聶小倩 王艷艷 熊開和 黃應平 方艷芬

（三峽大學三峽地區(qū)地質(zhì)災害與生態(tài)環(huán)境湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北宜昌 443002）

制藥廢水具有排放量大、污染物種類繁多、有毒有機物含量高等特點.隨著水污染處理技術的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的處理技術，其中由于生物降解處理工業(yè)廢水中的有毒污染物效果明顯，現(xiàn)已成為降解有毒有機污染物主要方法之一［1］.篩選出對工業(yè)廢水中各類不同的有毒有機污染物均有較強降解能力的微生物，可以提高生物處理法對廢水中有毒類有機污染物的處理效果.利用微生物降解的方法處理含高濃度有機污染物的工業(yè)廢水具有處理成本低、經(jīng)濟效益好、無二次污染等優(yōu)點.因此研究高效降解微生物處理工業(yè)廢水具有重要的意義［2－5］.

本文研究對象為宜昌某制藥廠排放的制藥廢水以其廢水為碳、氮源，通過選擇性富集，馴化培養(yǎng)，劃線分離純化和篩選等方法，分別從三峽大學求索溪、三峽大學教師公寓旁池塘、三峽大學校醫(yī)院旁的池塘的活性污泥中分離得到降解能力最強的菌株.然后，進一步利用單因素優(yōu)化法得到該菌株降解制藥廢水的最適條件.

1 實驗材料及方法

1.1 菌種及制藥廢水來源

原始的菌種來自①三峽大學校醫(yī)院旁池塘的污泥；②三峽大學求索溪的污泥；③三峽大學教師公寓附近池塘的污泥.

制藥廢水：該廢水為農(nóng)藥制品所需原料（甘氨酸）車間排放的廢水，該廢水主要含有氯化銨和甘氨酸等初始原料，無色澄清透明、有刺鼻的氨水味道、廢水顯堿性，pH為9.0，COD為8 580mg／L，BOD5為2 360 mg／L，其兩者比值約為0.3，表明用微生物氧化處理要較好.取樣回來后，將廢水和污泥曝氣靜置24h，制藥廢水使用前用0.45μm濾膜過濾除菌.

1.2 實驗試劑

牛肉膏（BR）；蛋白胨（BR）；葡萄糖（AR）；KH2PO4（AR）；K2HPO4（AR）；無水CaCl2（AR）；MnSO4·H2O（AR）；NH4NO3（AR）；H2SO4（AR）.

1.3 實驗儀器

SW－CJ－2G型（名牌之星）雙人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司），電子分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司），高壓滅菌鍋，COD回流裝置，XTL光學顯微鏡（上海昌安電子科技有限公司），pHa－P數(shù)字式酸度計（梅特勒－托利多儀器上海有限公司），金怡智能生化培養(yǎng)箱（上海新菌醫(yī)療機械制造有限公司），PR－ZDYC－1水浴恒溫振蕩搖床（上海普瑞斯儀器有限公司），TG16－W型高速微量離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）.

1.4 實驗方法

1.4.1 微生物降解制藥廢水能力的測定

COD值反映了水體受還原性物質(zhì)污染的程度［6］.本實驗采用重鉻酸鉀法測定COD值［7］.

本實驗采用跟蹤COD值的方法來測定菌株培養(yǎng)過程中制藥廢水的COD，通過計算制藥廢水COD的降解率（%）來表示菌株對制藥廢水的降解能力.

式中，COD0為實驗前制藥廢水的COD值；CODn為實驗一定時間后制藥廢水的COD值.

1.4.2 菌株的富集

配制富集培養(yǎng)基［8］并調(diào)節(jié)pH至7.0，用紗布包扎好后置于高壓滅菌鍋中滅菌30min.待培養(yǎng)基冷卻后，將其分裝于250mL的錐形瓶中.每個錐形瓶中加入35mL富集培養(yǎng)基，再加入曝氣靜置24h的制藥廢水10mL，最后分別加入3處污泥各5mL（共計50 mL），置于搖床中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3d.

