蔡英敏 胡海濤 馬小亞 宋金鑫 王美納

（西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院麻醉科，西安710004）

參芪扶正注射液對老齡大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用※

蔡英敏 胡海濤 馬小亞 宋金鑫 王美納

（西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院麻醉科，西安710004）

目的研究參芪扶正注射液對老齡大鼠腦缺血損傷后的保護作用。方法老年雄性SD大鼠，體重200～300g，隨機分為模型組、假手術(shù)組、陽性對照組和參芪扶正注射液組。用大腦中動脈線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，參芪扶正注射液在缺血前一周靜脈給藥，觀察缺血3h再灌3h后對大鼠神經(jīng)功能障礙、腦梗塞范圍、血清乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK）活性、腦組織鈣、水、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。結(jié)果實驗發(fā)現(xiàn)，參芪組大鼠能明顯改善神經(jīng)功能缺陷，減少腦組織含水量，縮小腦梗塞范圍，抑制Ca2＋聚集，血清中乳酸脫氫酶、肌酸激酶及腦組織中丙二醛含量明顯低于模型組，腦組織中超氧化物歧化酶活性明顯高于模型組。結(jié)論參芪扶正注射液對老齡大鼠腦缺血損傷有保護作用，其機制可能與清除氧自由基抑制腦組織Ca2＋聚集有關(guān)。

參芪扶正注射液；腦缺血；氧自由基；中醫(yī)藥實驗

隨著中國人口逐漸老齡化，許多老年性疾病，如老年性癡呆、腦中風等越來越受到人們的關(guān)注，但截止目前此類疾病仍沒有一種十分有效的治療方法。參芪扶正注射液是傳統(tǒng)扶正補益中藥黃芪、黨參提取物，它的研究大多集中在提高腫瘤患者免疫力方面，而對于腦缺血及其后遺癥治療方面的報道較少。本研究采用改良Longa［1］法制成大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，從功能、組織學、生物化學角度觀察參芪扶正注射液對老齡大鼠腦缺血再灌注損傷后的保護作用，并初步探討它的作用機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物20～22月齡，SD老年大鼠，體重200～300g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2主要儀器與藥品雙極電凝購自上海醫(yī)療器械六廠，氯胺酮由上海第一制藥廠提供，參芪扶正注射液由麗株利民制藥廠提供，尼莫地平購自天津氨基酸公司。

1.3動物模型采用改良Longa法，大鼠腹腔注射氯胺酮100mg·kg－1麻醉。將大鼠仰臥定于臺板上，頸部正中切口，顯微鏡下分離左頸總動脈（CCA）及其分叉處，游離頸外動脈（ECA），并電凝切斷ECA發(fā)出的動脈分支。再向頭端游離ECA，用5－0絲線結(jié)扎ECA遠端，在靠近遠端結(jié)扎線處剪斷ECA，取一根長5cm的4～0單絲尼龍線，頭端加熱成鼓錘狀，置入ECA中，用絲線扎緊以免出血，將尼龍絲由ECA緩慢插入頸內(nèi)動脈（ICA），調(diào)整方向?qū)⑺ㄈ€插進顱腔，感到阻力時即達大腦前動脈（ACA），從ICA起始處算起，插入深度一般為20～21mm，此時大腦中動脈（MCA）起始處阻斷，同時也阻斷了來自ICA、ACA、PCA的側(cè)副血流，導致MCA區(qū)局部缺血。然后扎緊ECA殘端絲線以免滑脫，縫合切口，引出尼龍線于皮膚切口處，回籠飼養(yǎng)。缺血3h后，在無麻醉狀態(tài)下輕輕拔出尼龍線恢復血流，拔線時感到阻力即停止，絲線頭端已退回到ECA殘端內(nèi)，此時制成缺血再灌注模型。再灌3h后，按實驗要求進行觀察取樣。假手術(shù)組僅將尼龍線放入ECA，不進入ICA，其它操作相同。手術(shù)過程觀察呼吸節(jié)律，用加熱燈保持大鼠體溫37± 0.5℃（肛溫），應無出血、無呼吸困難，動脈色澤正常。

1.4實驗分組模型組和假手術(shù)組：尾靜脈注入生理鹽水一周；尼莫地平陽性對照組：尾靜脈注入尼莫地平1 mg／kg一周；參芪組：尾靜脈注入?yún)④畏稣⑸湟?0ml／kg一周（按照大鼠每公斤體重藥量是人類的10倍進行換算，每250ml中含黨參、黃芪各10g）。

1.5神經(jīng)癥狀的觀察參考Longa的方法在缺血3h再灌3h末進行5分制評分。評分標準：0分：無明顯神經(jīng)缺損癥狀；1分：不能完全伸展前爪；2分：行走時，身體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時向右側(cè)傾倒；4分：不能自行行走，意識消失。

