張樂天，楊萬蓮，鐘 承，王巨實(shí)，劉 蕾，王安琦，蘇 暢，呂艷麗

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100193)

犬偽狂犬病(Pseudorabies)是由偽狂犬病毒(PRV)引起的一種急性致死性疾病。PRV 屬于皰疹病毒科，皰疹病毒甲亞科，水痘病毒屬[1]。豬是該病毒的自然宿主，可帶毒長期存活。除靈長類的很多哺乳動物對該病毒易感，犬主要通過食入被病毒污染的生豬肉或內(nèi)臟而感染[2]。目前尚未見PRV 在犬之間相互傳播的報道。犬感染PRV 后潛伏期為3 d～9 d，并通常在表現(xiàn)臨床癥狀后的48 h 內(nèi)死亡[3]。

自2011 年以來，國內(nèi)許多地區(qū)的豬場暴發(fā)并流行豬偽狂犬病[4-5]，報道顯示近年已有PRV 分離株形成了相對獨(dú)立的分支，其在我國的流行可能與病毒的基因突變有關(guān)[6]。同時，北京及周邊地區(qū)疑似犬偽狂犬病的病例數(shù)目呈上升態(tài)勢，但目前國內(nèi)外尚無對犬感染PRV 的系統(tǒng)病理學(xué)研究。因此，本研究開展了人工感染PRV 犬的病理學(xué)觀察，為臨床診斷犬偽狂犬病提供依據(jù)，并為PRV 在非自然宿主的致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料樣品來源及實(shí)驗(yàn)動物 病料樣品為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院確診的一例死于食用生豬骨感染PRV 的約克夏犬，取病犬的大腦、小腦、腦干固定于10%中性緩沖福爾馬林溶液，與PBS 按1∶10 比例混合，研磨成組織勻漿，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?只健康并且免疫完全的比格犬購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，經(jīng)血清中和試驗(yàn)鑒定為PRV 陰性。

1.2 主要試劑 2×Taq PCR Master Mix 試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；鼠抗PRV gE 單克隆抗體(MAb)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院何偉勇副教授提供；山羊血清、PV-9002 小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒的分離和鑒定 利用實(shí)驗(yàn)室前期建立的PRV 特異性PCR 擴(kuò)增方法[7]，采用PRV 高度保守的gB 基因特異性引物，分別對大腦、小腦、腦干的組織進(jìn)行檢測。將腦干按常規(guī)方法包埋，制備成4 μm厚的石蠟切片；酒精脫水后用3 % H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，并采用10 %山羊血清孵育30 min 以阻斷一抗的非特異性結(jié)合；以PRV gE MAb 為一抗，按照PV-9002 小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行病毒的免疫組化鑒定。最后經(jīng)蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察。將腦干組織勻漿經(jīng)0.22 μm 濾器過濾后接種于單層VERO細(xì)胞以分離病毒。待觀察到細(xì)胞病變(CPE)后，將細(xì)胞培養(yǎng)物按照上述的方法進(jìn)行PCR 鑒定。

1.4 病毒分離株的TCID50的測定 病毒盲傳至出現(xiàn)CPE 后再連續(xù)傳3 代，并將病毒培養(yǎng)液的4 代～7 代10 倍倍比稀釋(10-1～10-10)，將其接種至單層VERO 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。按CPE 情況，利用Karber 法計(jì)算TCID50，即lgTCID50=最高稀釋度的對數(shù)-稀釋度對數(shù)間的差×(陽性孔比率總和-0.5)。

1.5 人工感染試驗(yàn) 將比格犬分為兩組，實(shí)驗(yàn)組為3 只(編號分別為1、2 和3)，對照組2 只(編號分別為4 和5)。實(shí)驗(yàn)組犬于頸背部皮下注射2 mL 含有2×106TCID50的PRV 培養(yǎng)液，對照組皮下注射2 mL DMEM。兩組犬分別飼養(yǎng)于相互隔絕的房間，每只犬飼養(yǎng)于獨(dú)立的犬籠。均飼喂商品化犬糧，每日早、晚測量體溫。在人工感染后的第0、2 d、4 d、6 d 靜脈采血，分離血清，利用全自動干式生化儀測量丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和肌酸激酶(CK)。

