田文霞，王 穎，喻 進(jìn)，盧曉曉，寧官保，高文偉，趙宇軍，高榮琨，閆 芳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

馬立克?。∕arek＇s disease，MD）是由皰疹病毒科的馬立克病病毒（Marek＇s disease virus，MDV）引起的雞惡性腫瘤性疾病，以淋巴細(xì)胞組織增生，各內(nèi)臟器官、外周神經(jīng)、肌肉、性腺、虹膜、皮膚中單核細(xì)胞浸潤及腫瘤為特征［1］。該病具傳染性，于1907年首次報(bào)道。馬立克病一直是引起雞生長障礙和死亡的主要疾病之一，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，全球每年由于MD所付出的代價(jià)是10億美元～20億美元［2］，疫苗的使用使雞馬立克病得到了明顯控制，但是由于病毒變異株和強(qiáng)毒株的不斷出現(xiàn)，即使正常免疫雞群，馬立克病也時(shí)有發(fā)生［3］。

研究表明，馬立克病是一個(gè)經(jīng)典的多因素影響的疾病，其表現(xiàn)為諸如宿主、病原和環(huán)境管理等一系列復(fù)雜因素共同作用的結(jié)果，而這種復(fù)雜性必然對(duì)其防控及其病毒毒力的進(jìn)化產(chǎn)生巨大影響。在宿主方面，出殼時(shí)特異性母源抗體及雛雞的疫苗接種狀況是主要決定因素。國內(nèi)外對(duì)MD疫苗研制、疫苗免疫機(jī)理及其免疫效果等已做了廣泛研究，也相繼研制出致弱疫苗、自然弱毒苗及火雞皰疹病毒苗［4］，其中CVI988疫苗免疫效果好，應(yīng)用最多，其在接種后3d～4d就已經(jīng)出現(xiàn)免疫效應(yīng)［5］。迄今為止，MD疫苗免疫機(jī)理研究雖仍不清楚，但馬立克病疫苗免疫保護(hù)作用屬于免疫學(xué)范疇［6］。Schat研究指出，雞接種馬立克病疫苗后出現(xiàn)的一系列反應(yīng)與其病毒Ⅰ型毒株的致病機(jī)理相似，但并不造成免疫抑制。然而，免疫保護(hù)并不是百分之百有效，免疫失敗情況時(shí)常發(fā)生［7-8］。究其原因，除病毒變異、疫苗病毒血清型與流行的MD病毒不相同外，還可能與疫苗保存方式、使用時(shí)稀釋度等因素密切相關(guān)。

近年來，人們對(duì)于如何提高M(jìn)D疫苗的免疫效果進(jìn)行了大量的研究，但主要集中在疫苗免疫部位和免疫途徑，關(guān)于疫苗本身對(duì)機(jī)體的影響研究較少。本試驗(yàn)研究馬立克病病毒強(qiáng)毒感染和疫苗免疫雞組織病理學(xué)變化，通過對(duì)不同時(shí)期組織器官病理學(xué)觀察，比較馬立克病CVI988疫苗在產(chǎn)生免疫力的同時(shí)是否有毒性，為提高疫苗的安全性、減少免疫失敗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 108只1日齡海蘭褐公雛雞為山西第一種雞場（康牧禽業(yè)）提供。

1.1.2 馬立克病毒 馬立克病毒強(qiáng)毒京-1株血毒（LD50＝3.48）為北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所產(chǎn)品（批號(hào)：200806），液氮中保存。

1.1.3 疫苗 CVI988疫苗（批號(hào)：JD298），液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)雞分組、攻毒、飼養(yǎng) 將108只1日齡公雛雞隨機(jī)分為3組，每組36只。空白對(duì)照組（C組）腹腔注射0.2mL滅菌 Hank′s液；攻毒組（V組）將馬立克病毒強(qiáng)毒京-1株血毒用滅菌 Hank′s液稀釋20倍，每只雞腹腔注射0.2mL［9］；疫苗免疫組（IA組）每只雞腹腔注射CVI988馬立克氏病疫苗0.2mL。

1.2.2 樣品采集 分別于接種3、6、10、15、20、26、35、45、60d［10］后，每組各取4只雞稱重后剖檢，并分別取肺臟、胸腺、骨骼肌、腎臟、睪丸、肝臟、心肌、腺胃、盲腸扁桃體、脾臟、法氏囊、骨髓、坐骨神經(jīng)等組織于100mL/L中性福爾馬林固定。

1.2.3 組織切片的HE染色與觀察 各組織器官經(jīng)梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，再經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精下行至蒸餾水，用蘇木精染色5min，5mL/L鹽酸酒精分化，水洗，藍(lán)化30s，伊紅染色2min，梯度酒精脫水，樹膠封片，光鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)雞剖檢觀察