1.6腦梗塞范圍的測定評分后大鼠斷頭取全腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，用雙面刀片將大腦沿冠狀面切成厚度基本相同的6片，放入1%TTC染色液中，37℃水浴中溫育30min，正常組織呈紅色，梗塞組織呈白色。再將腦片置10%甲醛中固定，仔細分離出梗塞區(qū)腦組織，并稱取梗塞腦組織及全腦重量，以梗塞組織重量占全腦重量的百分比作為梗塞范圍。并按下式計算給藥組腦梗塞范圍的抑制率：

抑制率（%）＝（1－給藥組梗塞范圍／缺血再灌注組梗塞范圍）×100%

1.7腦組織含水量及Ca2＋的測定按Gotoh等［2］方法，于缺血3h再灌3h末快速剝?nèi)∈竽X，切取梗塞側(cè)半球前半部分的腦組織稱其濕重，再置于105℃烤箱中烘烤48 h，稱干重。按下式計算腦組織含水量：

腦含水量（%）＝（濕重－干重）／濕重×100%

用濃硫酸消化法消化腦組織干樣，加1%LaO－0.5mol·L－1HCL去離子水溶液定容，原子吸收光譜法測定腦組織Ca2＋含量。

1.8血清乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK）測定

再灌6h后，眼眶取血，分離血清，用比色法在λ440nm處測定LDH活性，單位定義：以100ml血清中在37℃與基質(zhì)作用15min，能生成1μmol丙酮酸即為一個LDH活力單位。用肌酸顯色法在λ520nm處測定CK，單位定義：每升血清在37℃與基質(zhì)作用，每分鐘產(chǎn)生1μmol肌酸稱為一個CK活力單位。

1.9大鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量測定取上述梗塞側(cè)半球后半部分腦組織，用冰冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙拭干后稱重，量取腦組織重量9倍體積的冰冷生理鹽水，在內(nèi)切式勻漿器上制成100g·L－1的勻漿。離心20min（1500r·min－1），取上清液用TBA反應比色法在λ532nm處測定MDA含量，結(jié)果以nmol·g－1protein表示。用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性，420nm控制鄰苯三酚自氧化速率為0.03OD／分，單位定義在：1ml反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量為一個活力單位，結(jié)果以U·mg－1qrotein表示。用考馬斯亮藍法測定腦勻漿蛋白質(zhì)含量（mg·ml－1）。

1.10統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)用表示，組間差異比較計量?資料用F分析和t檢驗，計數(shù)資料用四格表確切概率法檢驗，P＜0．05為顯著性標準。

2 結(jié)果

2.1參芪扶正注射液對大鼠行為缺陷程度的影響缺血再灌注組所有大鼠出現(xiàn)運動障礙，主要表現(xiàn)為右前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，提尾懸空時，右前肢緊貼胸壁。參芪組能顯著改善大鼠神經(jīng)運動功能障礙，其行為評分與缺血再灌注對照組比較差異具有非常顯著意義（P＜0.01）結(jié)果見表1。

表1 參芪扶正注射液對大鼠行為缺陷程度的影響

表1 參芪扶正注射液對大鼠行為缺陷程度的影響

注：**P＜0．01與缺血再灌注組比較

分組劑量（mg·kg－1）神經(jīng)功能評分（分）假手術(shù)組－0缺血再灌組－2．13＋0．38參芪組1．6 0．85＋0．32**尼莫地平組0．5 0．60＋0．52**

2.2參芪扶正注射液對腦梗塞范圍的影響結(jié)果見表2。

表2 參芪扶正注射液對腦梗塞范圍的影響

表2 參芪扶正注射液對腦梗塞范圍的影響

－1分組劑量（mg·kg）梗塞范圍（%）抑制率（%）缺血再灌組19．72＋3．88參芪組1．6 12．22＋4．63**31．8尼莫地平組0．5 9．27＋4．36**－48．3

由表2可見，與缺血再灌組相比，參芪組可顯著縮小腦梗塞范圍（P＜0.01）。

2.3參芪扶正注射液對腦組織含水量的影響結(jié)果見表3。

表3 參芪扶正注射液對腦組織含水量的影響（x±s，n＝10）

由表2可見，缺血再灌組腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），與缺血再灌組相比，參芪扶正注射液能明顯減少再灌組腦組織含水量。

2.4參芪扶正注射液對腦組織Ca2＋含量的影響結(jié)果見表4。

表4 參芪扶正注射液對腦組織Ca2＋含量的影響（x±s，n＝10）

由表4可見，缺血再灌組腦組織Ca2＋含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），參芪扶正注射液能明顯減少腦組織Ca2＋含量。