1.4.3 菌株的馴化

菌株的馴化分為3組：A制藥廢水和三峽大學求索溪污泥；B制藥廢水和三峽大學校醫(yī)院旁池塘污泥；C制藥廢水和三峽大學教師公寓旁池塘污泥；每組做3個平行樣.第1次馴化，在9個250mL的錐形瓶中分別分裝35mL已滅菌的無機鹽培養(yǎng)基［8］，加入5mL富集培養(yǎng)基.在無菌條件下將10mL制藥廢水分別加入到9個250mL的錐形瓶中，培養(yǎng)液組后總體積均為50mL.第2、3次馴化的無機鹽培養(yǎng)基體積分別為25mL和15mL，制藥廢水體積分別為20mL和30mL，總體積保持為50mL.以3d為一個周期，共進行3個周期的馴化，每個周期開始前及結(jié)束后，均測定每瓶培養(yǎng)液的COD值，再計算其降解率.每個周期后選對制藥廢水降解率最高的培養(yǎng)液作為下一次的馴化的接種源.

1.4.4 菌株的分離與純化

經(jīng)過了3個周期的馴化后，取制藥廢水降解率最高的培養(yǎng)液在含有制藥廢水的無機鹽平板上涂布（廢水與無機鹽培養(yǎng)液體積比為3∶2），倒置于恒溫培養(yǎng)箱30℃恒溫培養(yǎng).挑取單菌落于上述無機鹽平板上反復劃線分離，最終得到純的單菌落.將得到的純菌落用滅菌過的接種環(huán)接種于含有制藥廢水的牛肉膏蛋白胨［9］斜面上，4℃冰箱貯藏.

1.4.5 菌株的初步鑒定

觀察無機鹽平板上單菌落的菌落培養(yǎng)特征并記錄在冊.于無菌條件下，用接種環(huán)少量挑取單菌落涂玻片，進行美藍染色及革蘭氏染色［10］.于顯微鏡下觀察染色結(jié)果，初步鑒定菌株的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征.

1.4.6 菌株降解廢水的最適條件研究

取出貯藏的菌落，挑取菌落制成菌株懸液，在無菌的條件下將菌株懸液接種到混有制藥廢水的無機鹽培養(yǎng)液中，保持培養(yǎng)液總體積為50mL.采用單因素優(yōu)化法，即每次實驗確定一個因子為變量（底物體積分數(shù)，溫度和pH），其他的因子保持不變，在搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)3d后，測定COD值，計算其對制藥廢水的降解率，確定出最適的降解條件［11－12］.

1.4.7 制藥廢水在最適降解條件下的降解曲線

在最適條件下，以總體積的20%的接種量接入到已滅菌的無機鹽培養(yǎng)基中，置于搖床中恒溫振蕩培養(yǎng).每隔10h取一次培養(yǎng)液，測定其中的殘留COD，依據(jù)前后COD的變化來計算其降解率，繪制最適條件下的制藥廢水降解曲線［13］.

2 結(jié)果與討論

2.1 馴化結(jié)果

2.1.1 第1次馴化

取含有微生物的富集培養(yǎng)基5mL加入到含有10mL制藥廢水的培養(yǎng)液中（培養(yǎng)液總體積為50 mL），調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH為7.0，置于搖床中30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3d.測定培養(yǎng)前后培養(yǎng)液的COD值，計算微生物對廢水的降解率.3個樣點污泥中的微生物的第1次馴化結(jié)果見表1.

表1 第1次馴化結(jié)果

從表1中可以得出，3個取樣地點微生物對制藥廢水降解能力的強弱順序為：求索溪＞校醫(yī)院＞教師公寓.求索溪污泥中的微生物對廢水的降解能力最好，平均降解率可達到39.3%.因此，選取降解率最高的A2培養(yǎng)液作為第2次馴化的接種源.

2.1.2 第2次馴化

取5mL第1次馴化中的A2培養(yǎng)液進行第2次馴化，結(jié)果見表2.

表2 第2次馴化結(jié)果

通過表2可以看出，經(jīng)過第2次馴化后，微生物對廢水的平均降解率可達到65.5%.比較第1次馴化和第2次馴化結(jié)果可得出：經(jīng)過了兩次馴化后，求索溪底泥中的微生物對制藥廢水的降解率提高效果明顯，且增幅較大.

2.1.3 第3次馴化

取第2次馴化中降解率最高的制藥廢水的A2培養(yǎng)液進行第3次馴化，結(jié)果見表3.