1.6 病理學(xué)觀察和免疫組化試驗(yàn) 動物死亡后立即進(jìn)行剖檢，分別取小腦、大腦、腦干、心、肺、肝、胰腺、胃、十二指腸、空腸、胸腺、脾、扁桃體、下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腎、膀胱、腎上腺固定于10 %中性緩沖福爾馬林溶液，并按常規(guī)程序制備成4 μm 厚的石蠟切片，經(jīng)HE 染色后在顯微鏡下觀察組織學(xué)病變，按照1.3 中的方法對各組織進(jìn)行免疫組化檢測，以定位PRV 抗原。

2 結(jié)果

2.1 臨床病例的PCR檢測和病毒分離 經(jīng)PRV 特異性PCR 擴(kuò)增，從患犬的腦干樣品中擴(kuò)增得到約370 bp 的DNA 片段，與預(yù)期相符(372 bp)，而大腦、小腦樣品擴(kuò)增結(jié)果均為陰性(圖1)。免疫組化檢測顯示，在患犬腦干的神經(jīng)元細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中發(fā)現(xiàn)棕色顆粒樣陽性信號(圖2)。將患犬腦干研磨液接種VERO 細(xì)胞后，盲傳至第4 代出現(xiàn)CPE。細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)PCR 擴(kuò)增獲得約370 bp 的目的片段(圖3)。對病毒進(jìn)行全序列測定，并將測序結(jié)果登錄至GenBank 中(KC981239)。結(jié)果顯示，該分離株與GenBank 中登錄的豬源PRV 的gE 基因核苷酸序列(KC415028)同源性為100 %[7]。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確診病犬死于PRV 感染，并將分離株命名為BJ-YT。

圖1 臨床病例組織樣品中PRV gB 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of PRV gB gene from tissue sample of the clinical case

圖2 臨床病例腦干免疫組化結(jié)果Fig.2 Immunoreactivity for PRV antigen in the brainstem of clinical case

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)物中PRV gB 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of PRV gB gene from cell culture

2.2 BJ-YT分離株的TCID50測定 對第4 代～7代細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行TCID50測定，結(jié)果顯示病毒連續(xù)傳代至第6 代后毒力穩(wěn)定，TCID50為10-6/mL。

2.3 人工感染犬的臨床癥狀和生化指標(biāo) 采用分離株BJ-YT 人工感染健康比格犬，感染后實(shí)驗(yàn)動物的潛伏期為4 d～7 d，并且感染犬在出現(xiàn)癥狀后24 h～36 h 內(nèi)死亡。所有感染犬均表現(xiàn)為精神沉郁、厭食、劇癢以及后期進(jìn)行性的呼吸急迫至呼吸困難?；既掷m(xù)抓撓注射部直至死亡，造成頸背部被毛脫落、充血、出血。感染犬的奇癢癥與發(fā)熱同時出現(xiàn)，發(fā)熱持續(xù)10 h～29 h，隨后體溫下降至正?；蚱?，之后死亡。另外3 號犬出現(xiàn)流涎，2 號犬出現(xiàn)血尿。所有實(shí)驗(yàn)組動物均有AST、AST/ALT 及CK 指標(biāo)的升高，但ALT 仍在正常范圍內(nèi)(圖4)。對照組動物均未見異常。

圖4 人工感染比格犬AST、AST/ALT、CK 變化水平Fig.4 The changes of AST,AST/ALT and CK in beagle dogs experimentally infected with the PRV BJ/YT isolate

2.4 人工感染犬的病理變化 1 號、3 號犬自然死亡，2 號犬于瀕死期實(shí)施安樂術(shù)。4、5 號犬于實(shí)驗(yàn)組動物死亡后進(jìn)行安樂術(shù)。3 號犬在頸部、背部和腿部出現(xiàn)水腫。所有實(shí)驗(yàn)組犬心臟的乳頭肌均有不同程度出血(圖5A，箭頭所示)。2、3 號犬心臟二尖瓣出血(圖5B)，1、3 號犬心臟二尖瓣可見血栓(圖5A)。另外2 號犬心外膜輕微出血，3 號犬冠狀溝出血(圖5C)。