2．5參芪扶正注射液對血清LDH和K的影響見表5。

表5 參芪扶正注射液對血清LDH和CK的影響（x±s）

與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組外周血LDH和CK活力顯著增高（P＜0.01）。參芪扶正注射液可明顯抑制血清中LDH和CK活性增長。

2．6參芪扶正注射液對腦組織中SOD活性和MDA含量的影響見表6。

表6 參芪扶正注射液對腦SOD活性和MDA含量的影響

表6 參芪扶正注射液對腦SOD活性和MDA含量的影響

注：△P＜0.01，與假手術(shù)組比較；*P＜0.05，**P＜0.01與缺血再灌注組比較

12缺血再灌組－0．78＋0．21△120．21＋45．16△參芪組1．6 1．39＋0．72*60．41＋13．81*尼莫地平組1 1．49＋0．16**86．12＋46．01 rotein假手術(shù)組－1．78＋0．84 76．01＋29．分組劑量／mg·kg－1SOD／U·mg－1protein MDA／nmol·g－1p *

與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組腦內(nèi)SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增高（P＜0.01），參芪扶正注射液可明顯增加腦內(nèi)SOD活性，抑制MDA含量（P＜0.05）。

3 討論

腦缺血損傷可以誘發(fā)癡呆［3］。由于血流障礙，引起慢性腦組織缺血，使皮質(zhì)細胞減少，大量的神經(jīng)元纖維變性退化，神經(jīng)細胞退行性病變，大腦半球的白質(zhì)發(fā)生彌漫性脫髓鞘病變，最終使大腦功能全面衰退。

建立重復性好、敏感性高、梗塞部位恒定的活體腦缺血動物模型是研究缺血性腦血管病的病理生理變化和評價藥物對缺血性腦血管疾病的防治效果的重要前提。大鼠具有與人類相似的腦血管解剖結(jié)構(gòu)和功能、種系內(nèi)純合性好、價廉易得等優(yōu)點，因而被廣泛用作腦缺血的實驗動物模型。局部腦缺血模型一般采用大腦中動脈阻斷法，該法是目前最為普遍接受的篩選和評價藥物抗腦缺血作用的模型之一。本文采用可逆性大腦中動脈線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。較好模擬了人類缺血性腦病的永久性及暫時性局灶性腦缺血的各種狀態(tài)，對評價再灌注的作用及藥物療效更有說服力。

氯化三苯基四氮唑（TTC）組化染色技術(shù)是一種確定梗塞范圍的常用方法，本研究所制作的大鼠缺血再灌注模型為缺血3h，再灌注3h，用TTC染色所測定的梗塞范圍為（19.72＋3.88）%，而參芪組的梗塞范圍為（12.22＋4.63）%。與缺血再灌注組比較，參芪可顯著縮小梗塞范圍（P＜0.01），以縮小梗塞灶周圍區(qū)即額頂皮層邊緣部為主。說明參芪扶正注射液對局灶性腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用。

腦水腫是腦缺血不可避免的后果，它明顯影響死亡率和致殘率。由于缺血缺氧，腦細胞能量代謝紊亂，胞內(nèi)Na＋、水潴留，細胞膜損害，胞內(nèi)液體異常增加；同時缺氧后大量自由基的產(chǎn)生，誘發(fā)腦血管上皮的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應，引起血腦屏障破壞，通透性增加，血漿成分漏入細胞外間隔，引發(fā)腦水腫。［4］結(jié)果顯示參芪組能明顯減少梗塞側(cè)腦組織的腫脹程度，減少患側(cè)腦組織含水量。說明參芪扶正注射液對上述病理過程有抑制作用。

中醫(yī)學認為，患者臟腑氣虛，髓海不足，氣血失和，氣機升降失調(diào)，水津失于運化，疾濁瘀血交結(jié)。其基本病位在腦，其本在于心、脾、肝、腎的功能失調(diào)，其標在于瘀血痰濁蒙蔽清竅，而致神機失統(tǒng)，其病機屬本虛標實，虛實夾雜，氣虛血瘀是缺血性損傷發(fā)生的主要病理基礎。［5］參芪扶正注射液是選用黃芪、黨參為原料制成的中藥注射液，具有補氣升陽、益氣扶正、補脾益腎之功效。其中黨參具有健脾益氣，生津養(yǎng)血的作用，中醫(yī)認為脾為后天之本，氣血生化之源，生氣化血可達到養(yǎng)心安神之效，神志安則智慧增。研究發(fā)現(xiàn)黨參對小鼠的記憶作用有非常大的影響。而黃芪則為補氣藥之長，有健脾益氣，補氣還陽之效，補力較強，補氣作用全面?，F(xiàn)代藥理研究證實，黨參和黃芪均具有擴血管，降血壓，增加人體免疫的功效，同時還具有激活和恢復紅細胞變形能力，改善微循環(huán)的作用。黨參和黃芪合用，可明顯增強黨參健脾的功能，由于脾為氣血生化之源，脾健則氣血充，從而腦健神明［6］。

