K 50 ℃消化24 h 直到膠塊變透亮，然后用SmaⅠ30 ℃作用3 h；脈沖凝膠電泳1 % SKG 低熔點膠，0.5×TBE 電泳液，電壓降6 V/cm，變換角度120，脈沖時間5 s～40 s 電泳18 h，Marker 為沙門氏菌H9812(XbaⅠ酶切)。電泳后用EB 染色，利用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖片并保存。PFGE 譜型判定標準參照文獻[6]的方法進行。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)測定 參照CLSI M31-A3[7]推薦的微量肉湯稀釋法測定臨床分離株對各受試藥物的MIC，質(zhì)控菌為糞腸球菌ATCC29212。

1.5 質(zhì)粒抽提及cfr基因的雜交定位 采用Qiagen Plasmid Midi 試劑盒提取cfr 基因陽性腸球菌質(zhì)粒，具體方法參照說明書進行(略有改進)。將提取的質(zhì)粒進行MegaBase 瓊脂糖凝膠電泳，并將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，利用地高辛標記的cfr 特異探針進行Southern 雜交，具體方法參見文獻[8]。

2 結(jié)果

2.1 氟苯尼考低敏感腸球菌篩查 從采集的1 800份樣品中共篩選出氟苯尼考低敏感腸球菌79 株，23S rRNA 鑒定結(jié)果顯示79 株腸球菌共分為6 種不同的腸球菌屬，其中cfr 基因陽性菌共28 株，包括糞腸球菌8 株，鉛黃腸球菌6 株，屎腸球菌4 株，鶉雞腸球菌10 株，cfr 基因在不同菌種腸球菌中的檢出率見表1。

表1 cfr 基因在不同菌種氟苯尼考低敏感腸球菌分離株中的檢出率Table 1 Detection of cfr gene among different Enterococcus spp.isolates

2.2 PFGE分析 利用PFGE 對28 株cfr 陽性腸球菌進行親緣關(guān)系分析，排除同一種屬腸球菌中的相同克隆(數(shù)據(jù)未提供)，最終分離到糞腸球菌3 株(3-1，B53-2 和D18-1)，鉛黃腸球菌(E2-1 和E3-1)和鶉雞腸球菌(E14-1 和M1-1)各2 株，屎腸球菌1 株(E4-1)。圖1 為8 株攜帶cfr 基因腸球菌的PFGE 譜型，結(jié)果顯示各個菌的PFGE 譜型完全不同，不同種屬間的譜型差別最大。

圖1 8 株cfr 基因陽性腸球菌的PFGE 圖譜Fig.1 PFGE profile of 8 Enterococcus spp.isolates carrying cfr gene

2.3 藥敏試驗結(jié)果 根據(jù)文獻[7]的判定標準，所有8 株分離株均為多重耐藥，對氟苯尼考、慶大霉素和紅霉素100%耐藥，對四環(huán)素的耐藥率達87.5%，對環(huán)丙沙星、利福平的耐藥率為75 %，對阿米卡星耐藥率50 %。盡管8 株菌對氨芐西林和萬古霉素的耐藥率較低，分別為12.5 %和0，但其中7 株菌(87.5 %)對萬古霉素敏感性降低(MIC 值：4 mg/L～16 mg/L)，表現(xiàn)中度耐藥(表2)。

表2 8 株腸球菌對9 種藥物的藥敏試驗結(jié)果Table 2 Antimicrobial susceptibility of 8 Enterococcus spp.isolates carrying cfr gene to 9 antibiotics