實(shí)驗(yàn)組犬的肺臟均有不同程度的充血、出血斑(圖5D)，其中2 號犬氣管內(nèi)含有大量白色泡沫(圖5E)。

1、2 號犬胃粘膜廣泛性潮紅(圖5F)。所有實(shí)驗(yàn)組犬小腸均有大小不一的瘀點(diǎn)和瘀斑(5G)。病變向大腸逐漸減弱。

實(shí)驗(yàn)組犬胸腺彌漫性出血(圖5H)，1、2 號犬的脾臟表面有暗紅色的不規(guī)則凸起(圖4I)。所有感染犬的扁桃體、下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)均有不同程度的出血點(diǎn)和出血斑。

對照組犬各組織器官均未見異常。

圖5 人工攻毒比格犬的病理學(xué)變化Fig.5 Gross lesions of beagle dogs experimentally infected with PRV BJ/YT isolate

2.5 人工感染犬的組織病理學(xué)變化 所有實(shí)驗(yàn)組犬的腦干灰質(zhì)均出現(xiàn)了以輕微血管套(圖6A)、嗜神經(jīng)現(xiàn)象(圖6B)和膠質(zhì)細(xì)胞增生(圖6C)為特征的非化膿性腦炎。3 號犬小腦顆粒層有輕度出血(圖6D)。

所有感染犬均有心肌出血(圖6E)，2 號犬二尖瓣嚴(yán)重出血(圖6F)。

所有感染犬的肺均有不同程度的充血和出血(圖6G)，肝、胃、小腸輕度到中度的充血。

腎臟病變顯著，主要表現(xiàn)為急性非化膿性腎炎。所有實(shí)驗(yàn)組犬的腎間質(zhì)中度到嚴(yán)重充血，腎小囊擴(kuò)張，腎小囊和腎小管中聚集有多量嗜酸性物質(zhì)，但基膜尚完整(圖6H)。腎間質(zhì)中未見明顯白細(xì)胞浸潤。

所有感染犬的胸腺均嚴(yán)重出血(圖6I)和淋巴細(xì)胞排空。脾臟不同程度充血。扁桃體和淋巴結(jié)水腫，淋巴結(jié)不同程度排空(圖6J)，有輕度到中度的出血。

2 號和3 號犬腎上腺皮質(zhì)束狀帶有多灶性輕度到中度出血(圖6K)。

膀胱、胰腺未見異常。

2.6 人工感染犬免疫組化檢測結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)犬的腦干的神經(jīng)元胞質(zhì)中均有棕色顆粒樣的PRV 抗原陽性信號(圖6L)。其他組織均未檢測到抗原陽性信號。

3 討論

圖6 人工感染比格犬的組織病理變化和免疫組化結(jié)果Fig.6 Histopathological findings and immunostaining of beagle dogs experimental infected with PRV BJ/YT isolate

本研究中全身性廣泛出血是大體剖檢最主要的病理變化，這種全身性廣泛出血可引起病犬失血性休克。而心臟二尖瓣的血栓可能繼發(fā)于心臟瓣膜損傷和全身出血[8]，心臟尤其是心內(nèi)膜的出血和血栓，可導(dǎo)致心臟輸出功能下降，進(jìn)而引起心力衰竭。全身廣泛性出血及心臟損傷可能導(dǎo)致循環(huán)性休克從而引起脾的不完全收縮[8]，由此推測，循環(huán)衰竭可能是導(dǎo)致病犬急性死亡的重要原因。