表3 第3次馴化結(jié)果

通過表3可以看出，第3次馴化后的，求索溪污泥中的微生物對制藥廢水的平均降解率可達到78.0%，同前兩次相比依舊有較大幅度的提高.對第3次降解率最好的A2培養(yǎng)液進行一系列的劃線分離，篩選單一純種的菌株，以研究這個菌株對制藥廢水降解最好的效果下的最佳降解條件（最佳溫度、pH和底物體積分數(shù)）.

2.2 菌株的篩選

在整個馴化培養(yǎng)過程中，可以明顯的觀察到無機鹽培養(yǎng)液由原先澄清透明的狀態(tài)逐漸變得渾濁不清，而且溶液變?yōu)闇\棕色，有塊狀物懸浮在溶液表面，表明培養(yǎng)液中有微生物在生長.污泥經(jīng)過含有制藥廢水的富集培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)、含有制藥廢水的無機鹽培養(yǎng)基進行馴化、多次劃線分離和純化，最后在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（廢水與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液體積比為3∶2）上分離得到對制藥廢水具有極強降解能力的優(yōu)良菌株QA.

2.3 菌株的初步鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)特征

菌落形態(tài)符合細菌菌落的典型特征，其菌落濕潤、光滑、半透明、粘稠、易挑取、質(zhì)地均勻，以及菌落正反面或邊緣中心的顏色與中央部位的顏色一致，呈乳白色.其菌落大小為0.96cm.

2.3.2 菌體形態(tài)特征

菌體呈球狀，單個、成雙或多個聚集排列.

2.3.3 染色特征

其革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陰性.

2.4 菌株降解廢水的最優(yōu)條件研究

2.4.1 溫度對降解的影響

在無菌條件下，取5mL QA菌懸液接種到含有30mL制藥廢水的無機鹽培養(yǎng)液中（培養(yǎng)液總體積為50mL），調(diào)節(jié)pH為7.0.置于不同的溫度梯度（20、25、28、30、32、35和40℃）條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3d，每個溫度條件下做3個平行樣品.分別測定實驗前后培養(yǎng)液的COD，根據(jù)實驗前后的COD值得出QA菌株在不同溫度條件下對制藥廢水的降解率.實驗結(jié)果如圖1所示.

圖1 溫度對菌株降解廢水的影響

由圖1可知，20℃時QA菌株對制藥廢水的降解率為36.7%，隨著溫度的逐漸升高，降解率也在逐步升高.當溫度達到30℃時，降解率達到78.3%.當溫度繼續(xù)升高超過30℃時，廢水降解率逐漸下降，至40℃時，降解率下降到最低值26.9%.因此30℃是QA菌株降解制藥廢水的最佳降解溫度條件.這是因為微生物降解廢水涉及到生物體內(nèi)的一系列生物化學反應，而這些生物化學反應的進行是離不開生物酶的作用的.由于生物酶具有最適的反應溫度，在此溫度下生物酶的反應活性最高，因此當溫度低于最適溫度，酶的活性沒有完全激活，隨著溫度的逐漸上升，酶的活性逐漸提高.當溫度超過了最適溫度，生物酶就逐漸地失活、變性，其催化效率就下降了，相應的降解率也會逐漸下降［14］.

2.4.2 pH對降解的影響

在無菌條件下，取5mL QA菌懸液接種到含有30mL制藥廢水的無機鹽培養(yǎng)液中（培養(yǎng)液總體積為50mL），設置pH梯度為5、6、6.5、7、7.5、8、9.將培養(yǎng)液置于恒溫搖床30℃振蕩培養(yǎng)3d，每個pH條件下做3個平行樣品.分別測定實驗前后培養(yǎng)液的COD，根據(jù)實驗前后的COD值得出QA菌株在不同pH條件下對制藥廢水的降解率.實驗結(jié)果如圖2所示.

圖2 pH對菌株降解廢水的影響

由圖2可知，在pH為5時，廢水降解率為50.2%，當培養(yǎng)液pH為7時，廢水的降解率達到最大值79.1.在pH＝5～7范圍內(nèi)，QA菌株對制藥廢水的降解率隨著pH的升高而逐漸增大，pH為7時降解率最大.pH從7到9這個區(qū)間隨著pH升高，QA菌株對制藥廢水的降解率逐漸下降，至pH為9時，降解率降到了最低值42.8%.說明pH為7時是QA菌株對廢水的降解率的最優(yōu)條件.這是因為pH也是影響生物酶活性的一個重要因素.pH值的改變會影響生物酶活性中心的必須基團的解離程度，同時也影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結(jié)合和催化，當pH過小或過大時都會使酶蛋白變性而失活［15］.因此，pH為7時是此菌株的最適pH.