攻毒后早期未見異常變化，攻毒組雞26d時(shí)，剖檢可見腺胃乳頭腫大，睪丸腫大，腎臟稍腫大（圖1A、圖1B和圖1C）；35d時(shí)，除睪丸腫大，肝臟稍腫大外，法氏囊和胸腺萎縮，有的甚至退化（圖1D）；45d后，有雞只出現(xiàn)馬立克病典型病變，一側(cè)坐骨神經(jīng)增粗，肝臟有腫瘤結(jié)節(jié)（圖1E，圖1F）；疫苗免疫組和對(duì)照組無可見的病理變化。

圖1 攻毒組雞臨床剖檢特征Fig.1 Characteristics of clinical anatomy in chickens challenged with Jing-1MDV strain

2.2 組織病理學(xué)觀察

2.2.1 攻毒雞組織病理學(xué)觀察 攻毒后對(duì)雞群在不同階段進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，結(jié)果顯示，胸腺在接種15d～60d時(shí)皮、髓質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，呈空泡狀的網(wǎng)狀細(xì)胞增加，皮、髓質(zhì)界限不清，胸腺小體消失，且彌散性分布多量形態(tài)不一的腫瘤細(xì)胞。

法氏囊在接種15d～60d時(shí)淋巴濾泡間的淋巴細(xì)胞逐漸增多，濾泡萎縮，濾泡皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)淋巴細(xì)胞減少；濾泡中淋巴細(xì)胞稀疏，濾泡體積小，濾泡間成纖維細(xì)胞多（圖2A）。

病毒接種6d后，脾臟動(dòng)脈周圍淋巴鞘、淋巴小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞減少，動(dòng)脈血管內(nèi)皮增生，肌層結(jié)構(gòu)不清；接種20d～60d時(shí)逐漸出現(xiàn)紅髓大量淋巴細(xì)胞浸潤、白髓淋巴細(xì)胞減少、脾小結(jié)不明顯、白髓紅髓界限不明顯，出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化（圖2B）。

肝細(xì)胞在病毒接種6d后顆粒變性，靜脈周圍有中小淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞浸潤，小葉內(nèi)出現(xiàn)局灶性增生；隨后肝小葉呈局部絲網(wǎng)狀，肝細(xì)胞索排列零亂，增生的淋巴細(xì)胞有核分裂相；接種45d后，肝索消失，肝細(xì)胞變性、壞死、甚至萎縮消失，淋巴細(xì)胞大量集聚，出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞集聚灶。腫瘤細(xì)胞為大、中、小淋巴細(xì)胞，伴有出血，可見馬立克細(xì)胞（圖2C）。

腎臟在接種病毒15d時(shí)，腎小管間有少量淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞，血管內(nèi)有大量紅細(xì)胞，并有大量圍管性增生的腫瘤細(xì)胞。腎小管局部壞死，聚集不同形態(tài)的增生淋巴細(xì)胞，增生灶內(nèi)出現(xiàn)少量網(wǎng)狀細(xì)胞，并見馬立克細(xì)胞。

從15d開始相繼在骨骼肌和心肌肌纖維間有淋巴細(xì)胞呈浸潤性增生（圖2D）。

腺胃在15d時(shí)出現(xiàn)增生的淋巴細(xì)胞，26d時(shí)出現(xiàn)彌漫性細(xì)胞浸潤，且隨著時(shí)間的推移，逐漸由彌漫性細(xì)胞浸潤向局灶性細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)變（圖2E）。

神經(jīng)組織在接種35d時(shí)神經(jīng)纖維間水腫液內(nèi)散在中小淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞，局灶性增生，其中有馬立克細(xì)胞（圖2F）。

圖2 攻毒組雞各組織器官組織學(xué)特征（400×）Fig.2 Histologic characteristics of different organs in chickens challenged with Jing-1MDV strain（400×）

2.2.2 疫苗免疫雞組織病理學(xué)觀察 疫苗接種3d后，機(jī)體的免疫器官特別是脾臟與對(duì)照組相比有明顯差異。脾臟在3d～10d出現(xiàn)了明顯的淋巴細(xì)胞增多，15d～35d動(dòng)脈周圍淋巴鞘脾小結(jié)增多明顯；法氏囊出現(xiàn)淋巴細(xì)胞增多；6d～10d時(shí)胸腺組織變化明顯，胸腺小體淋巴細(xì)胞增多；但26d后其他組織也與攻毒組相似有明顯的淋巴細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)明顯的免疫器官損傷與組織器官病變（圖3A，圖3B和圖3C）。

圖3 腹腔免疫組各組織器官組織學(xué)特征（400×）Fig.3 Histologic characteristics of different organs in chickens of immune group injected intra-abdominally with vaccine strain，CVI988/Rispens（400×）