組織病理學(xué)檢測顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織學(xué)病變主要集中在腦干，但病變程度在個體間存在差異。該現(xiàn)象與之前報道的PRV 感染非自然宿主[9-10]以及自然宿主一致。但本次人工感染試驗(yàn)的非化膿性腦炎程度輕微，可能與人工感染造成的發(fā)病急、病程短有關(guān)。有報道表明仔豬感染PRV 后可見腎臟有廣泛點(diǎn)狀出血[11]，本研究顯示PRV 可造成感染犬嚴(yán)重的急性腎小球腎炎，但機(jī)制尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中，所有的感染犬在后期均表現(xiàn)出進(jìn)行性的呼吸急促至困難，但在其肺臟中并未檢出病毒抗原和壞死現(xiàn)象，僅是輕度到中度的充血和輕度出血并不足以造成急性的呼吸系統(tǒng)癥狀。有研究表明PRV 感染大鼠脊髓的橫膈膜運(yùn)動神經(jīng)元以及延髓的呼吸中樞均未檢測到PRV 抗原[12]，因此PRV 造成非自然宿主的急性死亡并非源于呼吸衰竭。生化指標(biāo)中AST、AST/ALT 和CK 升高，但ALT 仍正常表明心臟存在損傷的可能，同時心臟的病變在本實(shí)驗(yàn)以及其他報道[2,13]中也相對明顯。因此感染犬的呼吸困難可能是繼發(fā)于心臟的損傷。

本研究顯示無論是自然還是人工感染致死的犬偽狂犬病例，幾乎均存在程度不一的胸腺出血現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)中還存在胸腺和淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的排空現(xiàn)象，但這種損傷對成年犬造成的危害有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)僅在腦干的神經(jīng)元中檢出病毒抗原，而其他病變顯著的內(nèi)臟器官和組織中卻未檢出病毒，表明這些病變并非由病毒直接引起。導(dǎo)致PRV 感染犬死亡的最終原因尚須進(jìn)一步研究。

[1]Pomeranz L E,Reynolds A E,Hengartner C J.Molecular biology of pseudorabies virus:Impact on neurovirology and veterinary medicine[J].Microbiol Mol Biol Rev,2005,69(3):462-500.

[2]Quiroga M I,Nieto J M,Sur J,et al.Diagnosis of aujeszky's disease virus infection in dogs by use of immunohistochemistry and in-situ hybridization[J].J Vet Med,1998,45:75-81.

[3]張樂天，陸梓杰，呂艷麗.犬偽狂犬病病毒致病機(jī)理研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34(6)：145-149.

[4]Wu Rui,Bai Chao-yong,Sun Jin-zhong,et al.Emergence of virulent pseudorabies virus infection in northern china[J].J Vet Sci,2013,14(3):363-365.

[5]Maresch C,Lange E,Teifke J P,et al.Oral immunization of wild boar and domestic pigs with attenuated live vaccine protects against pseudorabies virus infection[J].Vet Microbiol,2012,161(1-2):20-25.

[6]趙鴻遠(yuǎn)，彭金美，安同慶，等.豬偽狂犬病病毒變異株的分離鑒定及其gE 基因的分子特征[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2014，36(7)：506-509.

[7]鐘承，張樂天，王巨實(shí)，等.犬源偽狂犬病毒BJ/RD 株的分離鑒定及gE 基因分析[J].中國動物傳染病學(xué)報，2013，21(5)：1-6.

[8]Zachary J F,McGavin M D.Pathologic basis of veterinary disease[M].St Louis,US.:Elsevier Medicine,2011.

[9]Quiroga M I,Vazquez S,Lopez-pena M,et al.Experimental aujeszky's disease in blue foxes[J].J Vet,1995,42:649-657.

[10]Schoniger S,Klose K,Werner H,et al.Nonsuppurative encephalitis in a dog[J].Vet Pathol,2012,49(4):731-734.

[11]陳煥春，方六榮，何啟蓋，等.豬偽狂犬病病毒鄂a 株的分離鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1998，29(2)：97-104.

[12]Hoirimi T,Yasuhiro Y,Chieko K,et al.Mechanism of pruritus and peracute death in mice induced by pseudorabies virus(PRV)infection[J].J Vet Med Sci,1993,55:913-920.

[13]Cramer S D,Campbell G A,Njaa B L,et al.Pseudorabies virus infection in oklahoma hunting dogs[J].J Vet Diagn Invest,2011,23(5):915-923.