2.4 cfr基因的雜交定位 利用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取8 株cfr 基因陽性腸球菌的質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒進行MegaBase 瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果顯示，每個野生菌均攜帶3～5 個質(zhì)粒，質(zhì)粒的大小在2 kb～60 kb(圖2A)。用cfr 基因的特異探針進行Southern 雜交，結(jié)果顯示有6 株菌的cfr 基因定位于質(zhì)粒，質(zhì)粒大小略有不同在3-1 中cfr 基因位于約50 kb 的質(zhì)粒，在其余的5 株菌(D18-1，E2-1，E3-1，E4-1 和M1-1)中cfr 基因均定位于約40 kb 和20 kb的質(zhì)粒。而在B53-2 和E14-1 中，質(zhì)粒電泳條帶與cfr 探針無顯示雜交信號(圖2B)。

圖2 8 株cfr 基因陽性菌的質(zhì)粒電泳圖(A)及其與cfr 探針的雜交圖(B)Fig.2 Plasmids profiles(A)and Southern hybridization analysis of 8 cfr-carrying isolates with cfr probe(B)

3 討論

目前多數(shù)研究結(jié)果顯示，我國獸醫(yī)臨床攜帶cfr基因的菌株主要是葡萄球菌，也有少數(shù)其他攜帶cfr基因的細菌，如腸球菌、大腸桿菌和鏈球菌等[9]。劉洋等在2009 年調(diào)查了山東和北京兩地豬源和雞源腸球菌攜帶cfr 基因的情況，結(jié)果在453 株腸球菌中僅分離到1 株cfr 基因陽性菌，檢出率為0.2 %[10]。本研究從廣東豬場分離的79 株腸球菌中分離到28株cfr 陽性菌株，分離率為35.4 %，遠高于劉洋報道的。分析原因主要有以下兩個方面：(1)本實驗分離的79 株腸球菌均為氟苯尼考耐藥，而劉洋采用不加藥平板進行篩選，因此cfr 基因陽性腸球菌的分離率就會略低一些；(2)本實驗所選取的廣東某豬場用藥程度與劉洋所選取的北京和山東養(yǎng)殖場用藥程度不同。

藥物敏感性結(jié)果顯示，8 株cfr 基因陽性腸球菌均為多重耐藥，對臨床常用的藥物如氟苯尼考、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星和利福平等全部耐藥或表現(xiàn)較高的耐藥率，提示獸醫(yī)臨床在治療腸球菌引起的感染時應(yīng)減少使用這些藥物。由于獸醫(yī)臨床沒有腸球菌關(guān)于萬古霉素耐藥的判定標準，參照人醫(yī)標準MIC≥32 mg/L 判定為耐藥，本研究中的8 株菌對萬古霉素的MICs≤32 mg/L，與國內(nèi)其他的研究結(jié)果一致[11]。雖然，8 株分離株對萬古霉素的MIC 值未達到耐藥標準，但其中7 株菌對萬古霉素的MIC 在4 mg/L～6 mg/L，表現(xiàn)為萬古霉素中度耐藥，因此，應(yīng)該引起我們的高度重視。

雖然，本研究篩選到28 株攜帶cfr 基因的腸球菌，但PFGE 分型后僅鑒定到8 株不同譜型的腸球菌，表明攜帶cfr 基因的腸球菌在豬場內(nèi)存在克隆傳播現(xiàn)象。對cfr 基因的定位結(jié)果顯示，8 株分離株中，cfr 基因在6 株菌中均位于質(zhì)粒，表明質(zhì)粒可能是攜帶cfr 基因發(fā)生水平傳播的主要原因。

目前，腸球菌已是人醫(yī)和獸醫(yī)臨床感染分離率較高的細菌，并且耐藥的程度也較嚴重，更嚴重的是其作為“耐藥基因的儲庫”可將耐藥基因傳遞給其他致病菌，從而給臨床抗感染治療帶來困難。本研究從廣東某豬場分離到28 株攜帶cfr 基因的多重耐藥腸球菌，通過PFGE 和Southern 雜交初步證明cfr 基因的傳播方式主要是克隆傳播和質(zhì)粒介導的水平傳播，為臨床制定合理措施控制其快速傳播提供理論依據(jù)。

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