3 討論

研究表明，腺胃、肝臟在接種馬立克病毒15d出現(xiàn)單核淋巴細(xì)胞浸潤與Payne和Rennie結(jié)果一致［11］。在脾臟、胸腺和法氏囊15d時(shí)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少，與刁秀國等［12-13］報(bào)道的1周出現(xiàn)單核淋巴細(xì)胞浸潤、胸腺和法氏囊出現(xiàn)特征性病變，淋巴細(xì)胞流失有偏差，Buscaglia C等也發(fā)現(xiàn)感染后3～6d細(xì)胞溶解，認(rèn)為MDV強(qiáng)毒感染雞體后侵入淋巴器官，引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞溶解，活化的T淋巴細(xì)胞也發(fā)生溶細(xì)胞現(xiàn)象，胸腺和法氏囊在6d～8d出現(xiàn)萎縮性病變［14］。這一結(jié)果在時(shí)間上存在差異，可能與毒株不同有關(guān)，該病特征性病變即各器官的增生細(xì)胞中出現(xiàn)馬立克細(xì)胞。攻毒組中雞肝臟、腎臟、腺胃、胰腺等內(nèi)臟器官的變化，使機(jī)體正常生理功能發(fā)生紊亂，這可能是雞只死亡的主要原因。

免疫組雞接種疫苗后，脾臟變化較胸腺和法氏囊要迅速、持久，與對(duì)照組相比有明顯差異，這與李爵等的研究結(jié)果相一致［4］。胸腺組織學(xué)變化與MDV在后期主要引起細(xì)胞免疫有關(guān)，本研究另一結(jié)果表明，CVI988疫苗接種第3天產(chǎn)生體液免疫效應(yīng)，10d后細(xì)胞免疫效應(yīng)高于對(duì)照組，即早期免疫效果主要靠體液免疫［15-16］，這充分印證了這一點(diǎn)，說明CVI988疫苗具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)效應(yīng)。但脾臟、法氏囊和胸腺出現(xiàn)類似攻毒組的病理變化，表明疫苗除具保護(hù)作用外，還存在一定的毒力。

另外，疫苗免疫組除免疫器官外，肝臟等組織都出現(xiàn)了不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤，與攻毒組變化相似，說明疫苗的毒力和強(qiáng)毒一樣對(duì)機(jī)體的非免疫器官也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。

綜上所述，CVI988疫苗不僅具有免疫保護(hù)作用，而且也具有與強(qiáng)毒類似的毒力，可能對(duì)雞的生長和免疫產(chǎn)生一定的影響。馬立克病疫苗的毒力作用如何減弱或消除，研制無毒力且又免疫力強(qiáng)的馬立克病疫苗，提高預(yù)防和控制雞馬立克病，以提高疫苗免疫效力還需要做進(jìn)一步深入研究。

［1］蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：313.

［2］呂天星，王 穎，田文霞，等.雞抗馬立克氏病毒免疫應(yīng)答機(jī)制研究［J］.中國家禽，2012，34（10）：1-6.

［3］韋 平.馬立克氏病研究的最新動(dòng)態(tài)—第八屆國際馬立克氏病研討會(huì)概況［J］.中國家禽，2008，30（17）：6-14.

［4］周 蛟.雞馬立克氏疫苗的研究與應(yīng)用［J］.獸醫(yī)導(dǎo)刊，2010，6：28-30.

［5］李 爵，史繼勝.雞馬立克氏病CV1988疫苗應(yīng)用效果觀察［J］.中國家禽，2004，26（4）：24-25.

［6］王宏偉，劉文琳，孔慶娟，等.雞馬立克氏病疫苗免疫機(jī)理及其發(fā)展概況［J］.中國家禽，2005，27（1）：50-51.

［7］谷成龍，黃世純.雞馬立克氏病免疫失敗的案例分析及防治措施［J］.中國動(dòng)物保健，2009（2）：74-75.

［8］李晶梅，劉長軍，張艷萍，等.雞馬立克氏病病毒在雞淋巴細(xì)胞和羽髓中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30（11）：779-884.

［9］Tian W X，Sun N，Ning G B，et al.Effects of gallid herpes virus 2Marek＇s disease challenge virus and atteunated vaccine virus CVI988/rispens on immune adhesion of erythrocytes of chickens［J］.Int J Poul Sci，2013，12（4）：217-223.

［10］田文霞，王 穎，劉紅霞，等.馬立克病雞血清生化指標(biāo)的檢測與分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（8）：127-130.

［11］Payne L N，Rennie M.Pathogenesis of Marek＇s disease in chicks with and without materal antibody［J］.Journal of the National Cancer Institute，1973，51：1559-1573.

［12］刁秀國，朱 國，王桂花，等.肉種雞馬立克氏病的動(dòng)態(tài)病理組織學(xué)研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，20：795-799.

［13］葛晨霞，董曉慶，王微微，等.蛋種雞馬立克氏病的病理學(xué)診斷［J］.吉林畜牧獸醫(yī)，2010，31（8）：25-26.

［14］Buscaglia C，Calnek B W，Schat K A.Effect of immunocompetence on the establishment and maintenance of latency with Marek＇s disease herpesvirus［J］.J Gen Virol，1988，69：1067-1077.

［15］張丹瑾，馮 嬌，田文霞，等.馬立克病強(qiáng)毒株及CVI988疫苗株對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞功能的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（7）：76-78.

［16］王會(huì)妙，田文霞，寧官保，等.雞馬立克病CVI988疫苗不同免疫部位對(duì)免疫效果的影響［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（3）：126-128.