腦缺血再灌注損傷時，由于缺血、缺氧導致乳酸酸中毒，細胞膜及毛細血管通透性增加，甚至膜損傷，大量蛋白酶外釋。細胞內(nèi)LDH和腦型肌酸激酶釋放至細胞外液，進入腦脊液和血液，導致腦組織LDH和CK活性降低，血清中酶的活性增高，并且血清LDH、CK活性增高程度與損傷范圍及損傷程度相一致。氧自由基的生成及其引起的脂質(zhì)過氧化是缺血再灌注損傷的重要機制之一。腦缺血再灌注時，細胞內(nèi)鈣超載，大量游離脂肪酸及興奮性氨基酸增加，激活自由基連鎖反應，產(chǎn)生大量自由基。丙二醛是自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應的代謝產(chǎn)物，其含量的變化可間接反映組織中氧自由基的變化。［7］結(jié)果表明，腦缺血3h，再灌注3h時，腦組織SOD活性明顯下降，MDA含量明顯增加，間接證實缺血再灌注時產(chǎn)生大量的氧自由基及脂質(zhì)過氧化物。參芪扶正注射液缺氧前給藥可提高腦組織SOD活性，有利于清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化損傷，使MDA含量減少。這與文獻報道黃芪可提高SOD活性，從而減輕自由基造成的損傷［8］的結(jié)果是一致的。

綜上所述，自由基損傷在急性腦血管病，尤其是腦缺血中起到致關(guān)重要的作用，因此研究和應用有效的清除自由基的藥物，是腦保護的重要環(huán)節(jié)之一［9］，參芪扶正注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與抑制腦組織Ca2＋聚集及抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。為其在腦血管方面的用途開辟一條新的途徑。對其作用和臨床實驗還有待于進一步的研究。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20（1）；84－91．

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［3］心敬，胡穎新，胡常林．血管性癡呆研究進展［J］．中國臨床康復，2006，6（7）：978-979．

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［5］王發(fā)渭，姜楠．血管性癡呆患者應用參龍湯改善神經(jīng)功能缺損的臨床研究［J］．中國臨床康復，2005，8（4）：679-681．

［6］宮旭海，楊鳳民，何小花，等．參芪扶正注射液治療血管性癡呆的療效觀察［J］．中國臨床醫(yī)生，2009，32（6）：357．

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The Pr ot ec tiv e Ef f ec ts o f Senqi Fuz heng Inje c tion Against Is c hemia-r e p er f usion Inju r y in Ol d Rat Br ain s

Cai Yingmin Hu Haitao M a Xiaoya Song Jinxin Wang M eina
（The anesthesiology department of the second affiliated hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，710004，China）

ObjectiveTo study the protective effects of Senqi Fuzheng Injection against ischemia－reperfusion injury in old rat brains．MethodsHealthy and old SD male mice，weight 200～300g，they were divided randomly into 4 groups：model group，control group，nimodipine group and Senqi Fuzheng Injection group．There were 10 in each group．Modified Longa model of focal cerebral ischemia-reperfusion injury was used．Senqi Fuzheng Injection was administered I．P．one week before ischemia，Nervous function，brain infarction area，serum lactate dehydrogenase（LDH）and creatine kinase（CK）levels，brain Ca2＋，water，MDA and SOD levels were observed after 3h ischemia and 3h reperfusion．ResultsSenqi Fuzheng Injection could improve nervous of rats，decreased water content of brain，decreased the infarction area of brain，inhibited Ca2＋，LDH、CK levels in serum and MDA in brain were lower in Senqi Fuzheng Injection group than in model group，SOD activity in Senqi Fuzheng Injection group was higher than in model group．ConclusionSenqi Fuzheng Injection has protective effect against cerebral ischemia－reperfusion injury in old rats．Inhibition of lipid peroxidation and Ca2＋may be the mechanism．

Senqi Fuzheng Injection；Brain ischemia；Lipid peroxidation；Traditional Chinese medicine experiment

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.07.103

：1672-2779（2014）-07-0147-03

蘇 玲 本文校對：張蓬勃

2013-12-21）

國家自然科學基金［No：30070731］；國家重點臨床?？平ㄔO單位項目；陜西省科技攻關(guān)項目［No：2003K10-G86］