2.4.3 底物體積分數(shù)對降解的影響

在無菌條件下，取5mL QA菌懸液接種到含有制藥廢水（10、15、20、25、30、35、40mL）的無機鹽培養(yǎng)基中（培養(yǎng)液總體積為50mL），調(diào)節(jié)pH至7.0.此時培養(yǎng)液底物體積分數(shù)依次分別為200、300、400、500、600、700和800mL／L.將培養(yǎng)液置于搖床內(nèi)30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3d，每個底物體積分數(shù)條件做3個平行樣品.分別測定實驗前后培養(yǎng)液的COD，計算QA菌株在不同底物體積分數(shù)條件下對廢水的降解率.實驗結(jié)果見圖3.

圖3 底物體積分數(shù)對菌株降解廢水的影響

由圖3可知，在底物體積分數(shù)從200mL／L逐漸增大到600mL／L的過程中，QA菌株對制藥廢水的降解率也在逐漸增大，從200mL／L時的38.1%增大到了600mL／L的77.7%.當?shù)孜矬w積分數(shù)超過了600mL／L后，QA菌株對制藥廢水的降解率急劇的下降.至800mL／L時，廢水的降解率為1.2%，幾乎為零.因此，制藥廢水體積分數(shù)在600mL／L時是QA菌株的最適底物體積分數(shù).當廢水體積分數(shù)超過最適體積分數(shù)后，廢水對QA菌株降解的影響很大，這可能與菌株的生長繁殖受到廢水中各種高含量物質(zhì)的影響有關［16］.

2.4.4 制藥廢水降解曲線

由上述最適降解條件實驗結(jié)果可知，30℃，pH為7.0、底物體積分數(shù)600mL／L，是QA菌株對制藥廢水的降解的最適條件，菌株對廢水的降解效果好.因此在30℃、pH為7.0、底物體積分數(shù)為600mL／L的實驗條件下，測定QA菌株制藥廢水的降解曲線.每隔10h測定培養(yǎng)液的COD值.QA菌株對制藥廢水降解率隨時間的變化結(jié)果如圖4所示.

圖4 最適條件下制藥廢水降解曲線

由圖4可以看出，在QA菌株降解制藥廢水的最適條件下，培養(yǎng)的前30h，廢水的降解率不到5.0%，而且基本保持不變.這是由于剛剛接入到制藥廢水的QA菌株需要先適應新環(huán)境，即進入微生物的停滯期［17］.從30h到70h，QA菌株對廢水的降解率越來越大，曲線的斜率也越來越大，至70h時，對廢水的降解率達到了77.3%.因此，30h到70h之間是QA菌株生長速率最快、代謝最為旺盛、酶系統(tǒng)最為活躍、細菌數(shù)量最多的對數(shù)生長期.70h至90h間，QA菌株對制藥廢水的降解率基本維持穩(wěn)定，變化幅度很小，即此時QA菌株進入到了穩(wěn)定期.此階段微生物細胞代謝產(chǎn)物積累達到了最高峰，營養(yǎng)物比例失調(diào)、有毒有害代謝產(chǎn)物積累、pH等理化指標已不適宜微生物生長.如果繼續(xù)培養(yǎng)，其生存環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利、細胞的分解代謝大于合成代謝，最終會導致大量細菌死亡.因此，在QA菌株降解制藥廢水的最適條件下，想讓QA菌株降解某制藥廠廢水效果達到最佳，最好的時長是70h.

3 結(jié) 論

本文采用了微生物目標菌株篩選的經(jīng)典方法，即選擇性富集、多次馴化培養(yǎng)、劃線分離與純化得到目的菌株，最后對目的菌株進行鑒定和描述，以及研究其最佳降解條件.實驗結(jié)果表明從求索溪污泥中篩選出的QA菌株對制藥污水的降解能力最強，最佳降解條件為：溫度為30℃、pH為7，底物體積分數(shù)為600 mL／L，其最終降解率為78.6%（80h時），該降解能力比較強，但還可以對QA菌株進行誘變處理，以進一步提高其降解能力.

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